湖南柑橘果皮总黄酮及橙皮苷含量分析

引用格式：刘嘉丽，刘德明，王丹，等.湖南柑橘果皮总黄酮及橙皮苷含量分析[J].湖南农业科学，2020 ( 11 ):58-62.
DOI：10.16498/ki.hnnykx.2020.011.016
湖南柑橘果皮总黄酮及橙皮苷含量分析
刘嘉丽\刘德明2,王丹\张鸿\董新荣\童建华3
(1.湖南农业大学化学与材料科学学院，湖南长沙410128; 2.湖南农业大学资源环境学院，
湖南长沙410128; 3.湖南农业大学生物科技学院，湖南长沙410128)
摘要：以橙皮苷标准品为对照样品，采用UV直接比色、NaNO2-Al(N〇3)3-NaOH显色和碱显色3种方法测定了湖南地区柑橘果皮中总黄酮的含量；以橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷混合标准品为对照样品，采用HPLC分析了湖南地区柑橘果皮中3种成分的含量。

结果表明：湖南柑橘果皮含有丰富的黄酮类物质；研究采集的湖南柑橘果皮样品中不含柚皮苷和新橙皮苷，但含有较髙含量的橙皮苷，含量达到果皮干重的2.5~7.2%。

因此，湖南所产的柑橘果皮是良好的橙皮苷资源。

关键词：柑橘果皮；湖南；总黄酮；橙皮苷；紫外-可见分光光度法；HPLC法
中图分类号：TS255.1 文献标识码： A 文章编号：1006-060X (2020 ) 11-0058-05
Analyses of the Contents of Total Flavonoids and Hesperidin in Citrus Peel LIU Jia-li1，LIU De-ming2，WANG Dan1，ZHANG Hong1，DONG Xin-rong1，TONG Jian-hua3
(1. College of Chemistry and Materials Science, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. College of R esources
and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 3. College of B ioscience and Biotechnology,
Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC)
Abstract：Using the hesperidin standard as the control, the content of total flavonoids in various citrus peels from Hunan was determined by three methods including UV-Vis spectrophotometry, NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetry and alkali colorimetry. Then using the mixture of hesperidin, neohesperidin and naringin standards as the control, the contents of hesperidin, neohesperidin and naringin in these citrus peels were measured by HPLC method. The results showed that the citrus peel samples from Hunan were rich in flavonoids, but did not contain naringin and neohesperidin. Hesperidin content was relatively high, accounting for 2.5-7.2% of the dry weight of pericarp. Therefore, citrus peels from Hunan are a good resource of hesperidin.
Key words ：citrus peel; Hunan; total flavonoids; hesperidin; UV-Vis spectrophotometry; HPLC
中国是世界柑橘产量大国，2018年全国种植面 积达到260万hm2,产量达到4 138.1万t[1]。

国内柑 橘的消费主要为鲜食（55%)榨取果汁及罐头加工 (35°%~40%) [2]，其中加工将产生占鲜重45%~60%的柑橘皮渣[3]。

柑橘果皮富含黄酮类化合物[4]，有文献 报道柑橘果皮黄酮主要为多甲氧基黄酮[5-6]，也有研 究[7-11]认为主要成分为橙皮苷。

橙皮苷(hesperidin)是一种二氢黄酮苷，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心 血管等药理活性[12]。

橙皮苷在食品工业中，可用作抗 氧化剂、食品添加剂、果蔬高效抗氧保鲜剂等[13]。

橙皮苷主要从枳实中提取分离，国际市场前景广阔。

枳实为芸香科植物酸橙（L.)及其栽培 变种的干燥未成熟果实[14]。

由于产量有限，近年来枳 实的市场价格暴涨，寻求新资源成为人们关注的热点。

收稿日期=2020-07-30
基金项目：湖南农业大学国家新农村发展研究院特色产业基地项目 (2018xny-tc007)
作者简介：刘嘉丽（2001—），女，湖南衡阳市人，本科生，专业 为应用化学。

通信作者：刘德明
分光光度法具有仪器易得、操作简单、测定快速 等特点[15-16]，在柑橘果皮提取物及应用的研究中广泛 使用[17-20]。

因样品显色方式不同，分光光度法又嗑分 为U V直接比色法、碱显色比色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色比色法等。

