【CN110093451A】用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学活性的新方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910282012.0
(22)申请日 2019.04.09
(66)本国优先权数据
201811566087.3 2018.12.20 CN
(71)申请人 中国食品药品检定研究院
地址 100050 北京市东城区天坛西里2号
(72)发明人 饶春明　王军志　姚文荣　范文红　
于雷　秦玺　史新昌　刘兰　
(74)专利代理机构 北京中知法苑知识产权代理
事务所(普通合伙) 11226
代理人 常玉明　张兰海
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6897(2018.01)
C12Q 1/02(2006.01)
C12N 15/85(2006.01)
(54)发明名称
用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学
活性的新方法
(57)摘要
本发明涉及荧光素酶报告基因法测定重组
人生长激素Fc融合蛋白的生物学活性。

所述方法
利用STAT5反应元件(SGG1)和GHR 质粒，转染
HEK293细胞后获得稳定表达SGG1荧光素酶报告
基因和GHR的细胞株，加入生长激素Fc融合蛋白
刺激后，激活SGG1反应元件下游荧光素酶报告基
因表达，根据荧光信号值拟合四参数曲线确定生
长激素Fc融合蛋白的生物学活性。

本发明针对生
长激素Fc融合蛋白的生物学活性测定建立了易
于操作、灵敏度高、变异系数小和准确性高的检
测方法，对于生长激素Fc融合蛋白的研发和生产
中的质量控制具有重要的指导作用。

权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 110093451 A 2019.08.06
C N 110093451
A
1.一种应用荧光素酶报告基因法来快速评价生长激素Fc融合蛋白(GH -Fc)生物学活性的方法，其所述方法基于GH及其受体结合后激活JAK2-STATs信号途径，进而结合STAT5反应元件后激活其下游荧光素酶基因的转录。

2.构建的荧光素酶报告基因细胞株包括获得稳定表达STAT5反应元件和GHR的细胞株，加入的GH -Fc蛋白与转基因细胞表面的GHR受体结合，激活反应元件下游荧光素酶报告基因的表达，根据测得的荧光素酶报告基因信号值拟合四参数曲线确定GH -Fc的生物学活性。

3.根据权利要求1和2的快速测定GH -Fc蛋白生物学活性方法，其特征在于：
(1)构建稳定表达STAT5反应元件(本发明命名为SGG1)和GHR的细胞株用于测定GH -Fc 蛋白的生物学活性；
(2)将GH -Fc蛋白及参比品稀释至预稀释浓度，3倍比稀释，加入至(1)细胞中，37℃，5％CO 2作用；
(3)加入荧光素酶底物，根据测得的荧光值拟合四参数曲线，确定GH -Fc蛋白的生物学活性。

4.根据权利要求1-3所述方法，其中稳定表达SGG1和GHR的细胞株选择HEK293细胞和HeLa细胞，优选为稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞。

5.根据权利要求1-3所述方法，其中报告基因为荧光素酶报告基因。

6.根据权利要求1-3的技术方案，其特征在于：
(1)重悬细胞时采用1640培养液；
(2)铺板细胞数量为2.0-5.0×104/孔，优先4.0×104/孔；
(3)GH -Fc融合蛋白及参比品的稀释液为1640培养液；
(4)用稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞检测时，GH -Fc融合蛋白的预稀释浓度为15μg/mL(15000ng/mL)，3倍比稀释；
(5)加入GH -Fc融合蛋白后，与转基因细胞作用时间为3-6h，优先5h；
(6)检测的是GH -Fc融合蛋白与转基因细胞作用后荧光素酶基因表达的变化；
(7)荧光素酶底物试剂盒有PerkinElmer的Britelite plus和Promega的Bright -Glo，优先PerkinElmer的Britelite plus试剂盒；
(8)酶标仪读取荧光值，通过拟合四参数曲线确定GH -Fc融合蛋白和参比品的EC50值，以相对生物学活性(相对生物学活性＝参比品EC50/样品EC50)反应GH -Fc融合蛋白的生物学活性。

