春萝卜雄性不育系4-05A小孢子败育的细胞学观察

春萝卜雄性不育系4-05A小孢子败育的细胞学观察
田如霞;武玲萱;崔贵梅
【摘要】为了确定其花粉败育的时期和细胞学特点,采用石蜡切片法,对春萝卜雄性不育系4-05A及其保持系4-05B小孢子发生和花粉发育过程进行观察、比较.结果表明:不育系和保持系小孢子母细胞都能正常进行减数分裂,四分体可以释放出小孢子,不育系4-05A败育发生在单核靠边期,解体后的绒毡层原生质团急剧而彻底地进入花粉囊,渗入花粉母细胞周围,并与花粉母细胞黏连在一起.
【期刊名称】《华北农学报》
【年(卷),期】2010(025)006
【总页数】4页(P109-112)
【关键词】春萝卜;雄性不育;细胞学
【作者】田如霞;武玲萱;崔贵梅
【作者单位】山西省农业科学院,蔬菜研究所,山西,太原,030031;山西省农业科学院,蔬菜研究所,山西,太原,030031;山西省农业生物技术研究中心,山西,太原,030031【正文语种】中文
【中图分类】S631.103.2
杂种优势的利用是提高蔬菜产量、增强抗逆性的重要途径之一，雄性不育性的研究与利用是杂交育种最重要的途径之一，目前已报道的蔬菜雄性不育性研究有芹菜、番茄、白菜、萝卜等[1-4]。

萝卜(Raphanussativus L.)是我国主要的蔬菜作物之一，
亦是世界性蔬菜，具有较高的食用价值和医用价值。

自从1968年Ogura在日本鹿儿岛萝卜品种留种田中首次发现不育株并育成了不育系以来，国内外对其不育性进行了较深入研究[2，4]。

雄性不育花药败育时期和方式多样，从造孢细胞到三核花粉的各个时期均可发生，同一品系败育特征既可出现在一个时期，也可出现在相邻两个时期或多个时期。

多数学者把花粉败育归因于花药组织的异常发育，如绒毡层异常等[6]。

目前，很多学者对萝卜不同材料花药败育的细胞形态学特征进行了相关研究。

但由于萝卜雄性不育遗传机制的复杂性及试验材料差异，研究结果不完全一致[7-10]。

本研究以新近培育的春萝卜雄性不育系4-05A及其相应保持系4-05B为材料，从细胞形态学角度对花粉败育的时期和原因进行研究和分析，旨在为进一步阐明该不育材料雄性不育败育的机理提供一定理论依据。

1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为山西省农业科学院蔬菜研究所萝卜遗传育种课题组选育的春萝卜雄性不育系4-05A及其相应的保持系4-05B。

1.2 方法
在萝卜盛花期，取保持系和不育系的整个花序，在解剖镜下将花蕾从小到大分成10个梯度，<1 mm，1 mm，1.0～1.5 mm，1.5～2.0 mm，2 mm，3 mm，4 mm，5 mm，6 mm，7 mm 每个梯度取30个花蕾进行石蜡切片，在卡诺氏固定液中固定，FAA固定液保存。

材料经各级乙醇脱水、石蜡包埋和切片(蜡带厚度10 μm)后，用爱氏-苏木精染色、加拿大树胶封片，制成永久切片。

在OLYMPus 显微镜下观察花药在不同发育时期的细胞形态学特征，并拍照。

2 结果与分析
2.1 保持系小孢子囊、小孢子发生及雄配子体发育
2.1.1 保持系花药壁和小孢子母细胞的形成从雄蕊原基的切面观察，雄蕊原基顶端经细胞分裂、分化产生四棱状的花药(图1-A，B，C)，随后花药四个角隅的细胞分裂较快，变为四个裂瓣的形状，在每一瓣的表皮下分化出孢原细胞(比其他的细胞大并有显著的细胞核，细胞质浓厚)；孢原细胞进一步进行平周分裂，外层形成周缘细胞，里层形成初生造孢细胞(图1-D)。

初生周缘细胞继续进行平周分裂和垂周分裂，产生同心圆排列的细胞层，连同最外面的表皮构成花药壁，自外向内由表皮层、药室内壁、中层及绒毡层四部分构成；初生造孢细胞进行分裂形成次生造孢细胞，进而发育为小孢子母细胞(图1-E，F)，随后小孢子母细胞进入减数分裂。

