一株用于青贮万寿菊的植物乳杆菌的分离、鉴定及发酵工艺研究

一株用于青贮万寿菊的植物乳杆菌的分离、鉴定及发酵工艺研
究
孙丹丹;陶正国;吴秀丽
【摘要】本研究分离鉴定了一种来源于青贮万寿菊的乳酸菌,并探索其发酵工艺.通过菌落形态、生理生化特性和16S RNA的序列分析,确定分离得到的为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),命名为ldr-1.在单因素实验基础上,采用响应面法优化发酵工艺条件,以碳源、氮源和起始pH值三者为响应因子,以活菌数为响应值,采用Box-Behnken模型进行三因素三水平的响应面实验设计.分析表明,该模型不显著,所以,单因素试验条件即为此三因素的最佳添加量.在发酵工艺为玉米蛋白粉15％,蛋白胨25％,起始pH6.0,30℃发酵16h后,活菌数可达到4.0×109 cfu/mL.经过海藻酸钠、氯化钙包被并冻干后,冻干存活率为84.95％,大大增加了对外界温度的稳定性.上述试验为ldr-1作为万寿菊青贮剂的开发应用奠定了基础.
【期刊名称】《广东饲料》
【年(卷),期】2013(022)007
【总页数】4页(P18-21)
【关键词】植物乳酸菌;发酵;青贮;万寿菊
【作者】孙丹丹;陶正国;吴秀丽
【作者单位】广州立达尔生物科技股份有限公司,广东广州510663;广州立达尔生物科技股份有限公司,广东广州510663;广州立达尔生物科技股份有限公司,广东广州510663
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
万寿菊（Tagetes erecta）为一年生菊科万寿菊属植物，是提取天然叶黄素的良好原料，在中国黑龙江、云南、内蒙古、山东等地大规模种植（凌关庭，2002；芦新友，2004）。

在收获万寿菊花后，放入发酵池，逐层均匀喷洒乳酸菌菌液和酶制剂，压实密封，使其快速发酵，再经过压榨、烘干、制粒、提取和浓缩，得到叶黄素树酯（郭书丛等，2006；张伟，2009）。

在上述过程中，万寿菊花青贮是必不可少的前处理过程，通过青贮，可有效保护鲜花中的色素含量，降解植物细胞壁，分离鲜花中阻碍提取的成分，使色素更易被萃取（李大婧等，2008）。

在万寿菊青贮中，乳酸菌起到举足轻重的作用，它能在发酵过程中迅速繁殖并产生大量乳酸和乙酸，抑制有害菌生长，防止鲜花腐烂、发霉，同时软化细胞壁，使以后的提取条件较为温和（兴丽等，2004）。

但是，目前青贮用乳酸菌的研究大多集中于玉米、紫花苜蓿等常见饲料原料，关于万寿菊青贮的研究不多，相应的产品市场上也只有零星数种，主要以进口产品为主。

本研究从青贮的万寿菊中分离得到一株乳酸菌，经16S RNA鉴定与序列比对，确定为植物乳杆菌，命名为ldr-1。

参考其它植物乳杆菌的发酵条件研究（陈琳，2011），根据单因素试验结果，建立三因素三水平的响应面模型，探索了植物乳杆菌生长所需的碳源、氮源、起始pH对活菌数的影响，确定了最佳发酵工艺，及后续乳酸菌包被冻干方法。

1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
植物乳杆菌，为本实验室从青贮万寿菊中分离得到；
克隆测序载体：pMD19-T simple vector；
细菌基因组提取试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；
胶回收试剂盒：瑞士Roche公司；
质粒提取试剂盒：美国Axygen公司。

1.2 试验设备
PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、高速离心机、发酵罐等。

1.3 试验设计
1.3.1 菌株分离
取青贮过的万寿菊，用接种针接入MRS培养基30℃培养36 h，取培养液在琼脂
平板上划线，静置培养。

如出现圆形稍扁平的白色菌落及其周围培养基变为白色或黄色者，初步定为乳酸菌。

获得单菌落，保藏并进一步鉴定。

1.3.2 菌株鉴定
1.3.
2.1 接触酶试验
挑取固体培养基上菌落，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。

于30 s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

阴性的菌株进行下一步
鉴定。

1.3.
2.2 16S RNA基因的扩增与序列分析
将菌种挑至MRS培养基中，30℃过夜培养，使用细菌基因组提取试剂盒提取细菌总DNA，电泳。

PCR 扩增体系：DNA 模板1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，2.5mM dNTPs 1.5μL，Easy A High-Fidelity PCR cloning Enzyme 0.3 μL,上游引物1 μL，下游引物1
μL，补ddH2O至20 μL。