7.权利要求1-6所述方法用于GH -Fc融合蛋白药物生产和研发中的质量控制。

权　利　要　求　书1/1页CN 110093451 A
用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学活性的新方法
技术领域
[0001]本发明涉及治疗性重组药生物学活性检测领域，建立了快速、简单和准确的测定重组人生长激素(Growth hormone，GH)融合蛋白生物学活性的方法。

背景技术
[0002]GH是一种垂体来源的蛋白质，参与调节生长发育过程中的代谢，其缺乏可以导致儿童生长发育迟缓，成人则为生长激素缺乏综合征，重组人GH可以纠正上述症状。

由于GH的半衰期短，需要每日皮下注射，大大增加了治疗者的痛苦。

为了延长半衰期，长效化重组蛋白药物成为目前生物技术药物的研发主流；从技术上讲，长效化分主要包括化学修饰(PEG 化)和融合蛋白修饰(HSA和抗体Fc片段)两种策略，其中Fc融合蛋白技术是目前研究最多、进展最快的蛋白融合技术。

[0003]尽管新型GH药物进展迅速，但尚无快速检测其生物学活性的方法。

目前，中国药典中收录的GH生物测定的方法是去垂体大鼠体重法和去出题大鼠胫骨法，两种方法都涉及到大鼠动活体检测，除了不符合动物保护及动物福利的3R原则，实验本身操作复杂，变异系数大，亟需体外细胞学方法替代动物体内法。

因此，生物技术药物领域的科研工作者迫切建立建立灵敏、高效、稳定的GH以及类似产品的体外生物学活性检测方法并探索其可行性，从而满足此类产品的注册和评价需求。

[0004]本发明采用体外转基因细胞活性测定方法，利用GH-Fc融合蛋白与GHR结合后，进一步活化细胞内的JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多条明确的信号通路，从而维持细胞的增殖和分化。

[0005]本发明选择JAK2-STATs信号通路，在HEK293细胞中转入含有STAT5启动子的荧光素酶报告基因和GHR受体质粒，获得HEK293-GHR-Luc细胞株。

GH-Fc与受体结合后激活JAK2-STATs信号通路，从而激活STAT5反应元件下游的荧光素酶基因的转录，荧光素酶基因表达量的强弱与结合至靶细胞膜上GH受体的GH-Fc含量呈正相关。

该方法在操作程序、试验周期及变异系数方面，明显优于药典中去垂体大鼠法。

发明内容
[0006]本发明是建立一种快速、简便的GH-FC融合蛋白生物学活性的测定方法。

该方法包括构建表达GHR和STAT5反应元件(本发明中采用SGG1命名，为本科室构建的质粒)的稳定细胞株，GH-Fc融合蛋白刺激后能够激活STAT5下游荧光素酶报告基因的表达，根据荧光素酶的荧光值拟合四参数曲线，从而确定GH-Fc融合蛋白的生物学活性。

[0007]本发明的目的在于提供一种快速测定GH-Fc融合蛋白生物学活性测定方法，所述方法包括：
[0008](1)分别将STAT5反应元件(SGG1)和GHR质粒转入细胞，加压筛选单克隆细胞株，获得稳定表达SGG1和GHR的单克隆细胞株；
[0009](2)将GH-Fc融合蛋白药物稀释，加入至(1)细胞中，37℃刺激5h；
[0010](3)弃去上述(2)中的培养液，加入荧光素酶底物测定荧光值，拟合四参数曲线确定GH-Fc融合蛋白的相对生物学活性。

[0011]HEK293细胞是人胚胎肾细胞，广泛应用到药物的研发、生产和科学研究中。

HEK293细胞表面表达GHR受体，与GH结合后可以激活JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多条明确的信号通路，从而促进细胞的增殖和分化等。

