基于CRISPR／ Cas9 的毛果杨bHLH106 转录因子的功能研究

第４５卷㊀第６期２０２１年１１月
南京林业大学学报（自然科学版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２０２１
ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２１０７０３１
㊀收稿日期Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０２１⁃０７⁃２０㊀㊀㊀㊀修回日期Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０２１⁃０８⁃２５
㊀基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（３２００１３３２）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（２５７２０１８ＣＬ０１）㊂
㊀第一作者：孙佳彤（ｓｕｎｊｔｔ８９＠１６３．ｃｏｍ）㊂∗通信作者：周晨光（ｚｈｏｕｃｈｅｎｇｕａｎｇ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ），讲师，负责实验指导与论文修改，ＯＲＣＩＤ
（００００－０００１－６４１４－４６９３）；李伟（ｗｅｉｌｉ２０１５＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ），教授，负责选题与实验方案确定，ＯＲＣＩＤ（００００－０００２－４４０７－９３３４）㊂
㊀引文格式：孙佳彤，国艳娇，李爽，等．基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学
版），２０２１，４５（６）：１５－２３．ＳＵＮＪＴ，ＧＵＯＹＪ，ＬＩＳ，ｅｔａｌ．ＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｂＨＬＨ１０６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂａｓｅｄｏｎＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ），２０２１，４５（６）：１５－２３．ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２１０７０３１．
基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６
转录因子的功能研究
孙佳彤，国艳娇，李㊀爽，周晨光∗，姜立泉，李㊀伟∗
（林木遗传育种国家重点实验室（东北林业大学），黑龙江㊀哈尔滨㊀１５００４０）
摘要：ʌ目的ɔ采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑系统创制毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ｂＨＬＨ１０６（ＢａｓｉｃＨｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－
Ｈｅｌｉｘ１０６）基因的突变体，分析植株的表型特征，初步揭示ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因在毛果杨木材形成过程中的功能㊂ʌ方法ɔ基于前期对毛果杨野生型（ＷＴ）茎干的不同细胞类型（形成层㊁木质部和韧皮部细胞）ＲＮＡ－ｓｅｑ数据，克隆得到一个在形成层及木质部较高表达的ｂＨＬＨ基因ＰｔｒｂＨＬＨ１０６㊂采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术创制毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的功能缺失突变体㊂对生长６０㊁９０㊁１２０ｄ的毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体和ＷＴ植株进行表型观察；对生长１２０ｄ的植株各茎节进行石蜡切片，利用甲苯胺蓝染色观察并进行细胞统计分析㊂ʌ结果ɔ获得毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体；与ＷＴ相比，突变体植株的株高㊁地径无明显差异；在整个测量的生长周期中，第８茎节长度有缩短的趋势，茎节数量有增加的趋势；形成层细胞层数有增加的趋势但差异不显著，导管细胞孔径显著增大，纤维细胞数量显著减少㊂ʌ结论ɔｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体与ＷＴ植株在导管孔径和纤维细胞数量上存在差异，初步证明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因参与了调控毛果杨次生木质部的发育
㊂
关键词：毛果杨；次生木质部发育；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑；ＰｔｒｂＨＬＨ１０６转录因子中图分类号：Ｓ７９２．１１；Ｑ９４３．２㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
文章编号：１０００－２００６（２０２１）０６－００１５－０９
ＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｂＨＬＨ１０６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂａｓｅｄｏｎ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
ＳＵＮＪｉａｔｏｎｇ，ＧＵＯＹａｎｊｉａｏ，ＬＩＳｈｕａｎｇ，ＺＨＯＵＣｈｅｎｇｕａｎｇ∗，ＣＨＩＡＮＧＶｉｎｃｅｎｔ，ＬＩＷｅｉ∗
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ʌＯｂｊｅｃｔｉｖｅɔＷｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＣＲＩＳＰＲ⁃ｂａｓｅｄｍｕｔａｎｔｓｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．ʌＭｅｔｈｏｄɔＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓＲＮＡ⁃ｓｅｑｄａｔａｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｅｌｌｔｙｐｅｓ（ｃａｍｂｉｕｍ，ｘｙｌｅｍａｎｄｐｈｌｏｅｍｃｅｌｌｓ）ｏｆＰ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ，ｗｅｃｌｏｎｅｄａｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＰｔｒｂＨＬＨ１０６，ｗｈｉｃｈｉｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃａｍｂｉｕｍａｎｄｘｙｌｅｍ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｏｆｐｔｒｂｈｌｈ１０６ａｎｄｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ（ＷＴ）ｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｎｆｏｒ６０，９０ａｎｄ１２０ｄｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．Ｐａｒａｆｆｉｎｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｓｔｅｍｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｏｆｐｔｒｂｈｌｈ１０６ａｎｄＷＴｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｎｆｏｒ１２０ｄａｙｓｗｅｒｅｃｒｅａｔｅｄ，ａｎｄｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｆｏｒ
ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗｏｏｄｃｅｌｌｓ．ʌＲｅｓｕｌｔɔＰｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔａｎｄｇｒｏｕｎｄｄｉａｍｅｔｅｒ．ＣｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｉｎＷＴｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｌｅｎｇｔｈｏｆ８ｔｈｓｔｅｍｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｓｔｅｍｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｌａｙｅｒｏｆｃａｍｂｉｕｍｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｍｕｔａｎｔｓ．
Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅａｂｏｖｅｉｎｄｅｘｅｓｗｅｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｕｍｅｎａｒｅａｏｆｐｅｒｖｅｓｓｅｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｆｉｂｅｒｃｅｌｌｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｐｔｒｂｈｌｈ１０６．ʌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎɔＴｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｍｕｔａｎｔｓａｎｄＷＴｐｌａｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
. All Rights Reserved.
