乳山湾近海沉积物潜在硝化速率的测定

乳山湾近海沉积物潜在硝化速率的测定
贺惠;甄毓;米铁柱;于志刚
【摘要】In this paper, dissolved inorganic nitrogen (DIN) contents declined significantly when potential nitrification rates (PNR) were measured in sediments from adjacent waters of Rushan Bay, which indicated DIN loss occurred during cultivation, and the ratio of dissolved inorganic nitrogen loss to nitrification content ranged from 2.72% to 40.02%. Moreover, the expressions of copper-containing nitrite reductase gene (nirK) were analyzed with real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and the results showed that the gene expressed in both ammmonia-oxidizing archaea (AOA) and aerobic ammonia-oxidizing bacteria (AOB), and nitrifier denitrification was one of the reasons that led to DIN loss. PNR would be underestimated if only nitrate and nitrite concentrations were taken into account. For station C0 and C2, total PNR considered ND was 15.9 and 22.1 times of that not considered ND, respectively; and PNR of AOA considered ND was 22.3 and 46.1 times of that not considered ND, respectively. Therefore, DIN loss should be considered when PNR in sediments from adjacent waters of Rushan Bay were calculated.%在测定乳山湾近海沉积物潜在硝化速率(PNR)的过程中发现,培养前后溶解无机氮(DIN)含量显著下降,表明体系中存在DIN损失,且损失的溶解无机氮含量与硝化总量的比值为2.72%~40.02%.进一步通过实时荧光定量PCR技术测定培养过程中亚硝酸盐还原酶基因(nitrite reductase gene,nirK)的表达情况,发现氨氧化古菌(AOA)和好氧氨氧化细菌(AOB)均有nirK基因的表达,表明硝化微
生物的反硝化过程(ND)是导致无机氮损失的原因之一.若仅根据测得的硝酸盐和亚硝酸盐浓度估算乳山湾近海沉积物的潜在硝化速率会低估PNR(C0和C22个站位,考虑ND过程得到的总PNR分别是未考虑ND过程的15.9倍和22.1倍,而对于AOA的PNR则是22.3倍和46.1倍),因此在计算时,必须将体系中损失的无机氮计算在内.
【期刊名称】《中国环境科学》
【年(卷),期】2017(037)003
【总页数】7页(P1082-1088)
【关键词】乳山湾;潜在硝化速率;硝化微生物的反硝化过程;亚硝酸盐还原酶
【作者】贺惠;甄毓;米铁柱;于志刚
【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛 266003;中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东青岛 ,266100;青岛海洋科学与技术国家实验室,海洋生态与环境科学功能实验室,山东青岛, 266071;中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东青岛 ,266100;青岛海洋科学与技术国家实验室,海洋生态与环境科学功能实验室,山东青岛, 266071;中国海洋大学环境科学与工程学院,山东青岛 ,266100;中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东青岛 ,266100;青岛海洋科学与技术国家实验室,海洋生态与环境科学功能实验室,山东青岛, 266071;中国海洋大学环境科学与工程学院,山东青岛 ,266100;青岛海洋科学与技术国家实验室,海洋生态与环境科学功能实验室,山东青岛, 266071;中国海洋大学海洋化学理论与教育部重点实验室,山东青岛 ,266100
【正文语种】中文
【中图分类】X55;Q89;Q938.1
沉积物潜在硝化速率(potential nitrification rates, PNR)是表征好氧氨氧化微生物硝化作用的重要化学指标.潜在硝化速率的测定方法主要有15N同位素法[1]和培养法[2-3],其中培养法由于方法简单易于施行,是最常用的测定方法[4-5].潜在硝化速率可以比较不同环境样品中微生物将铵盐转化为硝酸盐的最大硝化能力,反映微生物的丰度和活性[6-7].通过添加氨苄青霉素抑制氨氧化细菌的活性,可以进一步区分氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化细菌(aerobic ammonia-oxidizing bacteria, AOB)在硝化作用中的相对贡献,如 Zheng等[4]通过测定长江口潮间带沉积物的PNR推测该环境中的氨氧化过程主要由AOA推动. 硝化作用是氮素循环的重要过程,不仅影响铵态氮的转化,同时也与过量氮素导致的水体富营养化和温室气体N2O释放等环境问题直接相关[8].随着技术手段的不断进步,越来越多的研究表明好氧氨氧化微生物在进行氨氧化的同时也存在反硝化过程[9-10],即硝化微生物的反硝化作用(nitrififer denitrification, ND).该过程能将亚硝酸盐转化为N2O等气体,导致培养体系中氮元素损失.然而,关于硝化微生物的反硝化作用对测定和计算潜在硝化速率的影响鲜见报道.