[0012]为提高其对GH-Fc融合蛋白的反应性和特异性，在HEK293细胞中同时转入SGG1和GHR，加压筛选稳定表达SGG1和GHR的细胞株命名为HEK293-GHR-Luc。

[0013]在本发明的实施方案中，稳定表达SGG1和GHR的细胞株选择HEK293细胞和HeLa细胞，优选为稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞。

[0014]在本发明的实施方案中，报告基因为荧光素酶报告基因。

[0015]在本发明的实施方案中，稳定表达SGG1和GHR的HEK293-GHR-Luc，优选含STAT5反应元件的载体为本科室保存的SGG1；优选GHR受体为市售的Human growth hormone receptor(GHR，Cat：RC218710)质粒。

[0016]在本发明的实施方案中，重悬细胞时采用1640培养液。

[0017]在本发明的实施方案中，铺板细胞数量为2.0-5.0×104/孔，优先4.0×104/孔。

[0018]在本发明的实施方案中，GH-Fc融合蛋白及参比品的稀释液为1640培养液。

[0019]在本发明的实施方案中，用稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞检测时，GH-Fc融合蛋白的预稀释浓度为15μg/mL(15000ng/mL)，3倍比稀释。

[0020]在本发明的实施方案中，加入GH-Fc融合蛋白后，与细胞作用时间为3-6h，优先5h。

[0021]在本发明的实施方案中，检测的是GH-Fc融合蛋白与转基因细胞作用后荧光素酶基因表达的变化。

[0022]在本发明的实施方案中，荧光素酶底物试剂盒有PerkinElmer的Britelite plus 和Promega的Bright-Glo，优先PerkinElmer的Britelite plus试剂盒。

[0023]酶标仪读取的荧光值，拟合四参数曲线，确定GH-Fc融合蛋白和参比品的EC50值，以相对生物学活性(相对生物学活性＝参比品EC50/样品EC50)反应GH-Fc融合蛋白的生物学活性。

该发明方法操作简单，实验时间短，变异小，在GH-Fc融合蛋白药物的研发和质量控制中具有较高的应用价值。

附图说明
[0024]现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。

[0025]图1是HEK293细胞转染SGG1反应元件和SGG1-GHR后混克隆的反应曲线；
[0026]图2是不同单克隆HEK293-GHR-Luc细胞株的反应曲线；
[0027]图3是HEK293-GHR-Luc对含不同血清浓度的反应液的反应曲线；
[0028]图4是HEK293-GHR-Luc细胞株不同预稀释浓度的反应曲线；
[0029]图5是HEK293-GHR-Luc细胞株不同细胞数量的反应曲线；
[0030]图6是HEK293-GHR-Luc细胞株不同作用时间的反应曲线；
[0031]图7是HEK293-GHR-Luc细胞株的专属性反应曲线；
[0032]图8是HEK293-GHR-Luc细胞株的线性回归曲线；
具体实施方式
[0033]通过下面的具体实施例对本发明作进一步解释和说明，仅用于解释本说明，并不能理解为对本发明的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商建议的条件实施检测。

以下实施例中采用试剂的配制方法如下：
[0034]实施例1筛选稳定表达SGG1和GHR受体的HEK293细胞株
[0035] 1.材料与方法
[0036] 1.1细胞
[0037]HEK293细胞来源于ATCC。

[0038] 1.2试剂及材料
[0039]Human growth hormone receptor(GHR)质粒购于Origene公司；ViaFect TM转染试剂购于Promega；DMEM培养液、1640培养液、胎牛血清(FBS)和(G-418)购于GIBCO；潮霉素B购于索莱宝生物科技有限公司；Britelite plus荧光素酶底物购于PerkinElmer；白色底部透光96孔板购于CORNING；GH-Fc融合蛋白和含SGG1反应元件的质粒为中国食品药品检定研究院重组药物室留存。