南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷ｉｎＰ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍ；ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ
㊀㊀木材形成机制研究一直是林木研究的重点㊂木材的形成是一个高度有序且连续的过程，包括维管形成层的增殖㊁木质部细胞的分化扩张㊁次生细胞壁的沉积增厚㊁细胞的程序性死亡［１－２］㊂次生木质部包括纤维细胞㊁导管细胞和射线细胞［３］㊂已经从模式植物中鉴定出许多参与次生木质部发育的转录因子，它们形成转录调控网络用以调控木材的形成过程［４－６］㊂因此，探究转录因子在木材形成过程中的作用机制，可为利用林木分子生物学手段改良木材性状，提高木材质量提供理论依据㊂ｂＨＬＨ（ＢａｓｉｃＨｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ）是一类碱性螺旋－环－螺旋类转录调控因子，主要存在于真核生物中，是仅次于ＭＹＢ的第２大转录因子家族㊂在植物中，ｂＨＬＨ转录因子家族对植物的调控发育㊁胁迫响应㊁信号传导和次生生长方面起着重要作用［７－８］㊂大多数ｂＨＬＨ蛋白是在模式植物拟南芥中被发现和鉴定的，其功能包括：参与调节信号传导合成代谢途径，如植物激素的合成㊁光信号传导［９－１０］㊁光敏信号的调节［１１－１２］㊁脱落酸信号传导［１３］；参与植物的生长发育，如种子的萌发；调控植物抗逆胁迫，如低温胁迫［１４］㊁盐胁迫［１５］等㊂此外，ｂＨＬＨ基因家族同样参与木质部的生长发育，例如一个非典型的ｂＨＬＨ转录因子调节生长素下游的早期木质部发育［１６］；棉花ｂＨＬＨ蛋白ＧｈＦＰ１正向调节纤维细胞的伸长［１７］；在拟南芥次生细胞壁的相关转录组数据中，识别到了一些ｂＨＬＨ转录因子调控次生细胞壁的合成［１８］；在一项研究中确定一个ｂＨＬＨ转录因子二聚体ＴＭＯ５／ＬＨＷ是拟南芥中维管发育的关键调节因子［１９］，其缺失突变体中维管组织逐渐消失；ｂＨＬＨ转录因子ＬＨＷ－Ｔ５Ｌ１二聚体促进木质部前体细胞中关键细胞分裂素基因的表达，导致周围细胞中细胞分裂素水平升高，从而促进原形成层细胞的特异性增殖［２０］㊂然而，ｂＨＬＨ转录因子参与林木木材形成还鲜见报道㊂
基因编辑工具的出现，为基因功能的研究和植物性状的改良带来了很大的帮助［２１］㊂ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅ⁃ｐｅａｔｓ）基因编辑技术在很大程度上提高了基因编辑的效率和实用性㊂目前，该技术已被广泛应用于基础科学㊁人类疾病治疗㊁作物基因功能及遗传育种等领域的研究中［２２］㊂ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统共包含了两个部分：向导ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）和Ｃａｓ９核酸酶，该系统的主要功能是在特定的基因组位点诱导ＤＮＡ双链的断裂［２３］㊂双链断裂之后非同源末端连接的细胞修复可能导致碱基的插入或缺失［２４］，从而改
变碱基序列㊂利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术可以对全基因组的任何一个基因进行基因编辑，可通过ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统获得产量㊁品质和抗性都更高的优良品种［２５］㊂例如通过ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术编辑马铃薯Ｒ基因得到抗病马铃薯品系［２６］；以ＣＲＩＳＰＲ介导ＣＣＲ的基因编辑技术获得了低木质素的新杨树优良品系［２７］㊂自２０１５年首次将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用于杨树中以来［２８］，已有许多将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用于树木的基因功能研究㊂例如，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术创制毛果杨ＰｔｒＶＣＳ２基因突变体，通过对突变体植株的分析发现ＰｔｒＶＣＳ２促进形成层向木质部分化，使植株提前产生增厚的次生细胞壁，表明毛果杨ＰｔｒＶＣＳ２参与木材形成的调控［２９］；利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术得到毛果杨形成层特异表达的ＰｔｒＷＯＸ４转录因子功能缺失突变体，使植株顶端优势被破坏，顶芽和根部发育不良，形成层发育受到显著影响，木质部分化紊乱［３０］㊂
本研究通过分析东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室姜立泉团队前期对野生型（ＷＴ）毛果杨茎干不同细胞类型进行的ＲＮＡ－ｓｅｑ数据分析，鉴定出一个在形成层和次生木质部细胞中较高表达的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统创制了毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因功能缺失突变体㊂通过对突变体的表型观察及分析，初步揭示该基因在木材形成方面的功能㊂
１㊀材料与方法
１．１㊀实验材料、载体及试剂
实验材料为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室（本实验室）保存的毛果杨植株，基因型为Ｎｉｓｑｕａｌｌｙ－１㊂用次氯酸钠（ＮａＣｌＯ）对野生型毛果杨侧枝进行消毒后，经植物组织培养进行芽诱导，获得无菌毛果杨组培苗㊂组织培养条件：温度２５ħ，光强约４０μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ），光周期为１６ｈ光照／８ｈ黑暗㊂温室培养条件：温度范围２２ ２５ħ，光强约３００μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ），光周期为１６ｈ光照／８ｈ黑暗㊂温室种植毛果杨使用１３５ħ高温高压灭
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㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究
菌３０ｍｉｎ后冷却的土壤㊂
ｐＥＮＴＲ载体（ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ｔｏｐｏ）购自ＬｉｆｅＩｎ⁃ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｔ载体（ｐＭＤ１８－Ｔ）购自ＴａＫａＲａ；ｐＵＣ１９－ＧＦＰ载体为本实验室保存；ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ由ＫｅｉｓｈｉＯｓａｋａｂｅ实验室惠赠㊂ＲＮＡ试剂盒（ＲＮｅａｓｅｐｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ）㊁胶回收试剂盒（ＧＥＬＥｘ⁃ｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）㊁ＰＣＲ纯化试剂盒（ＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ）㊁质粒提取试剂盒（Ｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｋｉｔ）均购自ＱＩＡＧＥＮ公司；反转录试剂盒（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ）购自ＴＡＫＡＲＡ；Ｐｆｕ聚合酶（ＰｆｕＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ）购自Ａｇｌｉｅｎｔ公司；体外转录试剂盒（Ｔ７ｑｕｉｃｋｈｉｇｈｙｉｅｌｄＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ）购自ＮＥＢ；
甲苯胺蓝染色剂购自Ｓｉｇｍａ；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０感受态细胞㊁根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１感受态细胞均为本实验室保存㊂
１．２㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的克隆与分析根据
ＰｔｒｂＨＬＨ１０６
基因的
ＩＤ（Ｐｏｔｒｉ．
００６Ｇ０３７１００），在毛果杨基因组网站（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｈｙ⁃
ｔｏｚｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｐｚ／ｐｏｒｔａｌ．ｈｔｍｌ）下载基因序列，设计特异性引物（表１）㊂使用ＲＮＡ提取试剂盒对毛果杨的分化木质部总ＲＮＡ进行提取，使用反转录试剂盒进行反转录后得到的ｃＤＮＡ作为ＰＣＲ扩增模板，对目的基因进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系：１０ˑＰｆｕＢｕｆｆｅｒ２μＬ㊁ｄＮＴＰｓ２μＬ㊁ｃＤＮＡ模板１μＬ㊁正反向引物各１μＬ㊁ＰｆｕＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．４
μＬ㊁去离子水１２．６μＬ，反应体系为２０μＬ㊂ＰＣＲ反应程序：９４ħ预变性２ｍｉｎ；９４ħ变性４５ｓ，５２ħ退火３０ｓ，６８ħ延伸３０ｓ，３０个循环；６８ħ再延伸３０ｍｉｎ㊂ＰＣＲ扩增获得该基因片段，并连接到
ｐＥＮＴＲ载体上，经热激法大肠杆菌转化后，获得阳性克隆，测序检测ＰｔｒｂＨＬＨ１０６序列㊂
表１㊀所用引物及序列
