医学论文反相高效液相色谱法-二极管阵列检测器分析降糖中药制剂中的西药成分

反相高效液相色谱法-二极管阵列检测器分析降糖中药制剂
中的西药成分
[摘要] 目的:应用反相高效液相色谱/二极管阵列检测（RP-HPLC-PDAD）技术分析中药降糖制剂中可能存在的西药成分。

方法：采用RP-HPLC-PDAD 对降糖中药制剂进行初步分析，用临床常用降糖西药进行筛选。

色谱柱:Agilent ZORBAX ODS C18柱(5μm,4.6×250mm, Agilent)；流动相：醋酸盐缓冲液（10mol ﹒L-1醋酸胺，20 mol﹒L-1三乙胺,用醋酸调节pH5.5）与乙腈，梯度洗脱，流速:0.6 mL·min-1，色谱检测波长234nm，格列吡嗪为内标物进行定量分析。

结果: 所测定的中药降糖药中含有三种西药组分，分别为格列本脲、苯乙双胍、阿卡波糖，并能在该色谱条件下与中药完全分离，峰保留时间在4～30min,其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

结论: 本方法可用于中药降糖药中西药成分的分析。

[关键词] 反相高效液相色谱;二极管阵列检测器;格列本脲；苯乙双胍；阿卡波糖;中药制剂
Determination of Western Medicines added in the
traditional Chinese medicines by RP-HPLC-PDAD
HE Xiao-rong，ZOU Ding，WU Xue-jun，MA Jie，HU Xin，SUN Chun-hua （ Department of Pharmacy，Beijing Hospital, Ministry of Health ，100730）[Abstract]Objective: To analyze Western Medicines added presumably in Traditional Chinese Medicines for reducing blood sugar by reversed phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）-Photodiode Array Detector（PDAD）. Methods: To analyze the Traditional Chinese Medicines by RP- HPLC –PDAD. Column: Agilent C18; mobile phase 10mol．l-1 monobasic Acetate buffer, 20 mol﹒L-1triethylamine solution adjusted to pH5.5 with Acetic acid -acetonitrile ,gradient elution， flow rate: 0.6 mL﹒min-1; Results：The Traditional Chinese Medicines contained Acarbose, Phenformin and Glibenclamide, and can be separated completely. Peaks retention time 4～30min. Between the concentration and the area had a good linearity. Conclusion: This method can be used to analyze Western Medicines added lawlessly inTtraditional Chinese Medicines.
[KEY WORDS] RP-HPLC；PDAD； Acarbose； Phenformin；Glibenclamide; Traditional Chinese Medicines
糖尿病已成为当前世界性卫生问题，我国糖尿病患病率也逐年增加，新增的患者主要为2型糖尿病，口服降糖药在这类患者的治疗中占有重要的地位。

近年来，临床常用的降糖药物有磺酰脲类,双胍类和α-葡萄糖苷酶抑制剂等，民间也出现一些中药降糖制剂，其中有些中药制剂擅自添加西药成分，随意夸大疗效，有的病人误认为这些民间中药制剂是纯中药制剂，副作用小，可以大量服用，临床出现服用这些中药降糖药中毒的病人。

为此，我们采用反相HPLC，梯度洗脱，PDAD检测器，较好分离降糖中药制剂中的格列本脲、苯乙双胍、阿卡波糖，为
临床病人抢救提供依据。

1 仪器与试药
Waters 2695 Separations Module,紫外检测器,2996型二极管阵列检测
器,化学工作站(Empower)。

格列本脲对照品（中国药品生物制品检定所,10135-0103），阿卡波糖、苯乙
双胍及格列吡嗪均由厂家提供。

醋酸胺,醋酸,均为分析纯,三乙胺、乙腈均为色谱纯,纯化水。

珍蛤降糖散，
民间中药粉，民间中药胶囊。

2 色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX ODS C 18柱(5μm,4.6×250mm, Agilent);流动相:醋
酸盐（10mol ﹒L -1醋酸胺，20 mol ﹒L -1三乙胺,用醋酸调节pH5.5）与乙腈梯度洗
脱，0～6min ： 95%～90%：5%～10%;6～25min ：30%：70%；25～30min ：10%：90%；30～35min ：10%：90%；35～40min ：95%：5%；流速:0.6 ml ﹒min -1;检测波长:234nm;
理论塔板数大于3000,柱温:30℃;.进样量:10μl，色谱图见表1、2、3、4。

图1 阿卡波糖+苯乙双胍+格列吡嗪+格列本脲色谱图
1．阿卡波糖（4.11min ） 2. 苯乙双胍(20.81min)
3. 格列吡嗪（内标）（26.74min ）
4. 格列本脲（29.68min ）
图2 阿卡波糖+苯乙双胍+格列吡嗪+格列本脲紫外图谱
图3 中药+格列吡嗪色谱图
1．阿卡波糖（4.12min） 2. 苯乙双胍(20.78min) 3. 格列吡嗪（内标）（26.73min） 4. 格列本脲（29.66min）
图4 中药+格列吡嗪紫外图谱
3 试验方法与结果
3.1 线性关系分别精密称取格列本脲、苯乙双胍、阿卡波糖三种组分对照品和内标溶液适量，于50mL量瓶中,加甲醇溶液15ml,充分振摇使溶解,加水稀释至刻度,摇匀，备用。

