香菇多糖的提取纯化及颗粒剂制备的处方优化

香菇多糖的提取纯化及颗粒剂制备的处方优化
郑小亮;祝丽华;沈孟宏;潘昉;孙妍;牛瑞艳;刘玉鹏;陈志宝;贾桂燕
【摘要】通过对提取纯化后的原料药进行全面的性质考察,针对其缺陷,对稀释剂种类进行了筛选及处方优化.在香菇多糖颗粒剂处方优化过程中,考察了两种稀释剂单独与混合使用时不同配比对制剂的影响,优化出香菇多糖颗粒剂最优处方原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶1.5∶0.5,制备出的香菇多糖颗粒剂经质量检查符合药典规定,质量合格,为制药企业生产香菇多糖颗粒剂提供了理论依据.
【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》
【年(卷),期】2019(031)001
【总页数】6页(P68-73)
【关键词】香菇多糖;提取;纯化;颗粒剂;处方优化
【作者】郑小亮;祝丽华;沈孟宏;潘昉;孙妍;牛瑞艳;刘玉鹏;陈志宝;贾桂燕
【作者单位】黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆163319;大庆油田总医院;大庆油田总医院;大庆油田总医院;大庆油田总医院;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆163319
【正文语种】中文
【中图分类】S859.7
颗粒剂系指药物与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状的制剂。

颗粒剂可分散或溶解在水或其他适宜的液体中服用，也可直接吞服。

颗粒剂具有分散性、附着性、聚集性、分离性、吸湿性，应用和携带比较方便，溶出和吸收速度较快，有利于分剂量和含量准确的特点；必要时可以包衣，使颗粒具有防潮、缓释、肠溶等性质，改变药物的释放速度和药物的吸收位置；颗粒剂性质稳定，运输、携带、贮存方便；生产工艺简单，容易实现机械化生产；但颗粒剂分剂量时不易准确，且混合功能较差。

近年来，随着医药科学的发展，颗粒剂的制备方法也不断的提高，颗粒剂也得到了迅速的发展。

颗粒剂已成为医药中的一种重要的剂型[1]。

目前文献中
尚无对香菇多糖颗粒剂制备的文献报道。

针对香菇多糖原料药的性质缺陷与不足，设计处方与工艺，筛选出最佳的辅料以及比例，制备出符合药典规定的合格颗粒剂，为药厂生产节约成本提供理论依据，进而对降低药价做出贡献。

1 材料与方法
1.1 试剂仪器
试剂：乙醇、氯化钠、甘露醇、乳糖、糊精、蔗糖、山梨醇、可溶性淀粉、氢氧化钠、盐酸、氯仿、三氯乙酸均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

仪器：电热恒温鼓风干燥箱、上海森信试验仪器有限公司；电动搅拌器、FLUKO
公司；真空冷冻干燥机、德国CHRIST公司天平；上海越平科学仪器有限公司、
低温超速离心机日本日立公司。

1.2 香菇多糖的提取与纯化
1.2.1 香菇多糖的提取
将购买的新鲜香菇自然晾晒7 d时间，收集干燥的香菇，用刀切碎，再用粉碎机
打成粉末，过筛（50目），置自封袋于阴暗干燥处。

用称量纸精确称取30 g香菇粉末，置2 000 mL三颈瓶中，按30∶1的比例加入
900 mL蒸馏水，浸润4 h，置水浴锅，组装回流装置，温度达到90℃开始计时，搅拌转速为150 r·min-1，回流提取3 h，停止加热，将香菇多糖提取液倒入2 000 mL烧杯中，自然冷却至室温[2]。

采用低温超速离心机进行固液分离。

离心
条件为4 ℃，转速8 000 r·min-1，时间 20 min，取上清液置2 000 mL的干燥
烧杯中，保鲜膜密封置4℃冰箱储存，备用。

收集沉淀，置烘箱45℃，6 h烘干，备用。

精密称取离心所得干燥沉淀30 g，置2 000 mL三颈瓶中，按20∶1的比例加入600 mL 5%NaOH，浸润3 h，置水浴锅，按上述水提香菇多糖法组装试验仪器，进行碱液提取残渣中的香菇多糖，待温度达到60℃开始计时，搅拌桨转速为150 r·min-1，回流提取2.5 h，冷却至室温[3]。