乳山湾位于山东半岛,为一半封闭的浅水海湾,是重要的经济贝类养殖区.随着近年来工农业和养殖业的发展,大量氮、磷营养盐的输入使得乳山湾近海水质环境发生了一系列变化,富营养化趋势明显,2008年该海域暴发了海洋卡盾藻(Chattonella marina)为主要原因种的赤潮[11].基于以上考虑,本研究选择受人类活动扰动大、富营养化现象突出的乳山湾为研究海域,通过实时荧光定量PCR技术和潜在硝化速率模拟培养实验,对硝化微生物的反硝化过程进行研究,为准确计算该海域沉积物潜在硝化速率提供依据.
1.1 样品采集
2015年2月采集乳山湾邻近海域表层沉积物样品,采样站位为C0站(121.47°E,
36.74°N)和C2站(121.49°E, 36.66°N) (图1).沉积物样品置于4°C低温保存,立即带回实验室进行潜在硝化速率测定的培养实验.
1.2 潜在硝化速率测定
按照 Bernhard等[3]的方法测定潜在硝化速率.取1.0g沉积物加入30mL配制的水样(现场海水经0.22μm滤膜过滤后,加入NH4Cl和KH2PO4使其终浓度分别为300,60μmol/L)中,黑暗条件下连续振荡培养,每个样品设置 3个平行培养
组.0,1,2,3d分别取样、离心、过滤,水样于-20°C保存,用于NH4-N、NO3-N和NO2-N的测定.共设置2个培养组,一组加入1.0g/L氨苄青霉素[4],抑制AOB活性,计算AOA的PNR;另一组不添加氨苄青霉素,计算AOA与AOB的PNR之和,两组相减即为AOB的PNR.
1.3 沉积物微生物RNA提取
培养过程中于第0,1,2,3d分别取沉积物样品2.0g,置于液氮中保存.利用 RNA PowerSoil®Total RNA Isolation kit(MOBIO,USA)提取沉积物中微生物总 RNA,以 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche,Germany)将RNA反转录为cDNA.将得到的cDNA置于-80℃保存.
1.4 nirK基因质粒标准曲线的建立及样品测定
利用引物分别扩增AOA和AOB nirK基因(表1).PCR产物经电泳分离,检测目的条带.将目的条带纯化、连接到pMD18-T载体(宝生物,大连)后转化到Escherichia coli Trans 5α感受态细胞中,通过蓝白斑筛选含有目的基因片段的阳性克隆.快速质粒小提试剂盒(康为,北京)制备质粒后,送测序公司测序(华大基因,北京).用超微量紫外分光光度计(Picodrop,UK)测定重组质粒的浓度,计算重组质粒的拷贝浓度.将得到的质粒 10倍梯度稀释后于-80℃保存,用于构建定量 PCR体系的标准曲线.
以梯度稀释的质粒标准品为模板,利用FastStart Universal SYBR Green
Master(ROX)试剂盒(Roche,Germany)在ABI 7500实时荧光定量PCR仪
(Applied Biosystems,USA)上进行检测,反应体系中加入0.20μg/μL牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)[14].退火温度如表1.每个质粒浓度3个平行样,实验体系中同时添加阴性对照.以质粒拷贝数对数值为横坐标,Ct值为纵坐标,绘制标
准曲线.
样品测定时,定量PCR的体系和条件与标准曲线相同,实验体系中同时包括阳性对照和阴性对照,每个样品测定3个平行样.通过标准曲线换算样品中nirK基因的拷贝数.