PCR扩增条件：98℃预变性2min，94℃变性1 min，63℃退火 1 min，72℃延
伸 1 min 50 s，循环 28次。

根据DNA分子量标记Marker DL2000，切割琼脂糖电泳中相应的DNA条带，用Roche回收试剂盒纯化回收纯化。

PRC产物16℃连接pMD19-T simple载体30 min，转化大肠杆菌感受态细胞，挑抗性平板上长出的单克隆菌落，送至北京六合华大公司（广州）进行测序。

1.3.2.3 序列比对与分析
测序结果与GenBank中核酸数据库Blast进行检索，根据与已公布乳酸菌各种群16S rRNA序列的同源性分析，判断测试菌种的种群。

1.3.3 发酵工艺研究
1.3.3.1 单因素试验
碳源：以MRS培养基为基础培养基，以玉米蛋白粉作为碳源，添加量分别为10%、15%、20%、25%，接种量为1%，30℃培养16 h，培养后测定活菌数，确定碳源的最佳添加量。

氮源：以MRS培养基为基础培养基，以蛋白胨作为唯一氮源，添加量分别为15%、20%、25%、30%，接种量为1%，30℃培养16 h，培养后测定活菌数，确定氮源的最佳添加量。

起始pH：以MRS培养基为基础培养基，将培养基起始 pH 用醋酸钠调至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在600 nm条件下测定菌液的OD值，考察培养基起始pH值对乳酸菌生长的影响。

1.3.3.2 响应面法三因素三水平试验
采用三因素三水平响应面设计，对培养基碳源、氮源、起始pH值进行优化，得到最佳培养条件，具体试验设计见表1。

表1 响应面分析试验因素水平表因素编码水平-1 0 1大豆蛋白胨 x1 20% 25% 30%玉米蛋白粉 x2 10% 15% 20%醋酸钠 x3 0.2% 0.5% 0.8%
统计分析：采用SAS 8.0软件包中的one-way ANOVA过程对单因素试验的结果进行分析，均值的多重比较采用Duncan氏法进行，以P＜0.05作为差异显著性
判断标准；以Box-Behnken进程对响应面设计，进行二次响应面分析。

1.3.4 10 L发酵罐验证试验
配置发酵培养基于10 L发酵罐中，调整培养基的起始pH值为6.0，接种量为1%，30℃培养16h，培养过程中不通气，搅拌速度120 rpm/min，罐压0.03～0.05 MPa。

当pH值稳定后1 h，取样计数。

1.3.5 乳酸菌的包被冻干
将发酵液离心，混悬于适量生理盐水中，再将其加入2%的海藻酸钠溶液中，混匀；然后加入4%的氯化钙溶液中，搅拌；离心，收集沉淀，加入到1%的壳聚糖中，
离心收集，加入冻干保护剂，冷冻干燥。

1.3.6 细菌存活率的测定
吸取0.5 mL待测菌液用灭菌的生理盐水进行10倍梯度稀释，选择适当的稀释梯度，吸取200 μL菌悬液置于平板内，加入MRS混匀。

每个梯度作3个平行。

平
板在30℃培养16 h后，选择菌落数在30～300之间的平板计数。

2 结果与讨论
2.1 菌株鉴定
2.1.1 菌株分离与接触酶试验
从青贮的万寿菊培养液中，分离得到一株乳酸菌，经接触酶试验为阴性。

2.1.2 16S RNA基因的扩增
提取得到细菌总DNA，浓度为480 ng/μL，以此为模板经PCR扩增后连接到pMD19-T simple载体，随机挑取5个菌落，都出现阳性的对应条带。

结果如图
1所示。

图1 菌液PCR扩增情况
1-5号泳道：单克隆菌落；M：DL2000marker
2.1.3 序列比对与分析
所得序列信息与NCBI核酸数据库比对，发现与Lactobacillus plantarum WCFS1全基因序列的同源性最高，一致性为99.93%，仅有1331位一个碱基不同，可确定实验菌种为乳酸杆菌属的植物乳杆菌种，命名为ldr-1。

表2 不同比例的玉米蛋白粉对LAB生长的影响注：1、表中组别编号10,15,20,25表示玉米蛋白粉的添加量分别为10%、15%、20%、25%。

2、同列数据肩标不同大写字母者表示差异显著（P＜0.05）。

组别菌落数（×108cfu/mL）平均数10 2.5 2.633C 10 2.1 10 3.3 15 5.4 15 5.5 15 4.8 20 3.2 5.233BA 20 3.2 20 3.8 25 3.3 3.400BC 25 3.8 25 3.6 3.567B
2.2 发酵工艺研究
2.2.1 单因素试验
2.2.1.1 最佳玉米蛋白粉添加量
由表2所示，当玉米蛋白粉的添加量为15%时，所得活菌数为5.2×108cfu/mL，显著高于其他添加量组，即15%为玉米蛋白粉的最佳添加比例。