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｌｉｓｔｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
引物名称ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ
引物序列ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
用途ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｆ５ᶄ－ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧ－３ᶄ
Ｒ５ᶄ－ＣＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴ－３ᶄ
ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因克隆
ｃｌｏｎｉｎｇｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇｅｎｅ
Ｔ７－ｂＨＬＨ１０６⁃ｓｔｅｍ⁃ｌｏｏｐ５ᶄ－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＡＧＡＡＡＣ
ＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧ－３ᶄ体外检测的ｇＲＮＡ转录模板
ｇＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｄｅ⁃ｔｅｃｔｉｏｎ
ｐＵＣ１９－Ｆ５ᶄ－ＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＴＣ－３ᶄｐＵＣ１９－Ｒ
５ᶄ－ＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＧ－３ᶄ
体外检测中的模板ＤＮＡ
ｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｇＲＮＡ－Ｆ５ᶄ－ＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＡＧＡＡＡＣ－３ᶄｇＲＮＡ－Ｒ５ᶄ－ＧＴＴＴＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＡＡ－３ᶄｐＥｇＰ２３７载体构建，Ｒ端引物亦用于转基因植株鉴定
ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＥｇＰ２３７，ｇＲＮＡ－ＲａｌｓｏｆｏｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＭ１３Ｆ
５ᶄ－ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ－３ᶄ转基因鉴定
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｔｒｂＨＬＨ１０６－Ｆ５ᶄ－ＡＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＣＴＴ－３ᶄＰｔｒｂＨＬＨ１０６－Ｒ５ᶄ－ＧＣＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴ－３ᶄ
靶位点编辑情况的鉴定ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ
１．３㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因ｇＲＮＡ选取及体外切割验证
㊀㊀使用在线工具（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／
ＣＲＩＳＰＲ２／）对ＰｔｒｂＨＬＨ１０６进行ｇＲＮＡ的选取，选取ｇＲＮＡ的原则是分数高㊁脱靶概率低于０．５㊁ＧＣ含量在５０％左右，且定位在外显子上㊂在挑选好
的ｇＲＮＡ序列前加Ｔ７启动子（５ᶄ－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ⁃ＣＡＣＴＡＴＡＧＧ－３ᶄ），后加ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（５ᶄ－ＧＴＴＴＡ⁃ＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧ－３ᶄ），该序列作为ｇＲＮＡ的体外转录模板序列，用于ｇＲＮＡ的体外切割验证㊂
将ｇＲＮＡ体外转录模板序列经ＰＣＲ反应生成双链ＤＮＡ㊂ＰＣＲ反应体系为：Ｔ７－ｂＨＬＨ１０６－ｓｔｅｍ－
ｌｏｏｐ（０．５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ㊁ＢＳ６（０．５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ㊁Ｔ２５（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μＬ㊁ＢＳ７（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μＬ㊁ｄＮＴＰＭｉｘ１μＬ㊁１０ˑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μＬ㊁ｒＴａｑ１μＬ㊁去离子水２９μＬ，共５０μＬ㊂ＰＣＲ反应程序：９５ħ
１ｍｉｎ；９５ħ１０ｓ，５９ħ１０ｓ，７２ħ１０ｓ，４５个循环；７２ħ，３０ｓ㊂
ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因ｇＲＮＡ的体外转录：利用体外转录试剂盒对ｇＲＮＡ进行体外转录，反应体系为：ＮＴＰＢｕｆｆｅｒＭｉｘ７．５μＬ㊁Ｎｕｃｌｅａｓｅ⁃ｆｒｅｅｗａｔｅｒ３７
１. All Rights Reserved.
南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷
μＬ㊁ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ８μＬ㊁Ｔ７ＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．５μＬ，共２０μＬ㊂置于３７ħ恒温水浴锅中４ｈ㊂模板载体的构建及模板质粒线性化：依据毛果杨网站提供的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因全基因组的序列信息及ｐＵＣ１９－３５Ｓ－ＧＦＰ载体上所含有的酶切位点，在ｇＲＮＡ前后共１ｋｂ位置设计带有酶切位点的特异性引物（表１）㊂ＰＣＲ模板为野生型的全基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增后对目标片段的胶回收产物和ｐＵＣ１９－３５Ｓ－ＧＦＰ质粒分别同时进行ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ双酶切，Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行连接，将连接产物利用热激法转化到ＴＯＰ１０大肠杆菌中，筛选阳性单克隆进行测序验证㊂测序正确的单克隆进行质粒的提取，使用ＰｓｔⅠ进行模板质粒ｐＵＣ１９－Ｐｔｒ⁃ｂＨＬＨ１０６的线性化，酶切产物纯化后获得线性化的体外切割模板ＤＮＡ㊂
体外检测ｇＲＮＡ切割结果：检测体系为Ｃａｓ９蛋白（１ｍｇ／ｍＬ，本实验室前期纯化获得）２μＬ㊁ｇＲＮＡ２μＬ㊁线性化的ＤＮＡ模板１２μＬ㊁Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）０．８μＬ㊁ＤＴＴ０．０２μＬ㊁ＭｇＣｌ２１μＬ㊁ＰＢＳ２．１８μＬ㊂置于３７ħ恒温水浴锅１ｈ，１ｈ后迅速放入液氮中，随后用ＰＣＲ纯化试剂盒进行产物纯化，经琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果㊂１．４㊀ＣＲＩＳＰＲ基因编辑载体的构建
设计经体外验证的ｇＲＮＡ引物（表１），对ｇＲＮＡ进行引物复性㊂反应体系为：１０ˑＥＸ－ＴａｑＢｕｆｆｅｒ２μＬ㊁ｇＲＮＡ－Ｆ９μＬ㊁ｇＲＮＡ－Ｒ９μＬ，共２０μＬ㊂ＰＣＲ反应程序如下：９５ħ３０ｓ；７２ħ２ｍｉｎ；３７ħ２ｍｉｎ；２５ħ２ｍｉｎ㊂ＰＣＲ产物稀释１００倍待用㊂载体ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ经ＢｓａⅠ单酶切，与ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的ｇＲＮＡ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，将连接产物利用热激法转化到ＴＯＰ１０大肠杆菌中，筛选阳性单克隆进行测序验证，随后将阳性质粒ｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９转入ＧＶ３１０１农杆菌中，用于毛果杨的遗传转化㊂１．５㊀毛果杨遗传转化及转基因植株的鉴定毛果杨遗传转化采用已建立的农杆菌介导法［３１－３２］，选择生长３０ｄ左右的健康毛果杨无菌组培苗，株高１０ １２ｃｍ，切下第２ ３节茎段，用农杆菌侵染２０ｍｉｎ后放置暗处共培养４８ｈ；暗培养结束后，用含有２５０ｍｇ／Ｌ头孢霉素的无菌水浸泡清洗茎段，随后移至含有２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素和２５０ｍｇ／Ｌ头孢霉素的选择培养基上，培养２５ ３０ｄ后，将抗性芽移至含有２０ｍｇ／Ｌ卡那霉素和１２５ｍｇ／Ｌ头孢霉素的抗性芽生根培养基中㊂待植株生根后，剪下转基因植株的叶片并提取全基因组ＤＮＡ，用ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ上的Ｆ端引物Ｍ１３Ｆ（表１）和ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因ｇＲＮＡ的Ｒ端引物（表１）进行ＰＣＲ扩增鉴定㊂