但是从植物提取物中分析单一 化合物含量最有效的方法是HPLC法[21-22]。

前期比较 了橙皮苷（对照样品）与柑橘果皮提取液在不同显 色方法下的紫外-可见光谱的最大吸收峰波长，认为 直接比色法和碱液显色比色法适用于总黄酮的检测，与伍长春等™的研究结果一致。

但考虑到NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法为黄酮含量测定的通用方法，故将该方法一起进行比较；另外，采用HPLC法测定 了柑橘果皮中橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷的含量，以期为柑橘果皮的资源化综合利用提供依据。

1材料与方法
1.1材料与试剂
供试柑橘果皮的产地、采摘时间及品种名称等信 息见表1，所用橙皮苷（批号为P06D9F77001，HPLC 含量身98%)新橙皮苷（批号为Z31J6L2067,HPLC
含量身98%)、柚皮苷（H24N9Z75869，HPLC含量身98%)购于上海源叶生物科技有限公司，甲醇为 HPLC级试剂，其余为分析纯，试验用水为蒸馏水。

主要仪器：UV-9600紫外可见分光光度计（北京 北分瑞利分析仪器集团有限公司），KQ300-D E型数控 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TDL80- 2B离心机（上海安亭科学仪器产），TP-520A电子天 平（湘仪天平仪器设备有限公司），HWS-28型电热恒 温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），ATY124电 子天平（SHMADZU)，岛津LC-20A T高效液相色谱仪（日本岛津公司)。

1.2试验方法
1.2.1样品溶液制备称取柑橘果皮样品粉末0.5 g，加入20 m L甲醇，在210 W的功率下超声提取30 min。

过滤，收集滤液。

滤渣再用同法提取一次。

合并 2次滤液，用甲醇定容至50 mL。

溶液以2 500 r/m m 离心10 mm。

离心液置4灯诸存备用。

1.2.2U V直接比色分折方法（1)对照品溶液制备。

精密称取橙皮苷对照品5.4 mg，用甲醇溶解[12]，定容 于50 m L容量瓶中，得橙皮苷对照品储备液，浓度为 0.108 mg/mL。

（2)标准曲线绘制。

吸取橙皮苷对照品 储备液0.5、1、1.5、2和2.5 m L于10 m L带塞比色管中，用甲醇定容，摇勻。

于282 nm下测定吸光值。

以橙皮苷浓度（mg/L)对吸光度A绘制标准曲线。

（3 )样品测定。

精密量取样品溶液0.1 m L，置于10 m L容 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇勻。

按上法测定吸光值，以橙皮苷为标样计算总黄酮含量。

1.2.3NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色比色法（1)标 准曲线绘制。

吸取橙皮苷对照品储备液0.5、1、1.5、2和2.5 m L于10 m L带塞比色管中，加入0.5 mol 5%NaNO2溶液，放置5 min。

再加10%Al(NO3)3溶液 0.5 mL，放置 5 min。

再加 5%NaOH试液 2.5 mL，用 去离子水定容至刻度线，摇勻，常温下显色15 mm。

于346 nm下测定吸光值。

以橙皮苷浓度（mg/L)对 吸光度A绘制标准曲线。

（2)样品测定。

精密吸取50卟各样品溶液，置于10 m L比色管中，按上法操 作测定吸光值，以橙皮苷为标样计算总黄酮含量。

1.2.4喊显色比色法（1)标准曲线绘制。

吸取橙皮 苷对照品储备液1、1.5、2、2.5和3 m L于10 m L带 塞比色管中，加入0.5 mL 10%NaOH溶液，用水稀释 至刻度线，在60T下水浴显色30 mm，流水冷却至室 温，摇勻。

于360 nm波长下测定吸光值。

以橙皮苷 浓度（mg/L)对吸光度A绘制标准曲线，得到线性回归方程。

（2)样品测定。

精密量取不同样品溶液0.2 mL，置于10 m L比色管中，按上法操作测定吸光值，以橙皮苷为标样计算总黄酮含量。

1.2.5HPLC 法（1)液相色谱条件：InertSustain-C18色谱柱（250 mm x4.6 mm，5卿）；流动相A为0.1°/。

磷酸/水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件为0~ 25.00 min20%B，25.00~25.10 min20%~100% B，25.10~ 27.00 min 100%B，27.00〜27.10 min20%B，27.10〜32.00 min20%B ;流速 1.0 mL/min ;柱温 35T；;检测 波长283 nm ;进样量10卟。