精密量取上述溶液0.5,1.0,2.0,3.0,3.5,
4.0,4.5 ml分别置10 ml量瓶中,加50%甲醇溶液稀释置刻度,摇匀,精取10μl注入液相色谱仪,记录峰面积,分别以格列本脲（Y1）、苯乙双胍（Y2）、阿卡波糖（Y3）浓度与其峰面积和内标峰面积之比进行线性回归,回归方程依次为:
Y1=0.0192X-0.052 (r=0.9999, n=6)，线性范围为2.5～40μg.ml-1；
Y2=0.0031X-0.016 (r=0.9993, n=6)，线性范围为25～500μg.ml-1；Y3=0.0004X+0.042 (r=0.9984, n=6)，线性范围为50.44～403.52μg.ml-1；3.2 精密度实验分别取线性关系项下的格列本脲、苯乙双胍、阿卡波糖对照
品和内标溶液重复进样5次,按峰面积计算RSD分别为1.96%,0.23%,1.16%。

3.3 重复性试验取中药粉末约0.3 g精密称定(相当于1粒胶囊)于25 ml量瓶中,按“样品测定”项下方法分别制备5份样品溶液,在该色谱条件下测定峰面积,结果格列本脲、苯乙双胍和阿卡波糖的峰面积RSD分别为1.36%2.24%,2.16%,表明方法的重现性好。

3.4 加样回收率试验精密称取中药粉末0.6195g(相当于2粒胶囊)于50 ml 量瓶中，加甲醇溶液25ml，充分振摇使溶解,加水稀释至刻度,摇匀。

过滤，弃取初滤液，分别取续滤液10 ml, 于3个25ml量瓶中, 其中一份加内标溶液用流动相稀释至刻度，摇匀，作为空白对照品溶液，另两份分别按线性方程中浓度范围，依次加入格列本脲、苯乙双胍和阿卡波糖三种组分及内标溶液，加流动相稀释至刻度，摇匀。

精取10μl注入液相色谱仪,记录峰面积,分别以格列本脲、苯乙双胍、阿卡波糖浓度与其峰面积和内标峰面积之比代入线性回归方程,计算加样回收率，测得格列本脲、苯乙双胍、阿卡波糖的平均回收率分别为
102.1%,98.6%,96.7%,RSD分别为2.0%,1.8%,1.5%(n=3)。

4 样品测定分别称取民间中药粉末、民间胶囊内容物、珍蛤降糖散约0.3g，精密称定，于2
5 ml量瓶中，加甲醇溶液15ml，充分振摇使溶解,加水稀释至刻度,摇匀。

过滤，弃取初滤液，取续滤液10 ml, 于25ml量瓶中,加内标溶液用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，以下操作同“回收率试验”,结果见表1。

表1中药降糖药中各组分的测定结果(n=3)
格列本脲X±RSD%苯乙双胍X±RSD%阿卡波糖X±RSD%民间中药粉 6.06mg/g±0.822.43mg/g±1.222.43mg/g±1.2民间中药胶囊0.84mg/粒±0.627.27mg/粒±1.68.01mg/粒±1.8珍蛤降糖散 2.91mg/粒±0.8 6.32mg/粒±1.3
5 讨论
5.1目前,文献报道[1]在降糖中药检测出西药成分文献较少,且采用的检测手段是TLC和HPLC。

本实验采用HPLC-PDAD分析技术[2]可获得检测样品的紫外-可见三维光谱-色谱图、色谱保留值和吸收光谱信息，从而为鉴定降糖中药制剂中是否含西药成分提供依据。

5.2本试验考察了流动相中醋酸盐缓冲液不同浓度(2、5、10、20mol﹒l-1)和不同的pH值(3.0、4.0、5.0、5.5、
6.0)对保留时间的影响, 结果:以流动相中醋酸盐溶液浓度10 mol﹒l-1,流动相pH为5.5为最佳。

5.3在同一色谱条件下同时分析阿卡波糖、苯乙双胍、格列本脲,文献尚未见报道,由于阿卡波糖、苯乙双胍、格列本脲等药物的极性相差较远，且中药成分复杂，因此，故选择梯度洗脱进行分析。

其结果可见阿卡波糖、苯乙双胍、格列本脲与中药能较好分离。

5.4内标物的筛选：本实验筛选替硝唑、对乙酰氨基酚等几十个内标物以格列吡嗪为最佳选择。

5.5阿卡波糖为末端吸收，苯乙双胍在234nm有最大吸收，格列本脲在211nm 及301nm有最大吸收,综合考虑各成分的紫外吸收曲线，选择234nm为检测波长。

5.6 因在中成药中擅自添加西药成分，并随意夸大疗效宣传，高价推销牟取暴利，是当前药品制假售假的新动向。

因此，本实验一方面为检查降糖中药是否含西药成分提供技术支持;同时2型糖尿病临床上常常需要两种或多种降糖药联合使用[3，4]，这也为临床一些糖尿病中毒病人及时抢救与治疗提供帮助。

[参考文献]
[1] 张穗，薛漓，张涛，等.降血糖和治鼻炎中成药中擅自添加西药的检测.中国药品标
准,2003,4(6):36-37.
[2] 孙毓庆,王延琮.现代色谱法及其在医药中的应用.北京.人民卫生出版社第1
版,1998.198-200.
[3] 张继春.降血糖药.见：汤光主编.现代药物学[M].北京：中国医药科技出版社，
1996:706-714.
[4] 杜小莉，张翠莲.降血糖新药-格列本脲和盐酸二甲双胍复合片.中国药学杂志，2002，
37（11）:869-871.。