A，B.未分化的花药；C，D.表皮下孢原细胞在分裂；E，F.花粉母细胞及花药壁；Ep.表皮；En.药室内壁；ML.中层；T.绒毡层；PMC.花粉母细胞；PPC.初生周缘细胞；PSC.初生造孢细胞。

A,B.Transverse section of anther showing undifferentiated parenchyma cell;C,D.Transverse section of flower bud showing undifferentiated young anther;E,F.Pollen mother cells and antheral wall;En.Mean Endothecium;ML.Middle layer;T.Tapetum;PMC.Pollen mother
cells;PPC.Primary Parietal cell;PSC.Primary sporogenous cell.
图1 保持系(4-05B)花药壁和小孢子母细胞的形成
Fig.1 The developmental process of anther well and microspore mother cell of the maintainer line(4-05B)
2.1.2 保持系小孢子母细胞减数分裂及小孢子发育进入减数分裂时期，前期小孢子母细胞细胞核体积增大，遗传物质复制(图2-A)，绒毡层细胞排列整齐并开始迅速陆续进行有丝分裂形成2核细胞，中层呈窄带状并开始解体(图2-B)；终变期，明显看到绒毡层细胞2核，中层细胞变为扁平状(图2-C)，中期Ⅰ小孢子母细胞胼胝
质明显(图2-D),减数分裂为同时型(图2-E)，经减数分裂形成四分体，具有透明的
胼胝质壁(图2-F)。

四分体后期，随着胼胝质壁的逐渐溶解，小孢子从四分体中游
离出来以后，发育整齐，初始壁薄，染色浅，核大并位于中央，可明显看到染色体(图2-G)，小孢子体积增大逐渐变圆，细胞质浓厚，无液泡，核大位于细胞中央，细胞壁雏形形成，呈三瓣形，萌发孔明显。

进一步生长发育，原生质液泡化，出现许多小液泡后合并成一个大的液泡，浓厚的细胞质和核被挤到细胞边缘(图2-H)，此时细胞核即进入不对称的有丝分裂，形成2个子核，1个紧贴细胞壁，为生殖核，另一个向着液泡，为营养核，接着发生不均等的胞质分裂，在两核间形成一个弧形细胞板，弯向生殖核一侧，最终形成1个大的营养细胞和1个小的生殖细胞，同
时在原外壁的基础上，形成真正的外壁(图2-I),期间绒毡层细胞质淡染，为小孢子
的发育提供营养逐步开始降解(图2-J)。

2核细胞花粉形成后，营养细胞内的大液
泡逐渐消失，细胞质变浓，营养细胞移动到中央位置。

随后生殖细胞脱离内壁，生殖核的细胞壁消失，游离在营养细胞中，生殖核进行第二次有丝分裂，形成2个
相等的精核。

至此，雄配子体发育成3核(图2-K)，细胞内容物不断积累、充实，小孢子最终发育为成熟的花粉粒，花药每一侧的两个小孢子囊相邻处的药隔组织消失而连通(图2-L)。

此时，绒毡层细胞消失殆尽，花粉粒经染色观察到表皮、药室
内壁及中层细胞的残迹呈透明状失活。

A.小孢子母细胞；
B.减数分裂前期；
C.减数分裂终变期；
D.末期Ⅰ；
E.末期Ⅱ；
F.四分体时期；
G.初生小孢子；
H.单核靠边期；
I.单核有丝分裂后期；
J.2-核花粉粒；
K.3-核花粉粒；
L.成熟花药；PMC.花粉母细胞；Ep.表皮；En.药室内壁；ML.中层；T.绒毡层；D.二分体；Tet.四分体； CV.中央大液泡； PG.花粉粒；MN
M.单核小
孢子；GC.生殖细胞；VC.营养细胞；GN.生殖核；VN.营养核；AC.药室。

A.The mother cells of microspore;
B.Prophase of
meiosis;C.Diakinesis;D.Telophase;E.Telophase Ⅱ;F.Tatrad;G.Gamete breaking out of callose,H.Uninucleus microspore at periphery;I.Anaphase
of uninucletemitosis;J.2-celled pollen;K.3-celled pollen;L.Matural anther；PMC.Pollen mother cell;Ep.Epidermis;En.Endothecium;ML.Middle
layer;T.Tapetum;D.dyad;Tet.Tetrad;CV.Central vacuole;Tet.Tetrad;PG.Pollen grain;MNM.Mono-nucleus microspore;GC.Genetative cell;GN.Genetative nucleus;VC.Vegetative cell;VN.Vegetative nucleus;AC.Anther chamber.
图2 保持系(4-05B)小孢子母细胞减数分裂、小孢子及花药壁的发育
Fig.2 The meiosis of microspore mother cell,the development of microspore and anther well of the maintainer line(4-05B)
2.1.3 保持系花药壁的发育小孢子母细胞减数分裂开始前，可见花药壁自外向内由表皮层、药室内壁、中层及绒毡层四部分构成(图2-A)。

