1株出芽短梗霉的分离_纯化及鉴定

图 1 出芽短梗霉孢子及菌丝体形态
Fig． 1 The morphology of Aureobacidium pullulans spore and mycelium
2． 2 出芽短梗霉 ITS 区序列 电泳结果显示，出芽短梗霉
ITS 区长度约 600 bp( 图 2) ，测序结果表明该序列长度为 606
将所得出芽短梗霉的its区序列分别与genbank中已知序列进行比较利用分子生物学软件构建系统发育树结论与讨论出芽短梗霉是一种具有复杂生活史的多形态真菌曾为pullulariapullulandermatiumpullulan现称为pullulans由于短梗霉形态的特异性及其与酵母细胞有相似之处曾被认为是一种黑酵母但它可以形成菌丝和厚垣孢子等的特梗酶为该霉的分类鉴定及进一步开发利用提供了依据
作者简介 潘欣( 1979 － ) ，女，宁夏银-27
素购自上海生物工程有限责任公司。 1． 1． 3 仪器。SW-SJ-2FD 型双人单面净化工作台( 苏州净 化) ; 显微镜( Leica) ; 显微成像设备( 奥林巴斯 BX51) ; PCR 仪( Eppendorf) ; 电泳仪( BIO-RAD) ; 高速冷冻离心机( Eppendorf 5804R) ; 小型涡旋振荡器; 水浴锅; 摇震培养箱( Thermo Barnstead MaxQ6000) 等。 1． 1． 4 培养基。YPD 培养基: 2% 蛋白胨、1% 酵母抽提物、 2% 的葡萄糖，自然 pH，制成斜面或平板，加 2% 琼脂粉制成 YPD 固体培养基，121 ℃ 灭菌 20 min 备用。
公司测序。 1． 2． 5 ITS 区序列分析。利用 ClusterW 软件对 ITS 序列进 行整理，用 DNAstar 及 blast( http: / / blast． ncbi． nlm． nih． gov / Blast． cgi) 进行同源性及聚类分析。 2 结果与分析 2． 1 出芽短梗霉的培养特性 25 ℃ 下 YPD 培养基上菌落 初期为酵母样: 粘稠、污白色，显微镜下为单细胞个体、椭圆 形( 图 1a) ; 菌落后期为真菌菌丝体: 转暗为黑色，边缘呈根 状，显微镜下观察出现丝状体( 图 1b) 。研究表明，具有两态 性真菌的出芽短梗霉在发酵过程中只有形态呈酵母样时，才 能分泌出大量的短梗霉多糖。
出芽短梗霉 ITS 区与基因库( GenBank) 中登录的已知序
列 AF455533 ( A． pullulans wb149) 、FN868454 ( A． pullulans) 、
出芽短梗霉( Aureobacidium pullulans) 又名“出芽茁酶”、 “芽生侧茁酶”、“黑 酵 母 ”及“短 梗 霉 ”等，是 一 类 类 酵 母 真 菌，具有酵母样和真菌菌丝体 2 种形态，据其生理特征和孢 子产生的特征等将之归属于半知菌门( Deuteromyco phy-ta) 、 丛梗孢目( Moniliates) 、短梗霉菌属( Aureodacidium) ［1 －2］。出 芽短梗霉可产生多种代谢产物，如胞外多聚糖、酶、抗菌素及 单细胞蛋白等，是一种很有开发价值和应用前景的多功能新 型生物制品。国内外有关胞外多糖的研究较多，包括短梗霉 多糖( pullulan) 和 β-( 1，3-1，6) -D-葡聚糖等［3 －5］。短梗霉产 生的黑色素( melanin) 是生物界中广泛存在的一种异源多聚 芳香族化合 物，具 有 生 物 半 导 体、清 除 自 由 基、防 紫 外 线 辐 射、螯合重金属离子等功能，可应用于日用化妆品工业、食品 工业、医药化工及农业等众多领域［6］。
目前，国内外有关出芽短梗霉的研究主要集中在酵母和 真菌 2 种 形 态 的 互 相 转 变、发 酵 产 物 以 及 菌 种 选 育 方 面［2 －6］，而有关其分子鉴定、进化关系和系统发育方面的研 究较少。鉴于此，笔者对从土壤中分离得到的 1 株出芽短梗 霉的培养特性、菌丝特征进行了描述，并提取了其总 DNA，结 合分子生物学方法对菌丝体进行了鉴定和系统发育分析，以 期为出芽短梗霉的进一步开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 试验菌种。出芽短梗霉纯化菌种。 1． 1． 2 试剂。分子量标准 DL2000 购自宝生物工程( 大连) 有限公司; Taq DNA 聚合酶、dNTP、pBS-T II 快速连接试剂盒 购自天根生化科技( 北京) 有限公司; IPTG、X-gal、氨苄青霉
LB 培养基: 1% 蛋白胨、0． 5% 酵母抽提物、1% NaCl，pH 值 7． 0，加 2% 的琼脂制成斜面或平板，121 ℃ 灭菌 20 min 备用。 1． 2 方法 1． 2． 1 出芽短梗霉的分离与纯化。土壤取自成都理工大学 校园，将新鲜土壤样品 5 g 放入 100 ml 无菌三角瓶内，加入 无菌水及玻璃珠，制成 10 －1 的土壤稀释液。振荡 10 min 后吸 取 1 ml，移入装有 9 ml 无菌水的试管中，制成 10 －2 的稀释液， 再由 1 /100 的稀释液中吸取 1 ml，移入另一只装有 9 ml 无菌 水的吸管中，制成 10 －3 的稀释液，依次稀释至 10 －8 。用微量 移液器吸取 0． 5 ml 土壤稀释液于 YPD 培养皿中，3 个重复， 随即用无菌 L 型玻棒将接种物均匀涂布开，于 25 ℃ 恒温箱 内倒置培养。待长出菌落后，在菌落边缘用无菌接种环挑取 培养基块，移入新 YPD 培养皿中，继续置 25 ℃ 恒温条件下培 养，待长出菌丝后显微镜观察其显微特征。 1． 2． 2 出芽短梗霉菌丝体培养收集。将纯化后的短梗霉接 种于 YPD 液体培养基中，25 ℃ 、180 r / min 振荡培养 5 ～ 7 d， 10 000 r / min 离心 20 min 收集菌丝，用吸水纸尽量吸干水分， 4 ℃ 保存备用。 1． 2． 3 DNA 提取。采用改良二次沉淀法［7 －8］，提取的 DNA