１．６㊀转基因植株ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因编辑情况鉴定㊀㊀参照毛果杨ＤＮＡ序列，在包含ｇＲＮＡ位点的上下游共５００ｂｐ处设计引物，以转基因植株ＤＮＡ为扩增模板，扩增目的片段ＤＮＡ，加Ａ尾后连接到Ｔ载体上，用热激法转化到ＴＯＰ１０大肠杆菌中，每个植株挑取３０个阳性单克隆进行测序，与野生型序列进行比对㊂
１．７㊀毛果杨表型分析及茎的横切面解剖观察分别在ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体和野生型毛果杨生长６０㊁９０和１２０ｄ时对其进行株高㊁地径测量，每个基因型取３株，重复３次测量㊂在ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体和野生型毛果杨生长１２０ｄ时，分别取第２㊁４㊁６㊁８㊁１０茎节制作石蜡切片，利用甲苯胺蓝对切片进行染色，在Ｍ８数字扫描显微成像系统（Ｐｒｅｃｉｐｏｉｎｔ）下观察横切面细胞形态㊂
１．８㊀测序及数据分析
测序服务及全部引物的合成均由吉林省库美生物科技有限公司完成（ｗｗｗ．ｃｏｍａｔｅｂｉｏ．ｃｏｍ）㊂利用ＳＰＳＳ软件中的独立样本ｔ检验法对各生长指标及细胞数进行差异显著性分析，当Ｐ＜０．０５时，表示差异显著，当Ｐ＜０．０１时差异极显著㊂用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０软件进行制图㊂
２㊀结果与分析
２．１㊀ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的获得
研究团队前期通过激光显微切割技术（ｌａｓｅｒｃａｐｔｕｒｅｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ，ＬＣＭ），分别精确收集了毛果杨野生型植株第８茎节的形成层㊁木质部和韧皮部细胞，对其进行ＲＮＡ－ｓｅｑ数据分析，结果发现ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因主要在形成层和木质部细胞中表达（图１），因此推测ＰｔｒｂＨＬＨ１０６可能在形成层和木质部发育中发挥一定的调控作用㊂通过对Ｐｔｒ⁃ｂＨＬＨ１０６的克隆及测序，获得７２３ｂｐ的ＣＤＳ序列㊂
２．２㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因突变体的创制为了进一步研究ＰｔｒｂＨＬＨ１０６在木材形成过程中的功能，采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术创制了毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因功能缺失突变体㊂在突变体创制前，利用体外切割技术对选取的ｇＲＮＡ进行了验证，以便确定ｇＲＮＡ的可用性㊂
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㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６
转录因子的功能研究
标准化ＦＰＫＭ值即转录本丰度标准化为每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数，误差线代表３个生物学重复的标准误㊂ＮｏｒｍａｌｉｚｅｄＦＰＫＭｉｎｄｉｃａｔｅｓｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｂｕｎｄａｎｃｅｓａｓｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｍｏｄｅｌｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＥｒｒｏｒｂａｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＳＥｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
图１㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因在不同组织细胞类型中
的表达
Ｆｉｇ．１㊀ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｔｙｐｅｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
２．２．１㊀ｇＲＮＡ的体外验证
通过ｇＲＮＡ网站预测，选取１条分数高㊁脱靶
概率低㊁ＧＣ含量在５０％左右的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６外显子上ｇＲＮＡ，切割的模板示意图如图２Ａ所示，ｇＲＮＡ位于线性化ＤＮＡ模板的－９５２ｂｐ处㊂经过体外切割，琼脂糖凝胶电泳结果如图２Ｂ所示，在不加入ｇＲＮＡ或Ｃａｓ９蛋白时，装有ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基
因片段的模板ＤＮＡ均未被切断（第１和２号泳道），在加入ｇＲＮＡ㊁Ｃａｓ９蛋白和模板ＤＮＡ后，ＤＮＡ被有效切成２段，电泳条带在约４．５ｋｂ和０．９ｋｂ处（第３泳道），与理论长度相符㊂该结果说明，选用的ｇＲＮＡ序列可有效结合Ｃａｓ９蛋白，并对靶位点
进行切割，可用于后续实验
㊂
Ａ．模板ＤＮＡ示意图ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ；Ｂ．凝胶电泳结果ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓ（Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ１００００；１㊁
２．对照组ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；３．检测样品ｓａｍｐｌｅ）㊂
图
２㊀ｇＲＮＡ体外验证
Ｆｉｇ．２㊀ＴｈｅｃｌｅａｖａｇｅａｓｓａｙｉｎｖｉｔｒｏｏｆｇＲＮＡ
２．２．２㊀
毛果杨遗传转化及转基因植株鉴定
构建
ＣＲＩＳＰＲ
载体ｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６
ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９，通过农杆菌侵染㊁抗性愈伤组织
出芽㊁抗性芽在卡那霉素培养基上两次生根筛选过程（图３Ａ ３Ｃ），获得３株抗性生根植株㊂提取待鉴定的抗性植株叶片基因组ＤＮＡ，使用载体引物Ｍ１３－Ｆ和ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的ｇＲＮＡ－Ｒ端引物进行ＰＣＲ扩增，鉴定结果如图３Ｄ所示，两个阴性对照（第１和３泳道）均未扩增出片段条带，而抗性植株（第４ ６泳道）均扩增出与阳性对照（第２泳道）相同大小的条带，说明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６重组质粒已经成功整合到毛果杨基因组中㊂
Ａ．愈伤组织分化诱导ｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｂ．抗性芽诱导ｓｈｏｏｔｉｎ⁃
ｄｕｃｔｉｏｎ；Ｃ．抗性植株筛选ｓｃｒｅａｎｉｎｇｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓ；Ｄ．转基
因植株的ＰＣＲ鉴定ｔｈｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ（Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００㊂１．ｄｄＨ２Ｏ为模板的阴性对照ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｄｄＨ２ＯａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ；２．ｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９质粒为模板的阳性对照ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９ａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ；
３．野生型毛果杨叶片ＤＮＡ为模板的阴性对照ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｌｅａｆＤＮＡｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｐｌａｎｔａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ；４ ６．抗性植株叶片ＤＮＡ为模板的样品ｓａｍｐｌｅｗｉｔｈｌｅａｆＤＮＡｏｆｋａｎａｍｙｃｉｎ⁃ｒｅ⁃ｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ）㊂
图３㊀毛果杨转基因植株的获得
Ｆｉｇ．３㊀ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
２．２．３㊀ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因编辑情况分析
对转基因植株的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因靶位点的编
辑情况进行测序鉴定，结果如图４Ａ所示：３个株系
的突变体ｇＲＮＡ处均插入或缺失不同数量的碱基，
如ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－１的两条等位基因分别插入１个碱基和缺失２个碱基，ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－２的两条等位基因分别插入１个碱基和缺失３个碱基，ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－３的两条等位基因分别插入１个碱基和缺失１６个碱基㊂３个突变体植株均为双等位突变㊂编辑ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因后的蛋白翻译情况如图４Ｂ，部分碱基的插入和缺失后，导致翻译提前终止，产生的
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南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷
氨基酸序列远短于正常的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６，ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－２的１条等位基因缺失了１个氨基酸同时造成１个氨基酸的改变，其他基因序列的翻译序列均未包含ｂＨＬＨ家族的典型ＨＬＨ结构域［１８］㊂
该结果表明，已成功获得毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体㊂为验证ＰｔｒｂＨＬＨ１０６转录因子的功能，选取突变体植株ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－２㊁ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－３进行后续研究
㊂
Ａ．等位基因编辑情况（红色字母表示碱基插入，红色 － 表示碱基缺失， －１６ｂｐ－ 表示缺失１６个碱基）ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｌｌｅｌｅｓ（Ｔｈｅｒｅｄｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｓｅｒｔｉｏｎ；ｔｈｅｒｅｄｓｈｏｒｔｌｉｎｅｓ － ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｄｅｌｅｔｉｏｎ； －１６ｂｐ－ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ１６ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｅｌｅｔｉｏｎ）；Ｂ．被编辑基因的蛋白翻译情况预测（红色块区域代表氨基酸改变）ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｅｄｓｈｏｒｔｌｉｎｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｍｉｎｏａｃｉｄｃｈａｎｇｅｄ）㊂
图４㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因编辑情况
Ｆｉｇ．４㊀ＧｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇｅｎｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓ
ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
误差线代表由３个生物学重复计算的标准误，∗表示通过ｔ检验，突变体与野生型植物各株系之间存在显著差异，∗．Ｐ＜０．０５，∗∗．Ｐ＜０ ０１）㊂下同㊂Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｒｏｗｔｈｉｎｄｅｘｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ（ＷＴ）ａｎｄｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｐｌａｎｔｓ．ＥｒｒｏｒｂａｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＳＥｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｅａｃｈｌｉｎｅｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｓａｎｄｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｐｌａｎｔｓｂｙＳｔｕｄｅｎｔ ｓｔｔｅｓｔ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．图５㊀毛果杨野生型与ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体表型分析
Ｆｉｇ．５㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＷＴａｎｄｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｍｕｔａｎｔｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
２．３㊀毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体的表型分析
对ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体植株进行无性扩繁后，与
高度相似的野生型毛果杨组培苗一起盆栽于温室
中，在植株自然生长６０㊁９０和１２０ｄ时进行表型观察（图５）㊂从生长过程来看，毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体与野生型相比，株高和地径没有明显差异㊂同
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㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究
时对茎节数以及第８茎节长度进行测定，统计结果表明，突变体植株在生长６０ｄ时的茎节数量显著大于野生型，随着植株生长时间的延长，茎节数有增加的趋势，但差异不显著；第８茎节的长度在植株生长６０和１２０ｄ时与ＷＴ差异显著，从植株生长周期来看，突变体植株第８茎节的长度有缩短的趋势㊂由以上结果初步推测，ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的功能缺失，对植株的生长未造成严重的影响㊂
为了进一步解析ＰｔｒｂＨＬＨ１０６在杨树木材形成过程中发挥的功能，通过石蜡切片对毛果杨ｂｈｌｈ１０６突变体的第２㊁４㊁６㊁８和１０茎节的横切面进行观察，结果显示突变体的各类型细胞的形态与野生型毛果杨无差异（图６Ａ）㊂对切片中单位面积的导管细胞㊁纤维细胞数量及单个导管细胞的孔径进行统计分析，结果（图６Ｃ和６Ｄ）表明，与野生型相比突变体植株的纤维细胞数量显著减少，导管细胞数量无明显差异，单个导管孔径显著增加㊂对形成层细胞进行观察分析，发现突变体植株的形成层层数有增加的趋势，但差异不显著（图６Ｂ和
６Ｅ）㊂以上结果表明，ＰｔｒｂＨＬＨ１０６转录因子的功能缺失，导致木质部纤维细胞数量减少，导管孔径增大，初步说明该转录因子在次生木质部发育过程中发挥了调控作用
㊂
Ａ．野生型（ＷＴ）和突变体（ｐｔｒｂｈｌｈ１０６）毛果杨各茎节细胞形态观察（比例尺为２００μｍ）ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆ
ｓｔｅｍｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｏｆＷＴａｎｄｐｔｒｂｈｌｈ１０６（Ｂａｒｓ＝２００μｍ）；Ｂ．形成层细胞形态观察（红色线表示形成层区域，比例尺为
１００μｍ）ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃａｍｂｉｕｍｃｅｌｌｓ（Ｒｅｄｌｉｎｅｓｈｏｗｅｄｃａｍｂｉｕｍａｒｅａｓ，Ｂａｒｓ＝１００μｍ）；Ｃ．单位面积细胞数
目统计ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｕｍｂｅｒｏｆｆｉｂｅｒａｎｄｖｅｓｓｅｌｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｕｎｉｔｃｅｌｌｓ；Ｄ．导管孔径面积统计ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｌｕｍｅｎａｒｅａｏｆｐｅｒｖｅｓｓｅｌ；Ｅ．形成层细胞层数统计ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｕｍｂｅｒｏｆｃａｍｂｉｕｍｃｅｌｌｌａｙｅｒ㊂
图６㊀毛果杨ｐｔｒｂｈｈ１０６突变体石蜡切片观察及细胞统计
Ｆｉｇ．６㊀Ｐａｒａｆｆｉｎｓｅｃｔｉｏｎｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃｅｌｌｓｉｎｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
３㊀讨㊀论
因树木生长周期长㊁遗传背景复杂㊁基因组信
息不完善等因素的制约，对树木的生长发育和环境
适应等方面的研究受到很多技术的限制，尤其是在
基因功能研究过程中，功能缺失突变体的创制异常
困难㊂然而ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术在２０１５
年首次用于杨树［２８］，就预示着树木突变体的创制
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南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷
不再是困扰科研人员的技术问题㊂应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统成功获得了一个毛果杨转录因子的功能缺失突变体，为研究该转录因子功能提供了重要的遗传材料㊂在研究中，为了更加高效地获得毛果杨突变体，应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统原理，开发了简易的体外切割实验，对选取的ｇＲＮＡ进行验证㊂实验结果也表明，经过验证的ｇＲＮＡ在毛果杨体内同样发挥着靶向高效性㊂该实验体系具有简便㊁耗时短㊁结果易观察等优点，但也存在ＤＮＡ模板单一的缺点，后续将对该体系进行进一步优化㊂
不同的载体系统随着ＣＲＩＳＰＲ系统在作物中的广泛应用应运而生，本研究使用的载体系统来自Ｏｓａｋａｂｅ研究团队［３３－３４］，该载体系统可成功应用于苹果㊁葡萄等木本植物中，也同样成功地应用到林木中［３２，３５］㊂本研究中获得的３株转基因毛果杨经测序鉴定，均为双等位突变体，说明该载体系统在毛果杨中具有很高的编辑效率㊂目前获得树木的单突变体已不再困难，但是获得树木的双突变体或多突变体，仍是对开发高效ＣＲＩＳＰＲ系统的挑战㊂树木的遗传背景复杂，生长周期长，获得完整㊁高质量基因注释的树种还较少，许多树种的遗传转化系统不完善，缺少针对树木开发的ＲＮＡ聚合酶Ⅲ类启动子，都是制约树木多突变体创制的因素㊂此外，基因的精准编辑如单碱基编辑已广泛应用于农作物中［３６］，而在树木中还未建立完善的碱基编辑系统㊂Ｌｉ等［３７］首次在杨树中成功利用碱基编辑器对木质素合成酶基因４ＣＬ进行单碱基突变，预示着ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统也将在树木中持续发挥其巨大的潜力㊂
木材形成是一个高度复杂的发育过程，涉及多类转录因子家族的参与和调控㊂从生物解剖学来看，木材是由次生木质部增厚的次生细胞壁形成的，而有关次生细胞壁的调控网络更是涉及多种转录因子，如ＮＡＣ㊁ＭＹＢ家族转录因子，分别在木质部纤维细胞㊁导管细胞的发育过程中起到分子开关㊁次级调控因子的作用［３８－３９］㊂除此之外，其他家族转录因子在木材形成调控网络中也直接或间接地调控木材形成相关基因的表达［６］㊂ｂＨＬＨ家族转录因子参与木质部的发育过程［１６－１８］，本研究的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６属于该家族成员，主要在毛果杨的形成层和木质部表达㊂ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑的突变体ｐｔｒｂｈｌｈ１０６在生长上并未受到影响，并且形成层的细胞层数有增加的趋势但变化不显著，说明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的功能缺失未对整个植株的生长和形成层细胞的分裂分化造成明显影响㊂值得注意的是，在选取突变体做后续实验时，其中１株突变体
的基因编辑结果并未造成ＰｔｒｂＨＬＨ１０６氨基酸序
列的较大变化，推测还保留该基因的功能㊂而两个
突变体的表型一致，综合两个突变体的基因编辑情
况和表型结果，说明可能是由于基因存在功能冗
余［３２］，单独敲除１个基因，往往不能对树木重要发育过程产生很大影响㊂这一推测将通过后续获得
多突变体等手段进行验证㊂
本研究在木材发育相关基因的功能研究中发
现，ｂＨＬＨ１０６基因在木材发育方面具有重要功能㊂毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体与野生型植株相比，虽然苗高生长和地径在统计学上没有显著的差别，但解剖视野中纤维细胞数量显著减少㊁导管孔径显著增大，形成层细胞层数增加，这说明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６在树木的木质部细胞发育和木材形成过程中，对调控径向生长量可能有重要的作用㊂在木本植物中，有关木质部发育的转录调控，与木材生物质累积和木质资源的生物产品转化高度相关［４０－４１］㊂ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因对木材细胞壁纤维细胞的数量㊁导管的孔径大小，以及形成层细胞层数的调控，可能对木质部的组分，如纤维素含量㊁木质素Ｓ／Ｇ比例㊁含量甚至结构产生影响，从而改变木材的理化性质及终产品的加工利用工艺和品质㊂这也是杨树木材材性遗传改良的重要发展方向和研究重点［４２－４３］㊂诚然，本研究虽然拓宽了ｂＨＬＨ转录因子的功能范围，但有关ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的更多功能及其分子调控机制还需要进一步深入探究㊂
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㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究
１８２－１８８．ＷＥＮＪ，ＷＡＮＧＣＴ，ＹＡＮＧＹＰ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｘｙｌｅｍｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｅｌｌｗａｌｌｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＪＳｏｕｔｈｗｅｓｔＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉ），２０２１，４１（２）：１８２－１８８．ＤＯＩ：１０．１１９２９／ｊ．ｓｗｆｕ．２０１９０９０７７．
［８］ＨＥＩＭＭＡ，ＪＡＫＯＢＹＭ，ＷＥＲＢＥＲＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ⁃ｌｏｏｐ⁃ｈｅｌｉｘｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｉｎｐｌａｎｔｓ：ａｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅｓｔｕｄｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ［Ｊ］．ＭｏｌＢｉｏｌＥｖｏｌ，２００３，２０（５）：７３５－７４７．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｇ０８８．［９］ＮＡＫＡＴＡＭ，ＭＩＴＳＵＤＡＮ，ＨＥＲＤＥＭ，ｅｔａｌ．ＡｂＨＬＨ⁃ｔｙｐｅｔｒａｎ⁃ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ａｂａ⁃ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＢＨＬＨ⁃ｔｙｐｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ／ＪＡ⁃ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＭＹＣ２⁃Ｌｉｋｅ１，ＡｃｔｓａｓａｒｅｐｒｅｓｓｏｒｔｏｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｊａｓｍｏｎａｔｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１３，２５（５）：１６４１－１６５６．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１１３．１１１１１２．
［１０］ＱＩＴ，ＨＵＡＮＧＨ，ＷＵＤ，ｅｔａｌ．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＥＬＬＡａｎｄＪＡＺｐｒｏ⁃ｔｅｉｎｓｂｉｎｄｔｈｅＷＤ⁃ｒｅｐｅａｔ／ｂＨＬＨ／ＭＹＢｃｏｍｐｌｅｘｔｏｍｏｄｕｌａｔｅｇｉｂ⁃ｂｅｒｅｌｌｉｎａｎｄｊａｓｍｏｎａｔｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｙｎｅｒｇｙ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１４，２６（３）：１１１８－１１３３．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１１３．１２１７３１．
［１１］ＮＩＭ，ＴＥＰＰＥＲＭＡＮＪＭ，ＱＵＡＩＬＰＨ．ＰＩＦ３，ａｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ⁃ｉｎｔｅｒ⁃ａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｎｏｒｍａｌｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｓａｎｏｖｅｌｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ⁃ｌｏｏｐ⁃ｈｅｌｉｘｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９８，９５（５）：６５７－６６７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｓ００９２－８６７４（００）８１６３６－０．［１２］ＨＵＱＥ，ＱＵＡＩＬＰＨ．ＰＩＦ４，ａｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ⁃ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｂＨＬＨｆａｃｔｏｒ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，２００２，２１（１０）：２４４１－２４５０．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／２１．１０．２４４１．