表皮细胞1层，方形或矩形；中层细胞1层切向延长的细胞组成；绒毡层细胞1层，体积大，排列整齐，
细胞质浓密。

中层细胞一般在减数分裂开始呈窄带状并开始解体(图2-B)；绒毡层细胞，体积大，排列整齐，细胞质浓密。

随着花粉母细胞的减数分裂、小孢子和雄配子体的发育进程，绒毡层发生了较明显的变化，先是细胞体积增大，在减数分裂前期进行有丝分裂发育为2核细胞(图2-B)，随后在小孢子的发育过程中提供营养，直到成熟花粉粒形成时，彻底降解。

此时，可见表皮细胞、内壁细胞、中层细胞呈透明状，只残留的核物质被染色(图2-L)。

A.小孢子母细胞减数分裂；
B.四分体时期；
C.初生小孢子；D，E.绒毡层细胞；F.
单核靠边期，； G，H.绒毡层细胞裂解；I.败育花药；Ep.表皮；En.药室内壁；ML.中层；T.绒毡层；Tet.四分体；MNM.单核小孢子。

A.The meiosis of mother cells of microspore;B.Tatrad;C.Gamete breaking out of callose;D,E.Tapetal cells;F.Uninucleus microspore at periphery;G,H.The lysis of the tapetum
cell;I.Degenerated Anther；Ep.Epidermis;En.Endothecium;ML.Middle layer;T.Tapetum;Tet.tetrad;MNM.Mono-nucleus microspore.图3 不育系(4-
05A)小孢子败育的发生Fig.3 Degenerated of microspore of the male sterile line(4-05A)
2.2 不育系小孢子囊、小孢子发生及雄配子体发育
从造孢细胞发生到小孢子母细胞进行减数分裂期间，不育系与保持系花药发育特征相似，如花粉囊壁分化形成，小孢子母细胞产生，进入减数分裂，中层被挤压解体，绒毡层细胞发育为2核，花药明显变大等(图3-A，B)；到了四分体以后单核小孢
子发育时期，二者之间发育开始出现差异，尤其表现在绒毡层的发育行为方面。

进入单核花粉期，小孢子释放出来，不育系小孢子与可育小孢子没有明显区别(图3-C)，不同的是绒毡层细胞体积增大，排列整齐，细胞质内形成大的液泡，胞质部
分染色较浅；随后小孢子继续由单核中期向单核靠边期发育，同时绒毡层细胞向中央小孢子堆移动，此时已逐步开始降解，绒毡层的细胞核首先靠近小孢子(图3-D，E)，至单核靠边期小孢子发育停滞(图3-F)，绒毡层细胞破裂胞质侵入药室向中央
靠近和单核小孢子混合在一起，有的花药绒毡层细胞彼此黏连难以分清界限，形成大的细胞团块侵入药室，和小孢子黏连在一起，形状不规则(图3-G,H)。

随着花药的发育，小孢子与侵入药室的绒毡层细胞残留物混在一起，外部形态已分辨不清，并最终降解，染色后药室内呈现一条狭长的深色带状混合物，成为干瘪药室(图3-
I)。

其花药壁的发育同保持系的相同，至成熟时期相邻两花粉囊的药隔组织消失。

3 讨论
3.1 关于萝卜雄性不育花粉败育时期的探讨
关于植物雄性不育花粉败育时期的探讨，许多学者从细胞形态学角度进行了研究，发现小孢子败育时期及原因随植物种类不同而有所差异[8-11]。