Isolation，Purification and Identification of A Strain of Aureobasidium pullulans PAN Xin ( College of Tourism and Town and Country Planning，Chengdu University of Technology，Chengdu，Sichuan 610059) Abstract ［Objective］ The purpose of the research was to supply theoretical foundation for further exploitation of Aureobasidium pullulans． ［Method］ A strain of A． pullulans was isolated from soil by plate-dilution method，its mycelium was cultured with YDP medium and the microshape of its mycelium was observed through microimaging． Then the inner transcription section ( ITS) of its rRNA gene was cloned and sequenced by molecular biological method and the sequencing result was compared with the known sequence in Genbank． ［Result］The sequencing result of PCR amplification product from ITS showed that the length of amplified sequence was 606 bp，the isogenesis rate between it and Napicladium in Genbank was 98% － 99% and it belongs to the same individual branch with A． pullulans wb 149 and A． pullulans HK58-1 ( 2) ; the results from morphological and molecular identification showed that the culture of A． pullulans was successful． ［Conclusion］ The classic method and modern molecular technology was combined in this research，then a strain of A． pullulans was identified and this research supplied basis for category judgement of A． pullulans． Key words Aureobasidium pullulans; Isolation; Identification; Phylogenesis
5080
安徽农业科学
2011 年
用 0． 8% 琼脂糖凝胶电泳检测，－ 20 ℃冰箱中保存备用。 1． 2． 4 ITS 区 PCR 扩增及克隆。采用真菌通用引物 ITS4 和 ITS5( 上海生工生物工程有限公司提供) ，其序列为 ITS4( 5'TCCTCCGCTTATTGATATGC ) 和 ITS5 5'-GGAAGTAA AAGTCG TAACAAG) 。PCR 扩增体系 50 μl: 超纯水 41 μl， 10 × Buffer ( 含 1． 5 mmol / L Mg2 + ) 5． 0 μl，10 mmol / L dNTP 1. 0 μl，引物各 1． 0 μl，模板 DNA 0． 5 μl，TaqDNA 聚合酶 0． 5 μl。反应参数: 94 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 变性 1 min，50 ℃ 退 火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环 30 次; 72 ℃ 延伸 10 min。扩 增产物经胶回收，按 pBS-T II 快速连接试剂盒步骤转化，将 阳性转化子穿刺培养后送上海生工生物工程技术服务有限
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39( 9) : 5079 － 5080，5086
责任编辑 常俊香 责任校对 卢瑶
1 株出芽短梗霉的分离·纯化及鉴定
潘 欣 ( 成都理工大学旅游与城乡规划学院，四川成都 610059)
摘要 ［目的］为出芽短梗霉的进一步开发利用提供理论依据。［方法］采用平板稀释法从土壤中分离出 1 株出芽短梗霉，用 YPD 培养 基培养菌丝体，显微成像获得菌丝微观形态，利用分子生物学方法对其 rRNA 基因内转录区段( ITS 区) 进行克隆测序，并与 Genbank 中 已知序列进行比较。［结果］ITS 区 PCR 扩增产物测序结果表明，所扩增序列的长度为 606 bp，与 Genbank 中短梗霉的同源率为 98% ～ 99% ，与 Aureobasidium pullulans wb 149、A． pullulans HK58-1( 2) 属于同一单独分枝; 形态及分子鉴定结果表明，出芽短梗霉培养成功。［结 论］该研究采用经典与现代分子技术相结合的方法鉴定出了 1 株出芽短梗霉，为出芽短梗霉的分类鉴定提供了依据。 关键词 出芽短梗霉; 分离; 鉴定; 系统发育 中图分类号 S 184 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611( 2011) 09 － 05079 － 02
bp( 图 3) ，GC% = 48． 35% ，而基因库中该序列长度为 605 ～
611 bp，GC% 含量在 48． 28% ～ 48． 76% 之间。传统的真菌种
类鉴定主要依据子实体或特殊构造的特征，利用 rDNA 基因
的 ITS 区段进行 PCR 扩增及序列分析，已成为目前广泛用于
真菌分类鉴定的方法，大量研究表明这种分子鉴定方法切实 可行，鉴定结果较可靠［9］。