2.2.1.2 最佳蛋白胨添加量
由表3结果可知，当蛋白胨的添加量为25%时，所得活菌数为4.5×108cfu/mL 显著高于其他添加量组。

即25%为蛋白胨的最佳添加比例。

表3 不同比例的蛋白胨对LAB生长的影响注：1、表中组别编号15,20,25,30表示蛋白胨的添加量分别为15%、20%、25%、30%。

2、同列数据肩标不同大写字母者差异显著（P＜0.05）。

组别菌落数（×108cfu/mL）平均数15 3.3 3.2A 15 3.3 15 3.0 20 3.0 3.0A 20 3.3 20 2.6 25 4.7 4.5B 25 4.7 25 4.2 30 3.0 30 3.3 30 3.1 3.1A
2.2.1.3 最佳起始pH值
由图2可知，起始pH值过高或过低都对菌落生长有较大影响，当起始pH值为6.0-7.0时，菌落生长达到最大值，即最佳pH值为6.0。

表4 响应面分析试验结果试验号蛋白胨/% 玉米粉/% 醋酸钠/% X1 X2 X3 Y 1 20 10 0.50 -1 -1 0 22 2 30 10 0.50 1 -1 0 26.5 3 20 20 0.50 -1 1 0 14 4 30 20 0.50 1 1 0 25 5 20 15 0.20 -1 0 -1 14.35 6 30 15 0.20 1 0 -1 32 7 20 15 0.80 -1 0 1 27 8 30 15 0.80 1 0 1 29.5 9 25 10 0.20 0 -1 -1 24.5 10 25 10 0.80 0 -1 1 30 11 25 20 0.80 0 1 1 19.8 12 25 15 0.50 0 0 0 30 13 25 15 0.50 0 0 0 22 14 25 15 0.50 0 0 0 25.5 15 25 20 0.20 0 1 -1 36
2.2 2三因素三水平响应面试验
以活菌数为响应值，根据表4中Box-Behnken设计的试验结果，利用SAS软件对其进行二次回归分析，结果表明该模型不显著（P=0.1914），说明无法用该模型估计植物乳杆菌的生长情况。

根据以上试验结果，可以看出在试验设计范围内，大豆蛋白胨、玉米蛋白粉与醋酸钠之间并无显著的交互作用，而且不同添加量之间，活菌数差异不显著。

所以，单因素试验条件可视为此三因素的最佳添加量。

图5 包被后乳酸菌形态
2.3 10L发酵罐验证试验
根据单因素的最佳条件，使用下述试验条件进行发酵：玉米蛋白粉15%，蛋白胨25%，起始pH 6.0，此外培养基中添加硫酸镁、硫酸锰等微量物质，30℃发酵16 h后，活菌数可达到4.0×109cfu/mL。

因为发酵罐可控制在培养过程中不通空气，并能流加适量碱液，在发酵过程中调节pH值，因此发酵罐试验得到的活菌数比单因素摇瓶试验提高了一个数量级。

2.4 乳酸菌的包被冻干
乳酸菌经过包被后，由短杆状变为透明球状，包被率高，见图5所示。

经包被离心，在冻干之前乳酸菌活菌数为3.169×1010cfu/g，冻干之后活菌数为
2.692×1010cfu/g，存活率为84.95%。

经过包被的乳酸菌提高了对温度的稳定性。

3 结论
本试验从青贮万寿菊中分离鉴定一株植物乳杆菌，通过发酵工艺优化，确定植物乳杆菌的最佳发酵培养基配方为：玉米蛋白粉15%，蛋白胨25%，起始pH6.0，此外还添加硫酸镁、硫酸锰等微量物质。

在30℃发酵16h后，活菌数可达到
4.0×109cfu/mL。

乳酸菌经过包被和冻干工艺，稳定性大大增加，试验表明在40℃处理48 h后，
存活率仍为100%，并可在室温下较长时间放置而不失活，从而克服了如路途遥远、活菌数不足、使用地区条件差等因素的制约，为万寿菊青贮剂的推广应用提供了现实依据。

【相关文献】
[1]陈琳，孟祥晨.响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件[J].食品科学，2011,32(3)：
176-180.
[2]李大婧，刘春泉，方桂珍.万寿菊花酶助青贮工艺及其酶活性分析[J].农业工程学报，2008,24(7)：237-241.
[3]凌关庭.可供开发新型食品添加剂III：万寿菊色素及其生理功能[J].粮食与油脂，2002(12)：44-46.
[4]芦新友，侯飞，周永强等.北江垦区色素万寿菊高产加工技术[J].中国农机推广，2004,2：53-54.
[5]郭书丛，王雨，张慧等.自万寿菊花中提取叶黄素树脂的研究[J].粮油加工与食品机械，2006,1：86-89.
[6]兴丽，韩鲁佳，刘贤等.乳酸菌和纤维素酶对全株玉米青贮发酵品质和微生物菌落的影响 [J].中国农业大学学报，2004,9(5)：38-41.
[7]张伟，唐晓丹，张静.万寿菊提取物中高纯度叶黄素反应条件的研究[J].特产研究，2009,31(3)：40-42.。