有的败育发生在减数分裂期，有的败育发生在四分体至小孢子单核期，萝卜Ogura细胞质的雄性不
育系和中国萝卜不育系败育均发生在四分体至小孢子单核期。

Laser等[12]在总结前人研究的基础上，提出被子植物雄性不育系花粉败育的形式和时期是多种多样的。

单子叶植物花粉败育多数达到或接近双核期，双子叶植物花粉败育则多在四分小孢子时期或小孢子早期发育阶段。

胡适宜[13]指出，雄性不育系花粉发生在小孢子时期或是接近双核期的，一般表现为缺少淀粉粒的储藏，以致成为空瘪的花粉。

本研究结果显示，春萝卜雄性不育系4-05A的败育时期为小孢子早期发育阶段(单核靠边期)，这与粟翼玟[8]报道的秋冬萝卜雄性不育系64A及其保持系64B花药
和小孢子的细胞学观察结果一致；与董庆华等[9]报道的萝卜雄性不育系小孢子败
育花药发育受阻于单核花粉期相吻合；但与张丽等[10]报道的萝卜不育小孢子的败育在造孢时期就已表现出来，以后在单核小孢子发育过程中继续表现有所差异。

3.2 花粉败育的原因
对大多数植物来说，绒毡层发育不正常是导致花粉败育的一个主要原因。

绒毡层的主要功能是产生和输送给小孢子正常发育所必需的酶、生长素和营养物质，为花粉粒的发育和形成提供代谢所需要的物质，被成为小孢子发育的营养供给者[14]。

但也有人认为，不育材料的绒毡层异常和花粉败育，都与不育基因的控制密切相关，绒毡层的发育和解体与小孢子败育关系不大[15，16]。

本试验研究表明，四分体后小孢子已逐步开始降解，至单核靠边期小孢子发育停滞，在此期间绒毡层细胞破裂胞质侵入药室与单核小孢子混合在一起，形成大的细胞团和小孢子黏连在一起，开始降解，随着花药的发育，异常绒毡层已完全降解只剩下轮廓，染色后药室内呈现一条狭长的深色带状混合物，绒毡层细胞的异常是小孢子败育的主要原因，绒毡层细胞液泡化不能为小孢子发育提供营养，营养物质的缺乏使得小孢子发育败育。

春萝卜4-05A花药绒毡层细胞的异常发育与小孢子败育同步，故是小孢子败育的一个重要原因。

参考文献：
【相关文献】
[1] 陆子梅，高国训，靳力争，等．芹菜雄性不育花药发育的细胞学观察[J]．华北农学报，2007，22(1)：120-122.
[2] 单奇伟，陈龙正，徐海,等．不结球白菜Ogura雄性不育花器官形态及败育细胞学的研究[J]．华北农学报，2009，24(增刊)：25-29.
[3] Ogura H.Studies on the new male sterdity in Japanese radish with special refence to
the utilization of this sterility towards the practical raising of hybrid seeds[J]．MeM Fac Agric Kagoshima Univ,1968,6(2)：39-78.
[4] 何启伟，石惠莲.萝卜雄性不育系及遗传机制的研究[J]．中国农业科学，1987，20(2)：26-33.
[5] 张丽，沈向群，赵国余.春夏萝卜雄性不育性遗传规律的研究[J]．园艺学报,1999，26(4):238-243.
[6] Kaul M L.Male sterility in higher plants．In:Monograph on Theor Appl
Genet[J].Springer Verlag,1988,10:22-25.
[7] 陈懋琳，汪隆植.萝卜小孢子发生和雄配子体发育的细胞形态学观察[J]．南京农业大学学
报,1988，11(3)：14-19.
[8] 粟翼玟，赵双宜，张燕君.萝卜雄性不育系小孢子发生的细胞形态学研究[J]．园艺学报,1995，
22(4)：348-352.
[9] 董庆华，利容千，王建波．萝卜雄性不育系花药发育的细胞形态学研究[J]．武汉大学学报：自
然科学版，1996，42(2):207-212.
[10] 张丽，沈向群，宫国义.水萝卜雄性不育系及保持系小孢子发生的细胞形态学观察[J]．沈阳农
业大学学报，2000，31(2)：166-168.
[11] 董庆华，利容千，王建波.菜薹细胞质不育系小孢子发生的细胞形态学研究[J].园艺学报，l997，24(2):150-154.
[12] Lasser K D,Lersten N R.Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic male sterile angiosperms[J].Botanical Review,1972,38(3)：425-454.
[13] 胡适宜.被子植物胚胎学[M].北京:人民教育出版社，1982.
[14] 耿三省,王志源，蒋健箴.辣椒雄性不育系小孢子发生的细胞学观察[J].园艺学报，1994，
21(2):165-169.
[15] 张天真，潘家驹.陆地棉473A核雄性不育小孢子败育的细胞学研究[J].南京农业大学学报，1991，14(3):7-11.
[16] 夏涛，刘纪麟.玉米细胞质雄性不育的细胞学研究[J].作物学报,1989,15(2):97-102.。