[0040] 1.3仪器及分析软件
[0041]酶标仪购自Molecular devices，型号为SpectraMax M5；SoftMax Pro及GraphPad Prism 7.0软件用于数据分析。

[0042] 2.试验操作
[0043] 2.1转染SGG1质粒用10％FBS的DMEM培养液调整HEK293细胞浓度至3×105/mL，取5mL至25cm2细胞瓶。

37℃培养24h后根据说明书转染含SGG1反应元件的质粒，24h后加入300μg/mL的潮霉素B进行加压筛选，每隔5d更换新的含潮霉素B的培养液，连续培养约14-21d。

[0044] 2.2转染GHR质粒用含10％FBS的DMEM调整2.1中混克隆细胞密度至5×105/mL，取5mL至25cm2细胞瓶。

37℃培养24h根据说明书转染GHR质粒，继续培养24h后更换含G-418 (1000μg/mL)和潮霉素B的完全培养液。

每隔5d更换新的培养液，连续培养约14-21d。

[0045] 2.3转入SGG1和转入SGG1-GHR质粒的HEK293细胞的反应性用1640培养液调整2.1和2.2中混克隆细胞密度，按照3×104/孔细胞加入96孔板，37℃，5％CO2培养12-18h，加入等体积倍比稀释的GH-Fc融合蛋白进行刺激(50000ng/mL预稀释浓度，5倍比稀释)，继续培养4-6h后弃去反应液，加入60μL Britelite plus荧光素酶底物，检测荧光素酶荧光值，拟合四参数曲线(图1)。

[0046]根据细胞株对GH-Fc融合蛋白反应性和信噪比(SNR)选择同时转入SGG1和GHR质粒的HEK293作为实验用细胞，命名为HEK293-GHR-Luc。

[0047] 2.4 HEK293-GHR-Luc单克隆细胞株制备消化并重悬细胞，按照0.5个/孔的密度铺96孔板。

定期观察细胞生长情况，挑选圆的单克隆细胞孔，依次在24孔板和6孔板进行扩大培养。

[0048] 2.5单克隆细胞株筛选挑选19个单克隆细胞株，检测对GH-Fc融合蛋白的反应性。

用1640培养液调整细胞浓度，按照3×104/孔细胞加入96孔板，37℃，5％CO2培养12-18h。

[0049]GH-Fc融合蛋白预稀释浓度为50μg/mL，5倍比系列稀释8个梯度，各设2个复孔。

作用4-6h检测荧光素酶荧光值并拟合四参数曲线。

[0050]在单克隆筛选方面，从最初选择的19个单克隆进行筛选，经过三轮评价后，根据
SNR和EC50(表1)，最终确定1B1单克隆进行后续实验(图2)。

[0051]表1 HEK293-GHR-Luc单克隆细胞株第三轮筛选结果
[0052]
[0053]实施例2 GH-Fc融合蛋白生物学活性测定的方法学优化
[0054] 1.反应液的优化分别用1640、含0.5％FBS和含10％FBS的1640培养液调整细胞浓度，按照3×104/孔细胞加入96孔板，37℃，5％CO2培养12-18h，加入等体积倍比稀释的GH-Fc融合蛋白进行刺激，继续培养4-6h后弃去反应液，加入60μL Britelite plus荧光素酶底物，充分震荡5min后检测荧光素酶荧光值，拟合四参数曲线(图3)。

鉴于将血清中非特异物质对活性影响降低到最低的原则，结合三种反应液的SNR(表2)，选择含1640培养液作为活性检测反应液。

[0055]表2不同血清浓度反应液的优化
[0056]
[0057] 2.GH-Fc融合蛋白浓度优化根据实施例2中1的反应液优化结果，GH-Fc融合蛋白预稀释浓度10000ng/mL、15000ng/mL、20000ng/mL和25000ng/mL，3倍比系列稀释8个梯度，各设2个复孔。