2.1 培养过程中溶解无机氮含量的变化
硝化过程中好氧氨氧化微生物经氨氧化过程将铵盐氧化为亚硝酸盐后,亚硝化细菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐在培养的3d内,硝酸盐和亚硝酸盐含量持续上升,而铵盐含量下降(图 2),说明硝化过程一直进行.若仅考虑硝化过程,根据物质的量守恒,任意时刻者物质的量之和恒定,即溶解无机氮含量应保持不变.而在本研究中,溶解无机氮含量随培养时间逐渐降低,表明培养过程中存在无机氮损失,可能存在由无机氮向有机氮的转化,或者产生气体从系统中逸出,即发生了反硝化过程.
计算无机氮损失量与硝化总量的比值发现(图 3),该比值较高.由此表明,计算潜在硝化速率时无机氮的损失量不可忽略.在潜在硝化模拟培养条件下,导致无机氮损失的生物过程主要有好氧反硝化过程和硝化微生物的反硝化过程等.
2.2 硝化微生物的反硝化过程中nirK基因表达量的变化
对含有目的基因的质粒标准品进行定量PCR反应后,得到不同质粒浓度对应的 Ct 值.以质粒拷贝数的对数值为横坐标,Ct值为纵坐标计算回归方程.AOA nirK基因的回归方程为y=-3.230x+38.511,回归系数 r=-0.999;熔解曲线只在78.1℃处有一单峰出现,说明qPCR反应过程中无引物二聚体或其他非特异性扩增.AOB亚硝化单胞菌属Nitrosomonas nirK基因的回归方程为y=-3.179x+37.569,回归系数 r=-0.998;熔解曲线只在81.6℃处有一单峰出现,说明qPCR反应过程中无引物二聚体或其他非特异性扩增.
cDNA定量结果显示,培养过程中 AOA和AOB的nirK基因均有表达(图4).未添加氨苄青霉素组,C0和C2 2个站位AOB亚硝化单胞菌属Nitrosomonas nirK 基因的表达量分别为(1.1×103)～(2.8×103)copies/g和(9.4×102)～(1.9×103) copies/g,并随时间呈现缓慢增加的趋势;AOA nirK 基因的表达量分别为
(4.5×105)～(4.1× 106)copies/g和(5.1×105)～(3.4×106)copies/g,且分别在第2d和第3d达到最大值.
添加氨苄青霉素组,C0和 C2 2个站位中AOA nirK 基因表达量分别为(5.0×105)～(2.3× 106)copies/g和(1.2×106)～(2.4×106)copies/g,在第2d达到最大值. 2.3 潜在硝化速率分析
潜在硝化速率的计算分别采用2种方法.方法 1是通过测得的硝酸盐和亚硝酸盐增加量计算PNR(以N/g沉积物计,式1).
式中:ΔC(NO3+NO2)表示测得的硝酸盐和亚硝酸盐含量的变化值,μmol N;t表示培养时间,d.
方法2则是在方法1的基础上,考虑无机氮的损失(损失的溶解无机氮)计算PNR(以N/g沉积物计,式2).
式中:ΔCDIN表示培养过程中溶解无机氮含量变化值的绝对值,μmol N.若整个系统没有无机氮的损失,则ΔCDIN为零,与式(1)的结果一致.
表层沉积物的潜在硝化速率如图5所示.若不考虑反硝化过程的存在,即实际生成的硝酸盐和亚硝酸盐没有损失时,由式(1)计算PNR,C0和C2两个站位的总潜在硝化速率分别为0.019和0.018μmol N/(d·g沉积物),添加氨苄青霉素组抑制细菌活性后得到的AOA的PNR分别为0.008和0.006μmol N/(d·g沉积物),差减得到AOB的PNR分别为0.011和0.012μmol N/(d·g沉积物).若将硝化微生物的反硝化过程考虑在内,根据式(2)校正DIN损失后,C0和C2两个站位的总PNR分别为0.295和0.398μmol N/(d·g沉积物),AOA的PNR分别为0.174和0.290μmol
N/(d·g沉积物),AOB的 PNR分别为 0.121和0.108μmol N/(d·g沉积物).