（2 )标准曲线绘制。

配 制系列浓度的橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷混合对照样 品溶液，在色谱条件下测定，以浓度（mg/L)对峰面 积绘制标准曲线。

（3)样品测定。

按上法操作测定峰 面积，以标准曲线计算指标成分含量。

2结果与分析
2.1不同显色方法测定柑橘果皮总黄酮的最大波长和线性方程
在200〜900 nm波长范围内对橙皮苷及样品的甲 醇溶液、碱显色溶液、NaN〇2-Al(N〇3)3-NaOH显色溶液进行波长扫描，3种方法的最大吸收波长分别为 282、360和346 nm。

在最大吸收波长下，峰型对称 性及吻合性较好，适合进行含量测定。

在282 nm下直接比色测定时，橙皮苷的浓度在 5.4~21.6 mg/L范围内与吸光度具有良好的线性关系，线性回归方程 A=0.015 3+0.031 39 Q (记=0.999，《=5 )。

碱显色法在360 nm波长下测定时，橙皮苷的浓度在 4.4〜22.0 mg/L范围内与吸光度具有良好的线性关系，线性回归方程為=-0.006 8+0.013 86C2(炉=0.999,)。

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色在 346 nm波长下，橙皮 苷的浓度在8.8〜26.4 mg/L范围内与其吸光值具有良好 的线性关系，线性回归方程A3=-0.064 5+0.049 93 C3 (尺2=0.995，n=5)。

2.2不同显色方法测定总黄酮含量的差异性
由表1可知，显色方法对柑橘果皮中总黄酮的分析结果有影响。

这与柑橘果皮中的次生代谢产物结 构有关。

U V直接比色法是在282 nm波长下测定的吸 光度，从分子结构来看，很多酚酸类在此波长下都会 有吸收峰。

因此，U V直接比色法实际上测定的是提 取物中酚酸类化合物的含量。

NaN〇2-Al(N〇3)3-NaOH 比色法测定的原理是含有邻位羟基（或羰基）结构的 物质与Al3+形成配合物而显色。

因此，该方法实际上测定的是具有这种结构的多酚或者黄酮化合物的含 量。

而碱显色法测定的原理是利用二氢黄酮在碱性条 件下转化为查尔酮显橙色，具有特殊的吸收波长。

理 论上来说，此法测定的是二氢黄酮的含量。

但是，黄 酮类化合物的分子中含有邻二酚羟基或者3,4’-二羟 基取代时，在碱液中不稳定，易被氧化而颜色由黄变 深红色[23]，对查尔酮的含量测定产生影响，这是否是 测定结果偏高的原因，还有待进一步探讨。

总之，文 献中常用的比色法测定植物提取物中黄酮类化合物的
表1柑橘果皮中总黄酮的含量
编号品名产地
米摘时间
(年-月-日）UV法
比色法总黄酮含量（％)
NaNO厂Al(N〇3)3-NaOH碱法
1柑橘皮（早熟，晒干）澧县2019-10-1511.869.5014.68 2柑橘皮（早熟，60°烘干）澧县2019-10-1515.1011.7017.57 3脐橙皮（晒干）澧县2019-10-15 6.79 6.919.87 4脐橙皮（60°烘干）澧县2019-10-157.197.399.95 5柑橘皮早熟澧县2019-11-227.38 5.708.17 6柑橘皮中熟澧县2019-11-228.109.8911.83 7柑橘皮迟熟澧县2019-11-2210.327.2212.70 8南丰蜜橘皮澧县2019-11-2210.5312.6614.14 9脐橙皮澧县2019-11-228.407.589.75 10柑橘皮津市2019-10-1510.598.7712.45 11柑橘皮郴州2019-10-1515.389.7918.49 12柑橘皮慈利2019-10- 157.628.2310.61 13柑橘皮宁远2019-10-1514.3116.2416.65 14柑橘皮安乡2019-10-1512.909.0115.08注：表中未注明干燥方式的，均为晒干
含量时，均是相对比较的、一大类结构相似化合物的 但是，3种方法测定的结果均提示湖南柑橘果皮含有总量。