［１３］ＡＢＥＨ，ＵＲＡＯＴ，ＩＴＯＴ，ｅｔａｌ．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡｔＭＹＣ２（ｂＨＬＨ）ａｎｄＡｔＭＹＢ２（ＭＹＢ）ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００３，１５（１）：６３－７８．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．００６１３０．
［１４］ＷＡＮＧＹ，ＪＩＡＮＧＣＪ，ＬＩＹＹ，ｅｔａｌ．ＣｓＩＣＥ１ａｎｄＣｓＣＢＦ１：ｔｗｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｏｌｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ，２０１２，３１（１）：２７－３４．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２９９－０１１－１１３６－５．
［１５］ＡＨＭＡＤＡ，ＮＩＷＡＹ，ＧＯＴＯＳ，ｅｔａｌ．ｂＨＬＨ１０６ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｒＧ⁃ｂｏｘｔｏｃｏｎｆｅｒｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５，１０（５）：ｅ０１２６８７２．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２６８７２．
［１６］ＯＨＡＳＨＩ⁃ＩＴＯＫ，ＭＡＴＳＵＫＡＷＡＭ，ＦＵＫＵＤＡＨ．ＡｎａｔｙｐｉｃａｌｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｅｓｅａｒｌｙｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆａｕｘｉｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１３，５４（３）：３９８－４０５．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｐｃｐ／ｐｃｔ０１３．
［１７］ＬＩＵＺＨ，ＣＨＥＮＹ，ＷＡＮＧＮＮ，ｅｔａｌ．Ａｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ⁃ｌｏｏｐ⁃ｈｅｌｉｘｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｈＦＰ１）ｐｒｏｍｏｔｅｓｆｉｂｒｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆｃｏｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）ｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ［Ｊ］．ＮｅｗＰｈｙｔｏｌ，２０２０，２２５（６）：２４３９－２４５２．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｎｐｈ．１６３０１．
［１８］ＣＡＳＳＡＮ⁃ＷＡＮＧＨ，ＧＯＵÉＮ，ＳＡＩＤＩＭＮ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｅｌｌｗａｌｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｌａｎｔＳｃｉ，２０１３，４：１８９．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１３．００１８９．
［１９］ＤＥＲＹＢＥＬＢ，ＭÖＬＬＥＲＢ，ＹＯＳＨＩＤＡＳ，ｅｔａｌ．ＡｂＨＬＨｃｏｍｐｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌｓｅｍｂｒｙｏｎｉｃｖａｓｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｇｒｏｗｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＤｅｖＣｅｌｌ，２０１３，２４（４）：４２６－４３７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２０１２．１２．０１３．
［２０］ＯＨＡＳＨＩ⁃ＩＴＯＫ，ＳＡＥＧＵＳＡＭ，ＩＷＡＭＯＴＯＫ，ｅｔａｌ．ＡｂＨＬＨｃｏｍｐｌｅｘａｃｔｉｖａｔｅｓｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｖｉａｃｙｔｏｋｉｎｉｎａｃｔｉｏｎｉｎｒｏｏｔａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍ［Ｊ］．ＣｕｒｒＢｉｏｌ，２０１４，２４（１７）：２０５３－２０５８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１４．０７．０５０．
［２１］ＫＮＯＴＴＧＪ，ＤＯＵＤＮＡＪＡ．ＣＲＩＳＰＲ⁃Ｃａｓｇｕｉｄｅｓｔｈｅｆｕｔｕｒｅｏｆｇｅ⁃ｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１８，３６１（６４０５）：８６６－８６９．ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｔ５０１１．
［２２］林萌萌，李春娟，闫彩霞，等．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术在作
物中的应用［Ｊ］．核农学报，２０２１，３５（６）：１３２９－１３３９．ＬＩＮＭＭ，ＬＩＣＪ，ＹＡＮＣＸ，ｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉ⁃ｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｒｏｐｓ［Ｊ］．ＪＮｕｃｌＡｇｒｉｃＳｃｉ，２０２１，３５（６）：１３２９－１３３９．ＤＯＩ：１０．１１８６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００－８５５１．２０２１．０６．１３２９．［２３］ＪＩＮＥＫＭ，ＣＨＹＬＩＮＳＫＩＫ，ＦＯＮＦＡＲＡＩ，ｅｔａｌ．Ａｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ⁃ＲＮＡ⁃ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕ⁃ｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１．ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉ⁃ｅｎｃｅ．１２２５８２９．
［２４］ＢＯＲＴＥＳＩＬ，ＦＩＳＣＨＥＲＲ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｌａｎｔｇｅ⁃ｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇａｎｄｂｅｙｏｎｄ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ，２０１５，３３（１）：４１－５２．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈａｄｖ．２０１４．１２．００６．
［２５］ＺＡＦＡＲＳＡ，ＺＡＩＤＩＳＳ，ＧＡＢＡＹ，ｅｔａｌ．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｖｉａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ［Ｊ］．ＪＥｘｐ
Ｂｏｔ，２０２０，７１（２）：４７０－４７９．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｊｘｂ／ｅｒｚ４７６．［２６］ＫＩＥＵＮＰ，ＬＥＮＭＡＮＭ，ＷＡＮＧＥＳ，ｅｔａｌ．ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｃｏｎ⁃ｆｅｒｉｎｃｒｅａｓｅｄｌａｔｅｂｌｉｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｐｏｔａｔｏｅｓ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０２１，１１（１）：４４８７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２１－８３９７２－ｗ．
［２７］ＤＥＭＥＥＳＴＥＲＢ，ＭＡＤＡＲＩＡＧＡＣＡＬＤＥＲÓＮＢ，ＤＥＶＲＩＥＳＬ，ｅｔａｌ．ＴａｉｌｏｒｉｎｇｐｏｐｌａｒｌｉｇｎｉｎｗｉｔｈｏｕｔｙｉｅｌｄｐｅｎａｌｔｙｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇａｎｕｌｌａｎｄｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔＣＩＮＮＡＭＯＹＬ⁃ＣｏＡＲＥＤＵＣＴＡＳＥ２ａｌｌｅｌｅ［Ｊ］．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，２０２０，１１（１）：５０２０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１８８２２－ｗ．
［２８］ＦＡＮＤ，ＬＩＵＴ，ＬＩＣ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｔａｒ⁃ｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１５，５：１２２１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１２２１７．