通常在计算潜在硝化速率时有以下几个方面的假设条件:(1)培养体系中不存在有机氮和无机氮间的相互转化(氨化作用与氨同化作用),(2)培养过程中不存在反硝化过程,(3)硝化过程不受铵盐及其它营养元素的限制.通过设置适宜的培养时间、避光抑制光合作用以及较高的氨氮浓度,可基本满足第1个和第3个条件;而对于第2个假设,早期的研究中认为通过搅拌充气等措施,将培养体系保持在富氧状态,即可避免反硝化过程.近年来有研究表明,好氧反硝化过程和硝化微生物的反硝化过程都能在有氧条件下将亚硝酸盐转化为N2O或N2等气体[9,15-16],使得这一问题变得复杂.AOA和AOB均存在亚硝酸盐还原酶基因nirK[12,16-19],可以进行反硝化作用;采用15N同位素技术对土壤中N2O的来源进行研究,发现硝化微生物的反硝化过程对其平均贡献率为34%～80%[20-21],说明该过程在N2O释放过程中发挥了重要作用.
在PNR测定的培养实验中,添加的NH4+浓度远高于背景值,可认为其是硝化作用的主要氮源.根据氮元素物质的量守恒,消耗的铵盐应全部转化为硝酸盐和亚硝酸盐,对于整个培养系统,溶解无机氮的含量应保持稳定.而本研究中,消耗的铵盐量大于生成的硝酸盐和亚硝酸盐含量,溶解无机氮含量降低,说明培养体系中存在无机氮损失.进一步以硝化微生物的反硝化过程关键酶nirK基因为目的基因,采用特异引物进行定量PCR反应,在培养过程中检测到 AOA和 AOB nirK基因的大量表达.微生物基因组 DNA中存在nirK基因说明其具有反硝化能力,但可能由于环境不适宜而不会转录表达,不发挥相应的生理生化功能,而在RNA水平上检测到nirK基因的表达则可以明确表明微生物正在进行反硝化作用.微生物的转录和翻译过程是同时进行的,通常在转录RNA之后即合成具有相应功能的蛋白质(酶).本研究在RNA水平上检测到AOA与AOB nirK基因的表达,说明培养体系中正在进行反硝化作用,硝化微生物的反硝化作用是造成无机氮损失的原因之一.
由于乳山湾近海沉积物中硝化微生物的反硝化过程的存在,培养体系中存在亚硝酸盐向N2O的转化,导致DIN损失.若只根据测得的硝酸盐和亚硝酸盐的增加量计算PNR,会低估该海域实际的潜在硝化速率,因此必须考虑DIN的损失量加以校正,即上文提出的式(2).本研究中C0和C2 2个站位校正后的总 PNR是未校正数值的15.9倍和22.1倍,校正后AOA的PNR是未校正数值的22.3倍和46.1倍,考虑无机氮损失前后潜在硝化速率差异较大.
分析AOA amoA基因与nirK基因表达量发现,二者存在显著的正相关关系(未发表数据),并且 nirK基因表达量约为 amoA基因表达量的10～40倍,说明培养体系中ND过程强烈,这与较高的DIN损失相一致;Lund等[12]对Monterey海湾的研究结果亦是如此,表明AOA中nirK基因和amoA基因关系密切,相伴而生.乳山湾近海沉积物中能够检测到硝化微生物的反硝化过程的存在,并且其强度可能随氨氧化作用的增强而增高,由此导致的无机氮损失必须加以关注.
4.1 乳山湾近海沉积物的潜在硝化速率培养试验中存在无机氮损失,且损失的溶解无机氮含量与硝化总量的比值为2.72%～40.02%.
4.2 培养过程中AOA和AOB nirK基因活性较高,表明硝化微生物的反硝化过程是造成无机氮损失的原因之一.
4.3 对于C0和C2 2个站位,考虑硝化微生物的反硝化过程得到的总PNR分别是未考虑硝化微生物的反硝化过程的 1
5.9倍和 22.1倍,而对于AOA的PNR则分别是22.3倍和4
6.1倍.因此,若仅根据测得的硝酸盐和亚硝酸盐的增加量计算该海域沉积物潜在硝化速率会导致计算结果偏低,计算时应将培养过程中无机氮的损失纳入其中.
【相关文献】
[1] Wankel S D, Mosier A C, Hansel C M, et al. Spatial variability in nitrification rates and ammonia-oxidizing microbial communities in the agriculturally impacted Elkhorn Slough estuary, California [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011,77(1):269-280. [2] Caffrey J M, Bano N, Kalanetra, et al. Ammonia oxidation and ammonia-oxidizing bacteria and archaea from estuaries with differing histories of hypoxia [J]. The ISME Journal, 2007,1(7): 660-662.