加入胞后作用4-6h检测荧光素酶荧光值并拟合四参数曲线(图4)。

[0058]结果显示，不同预稀释浓度的样品的EC50基本一致，其中预稀释浓度为15000ng/ mL时SNR最高(表3)。

选择15000ng/mL预稀释浓度，3倍比进行稀释。

[0059]表3不同预稀释浓度的优化
[0060]
[0061] 3.细胞密度优化用1640培养液调整细胞浓度，分别按照2.0×104/孔、3.0×104/孔、4.0×104/孔和5.0×104/孔细胞加入至96孔板中，37℃，5％CO2培养12-18h。

加入15000ng/mL，3倍比稀释的GH-Fc融合蛋白，4-6h后检测荧光素酶荧光值并拟合四参数曲线(图5)。

[0062]结合EC50和SNR结果(表4)，选择4.0×104/孔细胞密度进行后续实验。

[0063]表4不同细胞密度优化结果
[0064]
[0065]
[0066] 4.作用时间优化用1640培养液调整细胞浓度，按照4.0×104/孔细胞加入至96孔
板中，37℃，5％CO2培养12-18h。

加入15000ng/mL，3倍比稀释的GH-Fc融合蛋白，分别于3h、4h、5h和6h后检测荧光素酶信号值并拟合四参数曲线(图6)。

[0067]结合EC50和SNR结果(表5)，选择5h做为GH-Fc融合蛋白作用时间。

[0068]表5不同作用时间优化结果
[0069]
[0070]实施例3 GH-Fc融合蛋白生物学活性测定的方法学验证
[0071] 1.专属性
[0072]本方法是针对GH-Fc融合蛋白的生物学活性方法，因此，采用不同品种的Fc融合蛋白对其专属性进行验证，包括EPO、VEGFR、IL15和GLP1的Fc融合蛋白。

按照实施例2中1-4确定的试验条件，测定上述四种Fc融合蛋白的生物学活性。

[0073]结果见图7，本方法对EPO、VEGFR、IL15和GLP1的Fc融合蛋白均没有剂量反应曲线，说明此方法不适用于除GH-Fc融合蛋白外的其他药物，说明该方法的专属性较好。

[0074] 2.精密度
[0075]用实施例2确定的实验条件评价该方法的精密度。

取4个GH-Fc融合蛋白样品进行活性测定，每天测定不同3次，连续测定3d，每个稀释度2个复孔。

[0076]表6结果表明，HEK293-GHR-Luc细胞株测定GH-Fc融合蛋白生物学活性的日内变异系数(CV)为2.04-8.81％，日内CV值为2.06-5.87％，日内和日间的CV值均小于9％，说明该方法的精密度较好，可以用来测定GH-Fc融合蛋白样品的生物学活性。

[0077]表6 HEK293-GHR-Luc细胞株测定GH-Fc融合蛋白生物学活性的精密度
[0078]
[0079] 3.准确性
[0080]用实施例2确定的实验条件评价该方法的准确性。

取1个GH-Fc融合蛋白样品，分别制备预稀释浓度为确定预稀释浓度(15000ng/mL)的50％、75％、100％、125％和150％，3倍比稀释，连续8个稀释度，上述5个不同预稀释浓度的样品和参比品进行相同操作。

每天测定不同3次，连续测定3d，每个稀释度2个复孔。

[0081]表7结果表明，HEK293-GHR-Luc细胞株的CV值均小于7.00％。

将5组样品的实际测量相对生物学活性的平均值与理论值进行线性拟合，R2为0.9946，线性拟合较好(图8)，表明该方法的准确性较好。

[0082]表7 HEK293-GHR-Luc细胞株测定GH-Fc融合蛋白生物学活性的准确性
[0083]
图1
图2
图3
图4
图5
图6
图7图8
说　明　书　附　图4/4页CN 110093451 A 11。