按照上述低温超速离心法进行碱溶性
香菇多糖提取液的固液分离，弃去残渣，取上清液置2 000 mL的干燥烧杯中，用HCl溶液中和至pH7.0，保鲜膜密封置4℃冰箱储存，备用。

取冷藏后的香菇多糖水提液与碱提液合并，边搅拌边加入95%乙醇至终浓度80%，置4℃静置24 h，抽滤取沉淀，置烘箱45℃，6 h烘干，备用。

1.2.2 香菇多糖的纯化
取香菇多糖粗粉，蒸馏水配制含 40（g·mL-1）浓度的多糖溶液，按体积比1：1
加入不同浓度（5%、10%、15%、20%、25%）的三氯乙酸，电动搅拌浆搅拌3 min 至混合均匀，4 ℃冷藏 24 h，离心（4 000 r·min-1）5 min，除去沉淀取上
清液，用NaOH溶液调pH中性，测定水层中的蛋白质含量与多糖含量。

监测不
同浓度三氯乙酸脱蛋白时香菇多糖与杂蛋白的含量变化。

香菇多糖溶液冻干，备用[4-5]。

取经脱蛋白后的香菇多糖冻干粉，蒸馏水配制成含多糖40%香菇多糖溶液。

取20 mL配置好的多糖溶液，边搅拌边加入95%乙醇至终浓度10%，电动搅拌浆搅拌10 min至混合均匀，4℃冷藏24 h，离心（4 000 r·min-1）5 min，抽滤收集沉
淀，置烘箱45 ℃，6 h烘干，备用。

取滤液，边搅拌边加入95%乙醇至终浓度20%，电动搅拌浆搅拌10 min至混合均匀，4℃冷藏 24 h，离心（4 000 r·min-1）5 min，抽滤收集沉淀，置烘箱45℃，6 h烘干，备用[6-7]。

1.3 颗粒剂制备
1.3.1 性质考察
对香菇多糖干燥粉末W进行性状考察：
吸湿性：精密称取香菇多糖粉末W3份，置干燥称量瓶中，在25℃（室温）相对
湿度75%的干燥器中密闭放置，于24 h后取出精密称重，计算吸湿率。

吸湿率计算公式：吸湿率（%）=（吸湿后重量-吸湿前重量）/吸湿前重量×100%
溶解性：取香菇多糖W10 g，置500 mL烧杯中，加入200 mL热水，搅拌3 min，观察溶解情况。

制粒：称取香菇多糖W，加入乙醇制粒，观察制粒情况。

1.3.2 辅料的选择
经过预试验选择原料药：辅料=1：2筛选辅料种类，润湿剂选择70%乙醇。

称取香菇多糖W6份，每份5 g，每份分别加入稀释剂甘露醇、乳糖、糊精、蔗糖、山梨醇、可溶性淀粉10 g，混合均匀按照“手握成团，轻按即散”的标准制软材。

采用挤压方式过14目筛网，取过完筛网的颗粒置托盘中，于电热恒温鼓风干燥箱60℃干燥10 min，取出置相对湿度为75%密闭干燥器，25℃放置48 h，观察外观性状变化。

1.3.3 处方的确定
稀释剂处方组成的确定：
在初步筛选出颗粒剂稀释剂种类的基础上，进一步优化处方，以成型性、25℃相
对湿度75%下放置一周后吸湿性和外观变化为考察指标。

采取原料药、甘露醇、
乳糖以不同比例、不同组合组成处方，考察颗粒剂性状质量，筛选最优处方。

试验设定如下15组处方进行颗粒剂处方筛选：原料药∶ 甘露醇=1∶ 1.5、1∶ 2、1∶ 2.5，原料药：乳糖=1∶1.5、1∶2、1∶ 2.5，原料药：甘露醇：乳糖=1∶ 0.5∶ 1、1∶ 1∶0.5、1∶ 1∶1、1∶ 1.5∶ 0.5、1∶ 0.5∶ 1.5、1∶ 0.5∶ 2、1∶1∶ 1.5、1∶1.5∶ 1、1∶2∶ 0.5。

润湿剂处方组成的确定：
通过预实验发现：在制粒过程中，由于原料药粘度较大，润湿剂乙醇浓度过低易粘筛，通过查阅文献同时考虑降低成本，本试验选择70%乙醇作为香菇多糖颗粒剂
制备的润湿剂。