[3] Bernhard A E, Tucker J, Giblin A E, et al. Functionally distinct communities of ammonia-oxidizing bacteria along an estuarine salinity gradient [J]. Environmental Microbiology, 2007,9(6): 1439-1447.
[4] Zheng Y L, Hou L J, Newell S, et al. Community dynamics and activity of ammonia-oxidizing prokaryotes in intertidal sedimentsof the Yangtze Estuary [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014,80(1):408-419.
[5] Li J L, Nedwell D B, Beddow J, et al. amoA gene abundances and nitrification potential rates suggest that benthic ammoniaoxidizing bacteria and not archaea dominate N cycling in the Colne Estuary, United Kingdom [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2015,81(1):159-165.
[6] Welsh D T, Castadelli G. Bacterial nitrification activity directly associated with isolated benthic marine animals [J]. Marine Biology, 2004,144(5):1029-1037.
[7] 王超,单保庆,赵钰.滏阳河水系沉积物硝化速率分布及溶解氧的限制效应 [J]. 环境科学学报, 2015,35(6):1735-1740.
[8] 洪晨,邢奕,司艳晓,等.铁矿区内重金属对土壤氨氧化微生物群落组成的影响 [J]. 中国环境科学, 2014,34(5):1212-1221.
[9] Shaw L J, Nicol G W, Smith Z, et al. Nitrosospira spp. can produce nitrous oxide via nitrifier denitrification pathway [J]. Environmental Microbiology, 2006,8(2):214-222. [10] Bartossek R, Nicol G W, Lanzen A, et al. Homologues of nitrite reductase in ammonia-oxidizing archaea: diversity and genomic context [J]. Environmental Microbiology, 2010,12(4):1075-1088.
[11] 宋凯秀,袁廷柱,孙玉增,等.山东乳山近海海洋卡盾藻(Chattonella marina)赤潮发展过程及其成因研究 [J]. 海洋与湖沼, 2011,42(3):425-430.
[12] Lund M B, Smith J M, Francis C A. Diversity, abundance and expression of nitrite reductase (nirK)-like genes in marine thaumarchaea [J]. The ISME Journal,
2012,6(10):1966-1977.
[13] Kims S-W, Mivahara M, Fushinobu S, et al. Nitrous oxide emission from nitrifying activated sludge dependent on denitrification by ammonia-oxidizing bacteria [J]. Bioresource Techonoly, 2010,101(11):3958-3969.
[14] 路兴岚,甄毓,米铁柱,等.沉积物中氨氧化细菌 amoA基因荧光定量 PCR检测方法的改进 [J]. 中国海洋大学学报, 2012, 42(增刊):176-181.
[15] Takaya N, Catalan-Sakairi M A, Sakaguchi Y, et al. Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide [J]. Applied and Environmental Microbiology,
69(6):3152-3157.
[16] Santoro A E, Buchwald C, Mcllvin M R, et al. Isotopic signature of N2O produced by marine ammonia-oxidizing archaea [J]. Science, 2011,333(6047):1282-1285.
[17] Dundee L, Hopkins D W. Different sensitivities to oxygen of nitrous oxide production by Nitrosomonas europaea and Nitrosolobus multiformis [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2001,33:1563-1565.
[18] Wrage N, Velthof G L, Beusichem M L, et al. Role of nitrifier denitrification in the production of nitrous oxide [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2001,33(12/13):1723-1732.
[19] Walker C B, De La Torre J R, Klotz M G, et al. Nitrosopumilus maritimus genome reveals unique mechanisms for nitrification and autotrophy in globally distributed marine Crenarchaea [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010,107(19):8818-8823.
[20] Ambus P, Zechmeister-Boltenstern S, Butterbach-Bahl K. Sources of nitrous oxide emitted from European forest soils [J]. Biogeosciences, 3(2):135-145.
[21] Kool D M, Dolfing J, Wrage N, et al. Nitrifier denitrification as a distinct and significant source of nitrous oxide from soil [J]. Soil Biology and Biochemistry, 43(1):174-178.
致谢：感谢中国海洋大学海洋生命学院王华龙同学和国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心刘军同学在野外采样中给予的帮助,感谢中国海洋大学化学化工学院谷文艳同学在溶解无机氮测定中给予的帮助.。