虽然不同方法测定总黄酮含量的结果存在差异，丰富的黄酮类化合物，具有综合利用价值。

图1H PLC色谱图
(A:混合对照样品；B:1号柑橘果皮样品；C，3号脐橙果皮样品）
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 14
样品编号
图2 H PLC 法测定不同样品的橙皮苷含量
(图中1~14即表1中的样品编号）
能因品种、产地及采摘时间不同而存在差异。

因此， 柑橘果皮作为橙皮苷的资源利用时，需要对品种、产 地及采摘时间进行综合考察，以获得最好的橙皮苷原 材料。

参考文献：
[1] 中华人民共和国国家统计局.中国统计年鉴[M].北京：中国统计 出版社，2019.
[2] 单杨.我国柑橘工业现状及发展趋势[J].农业工程技术（农产品 加工业），2014 (4) : 13-17.
[3]
罗巧慧，黄艳玲，肖芳，等.柑橘皮渣在动物饲料中应用的研 究进展[J].动物营养学报，2018, 30 ( 3 ): 874-880.
[4] Yi L Z ，Ma S S ，Ren D B. Phytochemistry and bioactivity of Citrus
flavonoids ： a focus on antioxidant ，anti-inflammatory ，anticancer and cardiovascular protection activities[J]. Phytochemistry Reviews ，2017, 16 (3)： 479-511.
[5] Chen X M ，Tait A R ，Kitts D D . Flavonoid composition of orange peel
and its association with antioxidant and anti-inflammatory activities[J]. Food Chemistry ，2017，218 ： 15-21.[6] Xu Y ， Lv X ， Yang G L ， et al. Simultaneous separation of six
pure polymethoxyflavones from sweet orange peel extract by high
performance counter current chromatography[J]. Food Chemistry ， 2019， 292 ： 160-165.[7] Nipornram S ，Tochampa W ，Rattanatraiwong P ， et al. Optimization
of low power ultrasound-assisted extraction of p henolic compounds from mandarin (Citrus reticulata Blanco cv. Sainampueng) peel[J]. Food Chemistry ，2018，241 ： 338-345.[8] Hayat K ，Zhang X M ，Chen H Q ，et al. Liberation and separation of phenolic compounds from Citrus mandarin peels by microwave heating and its effect on antioxidant activity[J]. Separation and Purification Technology ，2010，73 ( 3 ) ： 371-376.
[9] M’hiri N ，Ioannou I ，Ghoul M ，et al. Phytochemical characteristics of
Citrus peel and effect of conventional and nonconventional processing on
phenolic compounds ： a review[J]. Food Reviews International ， 2017， 33 (6) ： 587-619.[10] 宋玉鹏，陈海芳，谭舒舒，等.不同陈皮来源药材中橙皮苷、川 陈皮素、橘皮素和辛弗林的含量比较[J].时珍国医国药，2017, 28 (9) ： 2061-2064.[11] 刘荣，韦正，樊丹青，等.不同栽培品种橘皮中主要活性成
2.3影响甜橘果皮总黄酮含量的因素分析
柑橘的品种、产地、采摘时间均影响果皮中总黄
酮的含量（表1)。

首先，柑橘品种。

同一产地（澧县) 的柑橘皮总黄酮含量明显高于脐橙皮总黄酮的含量， 柑橘早熟品种与迟熟品种的果皮总黄酮含量也存在差 异（但与采摘时间有关)。

第二，采摘时间。

1号样品 和5号样品为同一品种柑橘，1号样品于10月中旬 采摘，是早熟品种刚好成熟的时期，而5号样品于11 月下旬采摘，这个时期对于早熟品种来讲果实过于成 熟了。