［２９］林娇娇．毛果杨ＰｔｒＶＣＳ２基因在木材形成中的功能研究［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０２０．ＬＩＮＪＪ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｔｒＶＣＳ２ｇｅｎｅｉｎｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｄ］．Ｈａｒｂｉｎ：ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０２０．
［３０］毛昱力．毛果杨ＰｔｒＤＬＴ和ＰｔｒＷＯＸ４基因在维管形成层发育中
的功能解析［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０２０．ＭＡＯＹＬ．Ｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｔｒＤＬＴａｎｄＰｔｒＷＯＸ４ｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｖａｓｃｕｌａｒｃａｍｂｉｕｍｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｄ］．Ｈａｒｂｉｎ：ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０２０．
［３１］ＬＩＳ，ＺＨＥＮＣ，ＸＵＷ，ｅｔａｌ．Ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｏｒ⁃ｍａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅＮｉｓｑｕａｌｌｙ⁃１：ａｂａｓｉｃｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｓｅｑｕｅｎｃｅｄｍｏｄｅｌｔｒｅｅ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１７，７（１）：２６３８．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０２６５１－ｘ．
［３２］ＷＡＮＧＺＦ，ＭＡＯＹＬ，ＧＵＯＹＪ，ｅｔａｌ．ＭＹＢｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃ⁃ｔｏｒ１６１ｍｅｄｉａｔｅｓｆｅｅｄｂａｃｋｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｗａｌｌ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＮＡＣ：ｄｏｍａｉｎ１ｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｆｏｒｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０２０，１８４（３）：１３８９－１４０６．ＤＯＩ：１０．１１０４／ｐｐ．２０．０１０３３．［３３］ＯＳＡＫＡＢＥＹ，ＬＩＡＮＧＺ，ＲＥＮＣ，ｅｔａｌ．ＣＲＩＳＰＲ⁃Ｃａｓ９⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎａｐｐｌｅａｎｄｇｒａｐｅｖｉｎｅ［Ｊ］．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，２０１８，１３（１２）：２８４４－２８６３．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９６－０１８－００６７－９．［３４］ＮＩＳＨＩＴＡＮＩＣ，ＨＩＲＡＩＮ，ＫＯＭＯＲＩＳ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎａｐｐｌｅｕｓｉｎｇａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１６，６：３１４８１．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３１４８１．
［３５］ＬＩＳ，ＬＩＮＹＪ，ＷＡＮＧＰ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＡＲＥＢ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎ⁃ｆｌｕｅｎｃｅｓｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１９，３１（３）：６６３－６８６．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１８．００４３７．
［３６］ＺＨＵＨ，ＬＩＣ，ＧＡＯＣ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣＲＩＳＰＲ⁃Ｃａｓｉｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｌａｎｔｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０２０，２１（１１）：６６１－６７７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５８０－０２０－００２８８－９．［３７］ＬＩＧ，ＳＲＥＴＥＮＯＶＩＣＳ，ＥＩＳＥＮＳＴＥＩＮＥ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔＣ－ｔｏ－ＴａｎｄＡ－ｔｏ－ＧｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎａＰｏｐｕｌｕｓｈｙｂｒｉｄ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏ⁃ｔｅｃｈｎｏｌＪ，２０２１，１９（６）：１０８６－１０８８．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１３５８１．［３８］ＫＵＢＯＭ，ＵＤＡＧＡＷＡＭ，ＮＩＳＨＩＫＵＢＯＮ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｗｉｔｃｈｅｓｆｏｒｐｒｏｔｏｘｙｌｅｍａｎｄｍｅｔａｘｙｌｅｍｖｅｓｓｅｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００５，１９（１６）：１８５５－１８６０．ＤＯＩ：１０．１１０１／ｇａｄ．１３３１３０５．［３９］沈方圆，王岚春，李校．欧洲山杨ｂＨＬＨ转录因子家族全基因组分析［Ｊ］．四川大学学报（自然科学版），２０２１，５８（３）：１７９－１８７．ＳＨＥＮＦＹ，ＷＡＮＧＬＣ，ＬＩＸ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ［Ｊ］．ＪＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２０２１，５８（３）：１７９－１８７．ＤＯＩ：１０．１９９０７／ｊ．０４９０－６７５６．２０２１．０３６００３．
［４０］ＺＨＡＮＧＪ，ＸＩＥＭ，ＴＵＳＫＡＮＧＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｅｌｌｗａｌｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｌａｎｔＳｃｉ，２０１８，９：１５３５．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１８．０１５３５．
［４１］李少锋．林木木材形成机制及材性改良研究进展［Ｊ］．温带林
业研究，２０１９，２（２）：４０－４７．ＬＩＳＦ．Ｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｆｏｒｅｓｔｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＪＴｅｍｐＦｏｒＲｅｓ，２０１９，２（２）：４０－４７．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－４９００．２０１９．０２．００７．
［４２］ＺＯＢＥＬＢＪ，ＪＥＴＴＪＢ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｗｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｍ］．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９５．ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－７９５１４－５．［４３］康向阳．林木遗传育种研究进展［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２０２０，４４（３）：１－１０．ＫＡＮＧＸＹ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｆｏｒｅｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｔｒｅｅｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＪＮａｎｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２０２０，４４（３）：１－１０．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２００２０３３．
（责任编辑㊀吴祝华）
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