制备过程中，少量多次加入润湿剂，混合均匀后进行制粒操作，考察润湿剂用量（70%乙醇用量/原料药加稀释剂：0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 、
0.45、0.5、0.55、0.6 mL·g-1）对颗粒成型性的影响。

1.3.4 香菇多糖颗粒剂的质量检查
按照《中华人民共和国药典》（2010版）规定颗粒剂的质量检查项进行香菇多糖
颗粒剂质量检查。

外观：观察颗粒剂外观，品尝味道。

粒度试验：称取3份颗粒剂，每份10 g置于药筛内过筛，过筛时保持水平状态，左右往返边筛动边轻叩3 min，不能通过1号筛（10目）和能通过5号筛（80目）的颗粒不得超过总颗粒质量的15%。

水分试验：称取颗粒剂2 g置于干燥至恒重的称量瓶中，厚度不超过5 mm，精
密称定，打开瓶盖在105℃干燥2 h，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30 min，精密称定，干燥前颗粒的重量减去干燥后颗粒的重量的差值与干燥前颗粒的重量的比值×100%=含水量。

根据减失的重量，计算供试品中含水量（%），不得超过6%。

溶化性试验：称取颗粒剂5 g，加100℃热水100 mL，搅拌5 min后观察颗粒溶解情况。

2 结果与分析
2.1 提取结果
对香菇干燥粉末进行热水回流提取，以水溶性香菇多糖提取率为指标，进行了一系列单因素试验。

确立了热水回流提取香菇多糖的最佳工艺为：料液比30∶ 1，浸
润 4 h，提取温度90 ℃，提取时间 3 h，搅拌桨的转速为150 r·min-1，水溶性
香菇多糖得率27.3%。

对经热水回流提取后的香菇残渣进行碱液回流提取，以碱溶性香菇多糖提取率为指标，进行了一系列单因素考察试验。

确立了碱液回流提取碱溶性香菇多糖最佳工艺为：液料比1∶20，NaOH浓度5%，浸润3 h，提取温度60℃，提取时间2.5 h，搅拌桨的转速为150 r·mi n-1，碱溶性香菇多糖得率7.5%。

2.2 纯化结果
以蛋白质含量变化与多糖含量变化为考察指标，用三氯乙酸法去除多糖溶液中杂蛋白的效果和多糖保留率，处理时采取连续操作6次，蛋白含量下降至15%，多糖
含量保留64%。

水溶性香菇多糖经乙醇分布醇沉得到各醇沉多糖，其中乙醇终浓度为30%的香菇
多糖组分占总多糖百分比最大，为总多糖的44.72%。

2.3 性质考察结果
香菇多糖颗粒剂制备原料药的性状考察结果见表1。

表1 香菇多糖原料药的性状考察Table 1 The characters investigation of lentinan active pharmaceutical ingredients原料药考察项目结果香菇多糖W
浅棕色粉末吸湿性易吸湿，粘连，吸湿率23.7%溶解性易溶制粒乙醇浓度低粘筛，难以制粒；乙醇浓度高粉末多，难制粒
如表1所示，对颗粒剂原料药香菇多糖W的考察结果显示：原料药易溶、易吸湿粘度增大，单独加入润湿剂无法制粒，需加入适宜辅料进行制粒。

选择辅料时，应选择吸湿性小，粘度小的药用辅料。

2.4 辅料的选择结果
制备香菇多糖颗粒剂所选用稀释剂的种类筛选考察结果见表2。

如表所示，加入的稀释剂种类不同，颗粒剂呈现不同的吸湿性，外观表现不同。

制粒过程中山梨醇作为稀释剂效果最差，所制颗粒粘筛，放置后软化、粘连。

蔗糖作为稀释剂，成型性差，放置后部分软化、粘连。

糊精与可溶性淀粉作为稀释剂，吸湿性大，所制颗粒稳定性差，放置后软化、粘连、颜色加深。

单独选用甘露醇或乳糖制粒，制粒过程顺利，放置后吸湿性也得到缓解，不软化、不粘连。

因此，选用甘露醇和乳糖作为稀释剂进一步考察，并增加甘露醇和乳糖的混合组。

表2 香菇多糖颗粒剂稀释剂的筛选Table 2 The filtering of lentinan granule thinners辅料 48 h后外观变化甘露醇无软化、不粘连乳糖无软化、不粘连糊精
软化、粘连、色深蔗糖部分软化、粘连山梨醇软化、粘连可溶性淀粉软化、粘连、色深
2.5 处方的确定结果
香菇多糖颗粒剂制备稀释剂处方组成的考察结果见表3。