1号果皮的总黄酮含量明显高于5号样品，表 明果实在适宜采摘时期总黄酮含量较高，过晚采摘会 降低果实总黄酮的含量。

第三，果皮干燥方式。

柑橘 果皮60T 烘干样品（2号）的总黄酮含量明显高于晒 干样品（1号)。

60T 干燥的时间短，而10月中旬的 太阳温和，干燥时间长，可能引起黄酮化合物的氧化 分解。

但干燥方式对脐橙果皮中总黄酮的含量影响小 于柑橘果皮，这可能与脐橙果皮和柑橘果皮所含的二 次代谢产物结构不同有关。

2.4 H P L C 法测定柑橘果皮中的橙皮苷含量
植物提取物一般为多种结构与溶解性类似的混合
物，HPLC 分析技术在混合物单一成分的定量分析中 展现出极大的优势。

进一步以橙皮苷、新橙皮苷及柚 皮苷为对照样品，通过HPLC 色谱条件的优化，有效 实现了柚皮苷与橙皮苷的基线分离，混合对照样品及 柑橘果皮提取物的HPLC 色谱图如图1所示，图1A 中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的相对保留时间分别为 17.362、19.460、23.331 min 。

按1.2.5的色谱条件，橙皮苷浓度在18.50~129.50 mg/L 范围内，积分面积（y )与浓度（x )具有良好线 性关系，线性方程为尸20 140.2X -3 488.16 (记=0.999 9, n =5 )。

如图1B 和C 所示。

湖南柑橘果皮样品主要含有 橙皮苷，不含新橙皮苷及柚皮苷。

这与一些相关报道 的国内柑橘果皮中橙皮苷含量高的结果基本一致。

2.5影响柑橘果皮橙皮苷含量的因素分析
如图2所示，柑橘果皮中橙皮苷的含量也明显高
于胳橙和南丰蜜橘皮，柑橘果皮中橙皮苷的含量最高
可到果皮干重的7%左右；同时，柑橘果皮中橙皮苷 的含量还因产地及采摘时间（如1号样品明显高于5 号样品）而存在差异。

3
结论
紫外-可见分光光度法的测定结果表明，湖南柑 橘果皮含有丰富的黄酮类物质。

HPLC 分析结果表明， 湖南柑橘果皮样品不含柚皮苷和新橙皮苷，橙皮苷的 含量最高可达到果皮干重的7%左右，是良好的橙皮 苷资源。

同时，柑橘果皮中总黄酮和橙皮苷的含量可
876543
2
1
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如坰甸
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分的动态积累[J]■中国实验方剂学杂志，2014, 20 ( 15) :111-117.
[12] 钱俊臻，王伯初.橙皮苷的药理作用研究进展[J].天然产物研究与
开发，2010, 22 ( 1 ): 176-180.
[13] 朱思明，于淑娟，扶雄.橙皮苷提取方法的研究[J].食品研究与
开发，2009, 30 (7):17-20.
[14] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2015版一部[M].北京：
中国医药科技出版社，2015.
[15] 池玉梅，居羚，邓海山，等.分光光度测定总黄酮法的适用性[J].
分析化学，2010，38 (6):893-896.
[16] 刘文丽，于鲁海，马燕.紫外分光光度法在黄酮类化合物含量
测定中的应用[J].新疆中医药，2006, 24 (3):85-86.
[17] 王建壮，吕华冲.比色法测定龙血竭总黄酮含量[J].中国实验方剂
学杂志，2013，19 ( 16): 55-58.
[18] 伍长春，彭晓俊，梁伟华，等.陈皮总黄酮含量5种分光光度法
对比[J].时珍国医国药，2018，29 (3 ): 574~576.
[19] 文赤夫，赵凯，康练常，等.双水相技术在萃取橙皮苷中的应用[J].
食品科学，2009, 30 (22): 71-73.
[20] 黄芳，周宏，陈华，等.橘皮中橙皮苷提取的优化及其对羟
自由基清除作用[J].食品与发酵工业，2012 , 38 ( 5): 223-227, 231.
[21] 黄爰华，曹骋，曾元儿，等.HPLC法测定不同规格酸橙枳实
中新橙皮苷和柚皮苷的含量[J].药物分析杂志，2009, 29 (9):
1448-1450.
[22] 梁远园，冯彪，祝晨藤，等.HPLC法测定枳实药材中橙皮苷与
柚皮苷的含量[J].中药新药与临床药理，2006，17 ( 5): 359-361. [23] 吴立军.天然药物化学（第6版）[M].人民卫生出版社，2011.
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