如表所示，试验以颗粒剂制备成型性、25℃相对湿度75%下放置一周后吸湿性和外观变化为考察指标，对
原料药、甘露醇、乳糖以不同处方组成、不同比例的16个处方进行考察。

结果显示，原料药与稀释剂处方比例为1.5时，制备过程中易粘筛、颗粒成型性不好，放置过程中易吸潮、吸湿率偏大；处方比例在2.5时，制备的颗粒剂细粉多、颗粒不均匀；处方比例在2时，制备的颗粒均匀、成型性好，放置过程中颗粒吸湿性小。

原料药与稀释剂处方比例在2时，试验设计了5个处方，经考察处方中乳糖比例
增加所制颗粒硬度大、放置过程中吸湿性偏大；处方中甘露醇比例增加时所制颗粒均匀疏松，放置过程中吸湿率下降。

综合考虑制剂成型性、放置后吸湿率及性状变化，选择最优处方为原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶1.5∶0.5。

表3 香菇多糖颗粒剂稀释剂处方组成的考察结果Table 3 The composition of
prescription of lentinan granule thinners处方成型性 6 d后吸湿率/% 6 d后
外观变化原料药∶甘露醇=1∶1.5 粘筛，不成颗粒 5.37 粘筛，吸潮原料药∶甘露
醇=1∶2 颗粒均匀 3.68 不粘筛，干燥疏松原料药∶甘露醇=1∶2.5 细粉多 3.02
细粉增多原料药∶乳糖=1∶1.5 粘筛，不成颗粒 6.14 粘筛，吸潮原料药∶乳糖
=1∶2 颗粒均匀，硬度稍大 5.09 不粘筛，干燥不疏松原料药∶乳糖=1∶2.5 颗粒
硬度大5.27 硬度大原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶0.5∶1 粘筛，不成颗粒5.62 粘筛，吸潮原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶1∶0.5 粘筛，不成颗粒 5.49 粘筛，吸潮原料药∶
甘露醇∶乳糖=1∶1∶1 颗粒均匀，硬度稍大 4.58 不粘筛，干燥不疏松原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶1.5∶0.5 颗粒均匀，疏松 2.95 不粘筛，颗粒均匀，疏松原料药∶
甘露醇∶乳糖=1∶0.5∶1.5 颗粒均匀，硬度大 4.63 不粘筛，颗粒均匀，硬度大原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶0.5∶2 颗粒硬度大 5.11 硬度大原料药∶甘露醇∶乳糖
=1∶1∶1.5 细粉多，硬度大 4.61 细粉多，硬度大原料药∶甘露醇∶乳糖
=1∶1.5∶1 细粉多，硬度大 4.59 细粉多，硬度大原料药∶甘露醇∶乳糖
=1∶2∶0.5 细粉多，疏松 3.46 细粉多，疏松
香菇多糖颗粒剂制备润湿剂用量对颗粒成型性的考察结果见表4。

如表所示，乙醇用量低，润湿效果差、多糖粘性起主要作用，颗粒剂制备过程中易造成粘筛现象，制备困难；乙醇用量高，润湿效果过大、成细粉状，制备不成颗粒。

经考察，70%乙醇用量在0.35～0.45 mL·g-1时，均能制备出颗粒均匀、成型性好的颗粒剂，
考虑到经济型及所制备的颗粒的疏松程度，取0.4 mL·g-170%乙醇作为制备香菇
多糖颗粒剂的润湿剂用量。

2.6 质量检查结果
根据《中华人民共和国药典》（2010版）规定颗粒剂的质量检查项进行的香菇多糖颗粒剂质量检查结果如下：
外观：制备的颗粒剂呈浅棕色疏松颗粒，味微甜。

粒度试验：经检测，不能通过1号筛（10目）和能通过5号筛（80目）的三份
颗粒的平均质量为0.975 g，占总颗粒质量的9.75%，符合要求。

表4 香菇多糖颗粒剂润湿剂处方组成对颗粒成型性考察结果Table 4 The results of investigation of composition of prescription of lentinan granulewetting agentson pellet formability70%乙醇/0.1 mL·g-1 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0成型性粘筛粘筛粘筛易成型，呈均匀颗粒易成型，呈均匀颗粒易成型，呈均匀颗粒不成颗粒，细粉状不成颗粒，细粉状不成颗粒，细粉状
水分试验：经测定，干燥前颗粒的重量减去干燥后颗粒的重量的差值为0.056 g，含水量为2.8%，符合要求。

溶化性试验：经检测，随着搅拌的继续，制取的颗粒剂在1 min后就全部溶解，
无不溶性杂质，最终得到了澄清透明的药物溶液。

所制备的香菇多糖颗粒剂外观色泽一致，粒度差异小于15%，水分含量小于6%，在5 min之内全部溶化，符合药典规定质量合格。

3 讨论
（1）浸提法是提取香菇多糖最常用的方法，其主要步骤基本相同：预处理-浸提（多糖与细胞分离）-过滤-浓缩-醇析-干燥-粗多糖[8-11]。

以去离子水、低浓度NaOH为提取溶剂的提取方法。

提取液经离心取上清过滤，滤液冷冻干燥得粗多
糖粉末，最大限度的保留了香菇多糖的活性。

采取先以去离子水提取水溶性香菇多糖，再以5%的NaOH提取水提后香菇残渣里面的碱溶性香菇多糖，最大限度地
利用香菇资源，扩大了香菇多糖的提取来源，提高了发现高活性香菇多糖的可能性。

（2）在香菇多糖分离纯化工艺中，乙醇醇沉是最简单有效的分离方法，分为分级醇沉和分步醇沉，相比较而言，分步醇沉得到的香菇多糖分子量范围更窄、更纯净[12-17]。

研究发现，低体积分数乙醇醇沉得到的香菇多糖分子量大、极性低，多
糖的分子量越大形成三级结构的能力就越强，生物活性也就越高。

因此，选取30%
体积分数乙醇分步醇沉的香菇多糖进一步分离纯化，并且通过试验发现30%体积
分数乙醇沉淀下来的香菇多糖量大，为进一步试验提供足够供试品。

（3）制剂制备之前必须对原料药进行全面的性质考察，针对于原料药的性质缺陷与不足，设计处方与工艺，制备出质量合格的制剂产品[18-20]。

首先对原料药香
菇多糖进行性质考察，发现原料药易吸湿、粘性大，与润湿剂单独混合难以制粒。

针对这些缺陷，试验进行了稀释剂种类筛选及处方的优化。

在颗粒剂的制备过程中，润湿剂的浓度与用量直接影响制剂制备的成功与否[21]。

乙醇用量低，润湿效果差；乙醇用量高，润湿效果过大。

考虑到生产成本与安全性，选择70%乙醇作为润湿剂，以制剂成型性为考察指标进行润湿剂用量考察，优化结果为润湿剂70%乙醇（0.4 mL·g-1）涓流添加。

4 结论
通过对香菇多糖颗粒剂的处方进行优化得到最优处方为原料药∶甘露醇∶乳糖
=1∶1.5∶0.5，润湿剂70%乙醇（0.4 mL·g-1）。

制备工艺：称取香菇多糖5 g，按最优处方加入稀释剂，涓流加入润湿剂混合均匀，按照“手握成团，轻按即散”的标准制软材。

采用挤压方式过14目筛网，取过完筛网的颗粒置托盘中，于电热恒温鼓风干燥箱60℃干燥10 min，成品置自封袋于干燥器中室温保存。

制备出的香菇多糖颗粒剂经质量检查符合药典规定，质量合格。

近些年来，国内外对香菇多糖的研究内容主要为通过变换提取方法提高多糖的提取率，通过改变提取部位、组织培养的方式提取多糖，均一组成的多糖的分离纯化及结构构象分析、化学修饰和活性试验[22]。

在后续的实验中，可以用色谱法分离纯化得到均一分子量的香菇多糖进行体内外药理活性试验，筛选出具有高活性组分，进行制剂开发。

这对于发掘具有高药理活性的香菇多糖，开发香菇多糖新制剂，造福患友，具有重要的研究与应用价值。

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