荧光定量PCR法检测烟曲霉DNA

荧光定量PCR法检测烟曲霉DNA
毛璞;余志辉;黄红川;杨淳;黎毅敏
【摘要】目的建立检测烟曲霉DNA的荧光定量PCR方法,评价其在小鼠侵袭性烟曲霉肺部感染诊断中的意义.方法根据烟曲霉ITSI区域基因组序列,设计合成引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR条件,从特异性、扩增效率、灵敏度及重复性方面进行评价.建立小鼠烟曲霉肺部感染模型,用荧光定量PCR对36只实验小鼠肺组织及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行检测.结果本研究设计的引物和探针特异性扩增烟曲霉DNA,最低检出量为每毫升10<'2>个烟曲霉孢子,在10<'3>～10<'7>拷贝数(Cp)内具有良好的线性关系(R<'2>=0.999).在0.5×10<'3>Cp/mL与0.5×10<'5>Cp/mL两个浓度时,批内变异系数为
0.39%、0.53%,批间变异系数为2.22%、4.58%.结果成功建立了荧光定量PCR 检测烟曲霉DNA方法,该法特异性强、灵敏度高、重复性好,将有助于烟曲霉感染的早期诊断和针对性治疗.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2011(029)003
【总页数】3页(P165-167)
【关键词】烟曲霉;荧光定量聚合酶链反应;BALB/c小鼠
【作者】毛璞;余志辉;黄红川;杨淳;黎毅敏
【作者单位】广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广
州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120;广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所,广州,510120
【正文语种】中文
【中图分类】R519
烟曲霉是曲霉病中最常见的致病菌,占人类曲霉类感染的80%～90%，病死率达94%～100%[1-2]。

传统的真菌培养和组织活检是诊断曲霉感染的金标准，但所需时间长，敏感度低，组织活检还会给患者带来一定创伤。

近几年来G试验(检测1，3-β-D-葡聚糖)、GM试验(检测半乳甘露聚糖抗原)已成为诊断侵袭性真菌感染依
据之一。

然而抗生素治疗和肠外营养对上述2种方法带来很大的干扰[3-4]。

因此
急需建立新的检测方法，以提高侵袭性真菌感染(IFI)诊断的快速性、特异性和准确性。

本研究根据真菌核糖体RNA基因内部可转录间隔区
1(internal transcribed spacers 1,ITS1)设计引物和探针，建立了荧光定量PCR
检测烟曲霉DNA方法，并应用烟曲霉肺部感染小鼠模型进行方法学评价。

1 材料与方法
1.1 菌株来源烟曲霉(BMU 04666)、黄曲霉(BMU 00758)、土曲霉
(BMU 03225)、黑曲霉(BMU 03900)来自北京大学真菌和真菌病研究中心；大肠
埃希菌(ATCC 35218)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、铜绿假单胞菌
(ATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、阴沟肠杆菌(ATCC 700313)、白念珠菌(ATCC 90028)购自美国菌种保藏中心。

1.2 主要试剂和仪器pMD18-T质粒、Ex Taq®热启动酶、EASY dilution均购自大连TaKaRa公司；QIAamp DNA Mini kits购自德国Qiagen公司；普通PCR仪、Bio-Rad凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，荧光定量PCR 7500仪(美
国ABI公司)；DU800紫外分光光度计(美国Beckman公司)。

1.3 荧光定量PCR 依据烟曲霉ITS1核酸序列设计特异引物与探针。

上游引物：5′-TTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGT-3′，下游引物：5′-ACGATAATCAACTCAGACTGCATACTT-3′;探针：5′-FAM-CGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCG-ECLIPSE-3′，均由大连TaKaRa公司合成。

应用QIAamp DNA Mini 试剂盒结合磁珠振荡法提取曲霉菌孢子DNA[5]。

PCR
反应总体积50 μL，含有10×buffer 5 μL，25 mmol/L dNTPs 4 μL，
20 μmol/L上、下游引物及探针各 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。

反
应条件：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s，62 ℃ 32 s，40个循环,每次循环结束收集荧光。

1.4 质粒标准品的构建用烟曲霉特异性引物，常规PCR扩增目的片段，反应条件同上。

PCR产物割胶纯化后，连接到pMD18-T质粒。

连接产物转化感受态大
肠埃希菌DH5α。

经上海英骏公司测序证实正确的阳性克隆扩增后，抽提质粒，
定量后用EASY dilution 10倍系列稀释，作为标准品。

1.5 小鼠侵袭性烟曲霉肺部感染模型的建立体重20 g无特定病原体(SPF
级)BALB/c雄性成年小鼠48只，随机分为实验组和对照组。

实验组36只，按每
g体重用环磷酰胺250 μg和氢化可的松200 μg分别于接种孢子前2天和接种后
3天进行免疫抑制。

接种当日，戊巴比妥麻醉小鼠后，颈部消毒、备皮无菌操作。

将烟曲霉孢子重悬于PBS中，配成2×106个/100 μL悬液，直视下每只鼠用
1 mL注射器经气管注入50 μL孢子悬液，对照组12只鼠用1 mL注射器经气管
注入50 μL PBS。

分别于第3、5、7天分批处死小鼠。

无菌开胸结扎右支气管及
心脏，每次0.8 mL PBS进行左肺肺泡灌洗，共灌洗3次。

1.6 mL BALF加入玻璃磁珠振荡2 h后，按照QIAamp DNA Mini kits说明书进行DNA提取并进行定
量PCR检测。

另外0.8 mL支气管肺泡灌洗液(BALF)用于真菌定量培养。

右肺上
叶组织经多聚甲醛固定后石蜡包埋，六铵银(GMS)染色；右肺中叶称重后匀浆，接种于沙氏葡萄糖琼脂(SDA)固体培养基，30 ℃培养4 d后计菌落数；右肺下叶提
取DNA进行定量PCR检测。

1.6 肺组织与BALF培养肺组织取出后称重，加入1 mL生理盐水匀浆。

10倍梯度稀释，接种于SDA培养基。

为增加BALF培养的灵敏度，BALF离心后重悬
于50 μL生理盐水，接种于SDA培养基，30 ℃培养，4 d后计菌落数。

2 结果
2.1 标准质粒的鉴定以及ITS1标准曲线的建立ITS1扩增区经PCR扩增后，连接到pMD18-T质粒，经筛选、测序证实与NCBI基因数据库中烟曲霉ITS1序列(GenBank:GU973821.1)100%匹配。

以循环阈值(Ct)为纵坐标，以拷贝数的对数
值为横坐标，建立标准曲线。

标准品在1.0×103～1.0×107 Cp/mL浓度范围内呈明显的线性关系，回归曲线斜率为-3.44，截距为41.05，相关系数R2=0.999。

2.2 定量PCR特异性为验证荧光定量PCR对烟曲霉检测的特异性，提取了4
种真菌(土曲霉、黄曲霉、黑曲霉与白念珠菌)和大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌的DNA作为模板进行检测。

结果反应体系只扩增烟曲霉DNA。

2.3 定量PCR重复性对标准品10倍稀释后，选取0.5×103 Cp/mL与
0.5×105 Cp/mL 2个浓度进行重复检测，每个浓度共重复5次。

批内试验获得的Ct值标准差为0.12、0.13，变异系数为0.39%、0.53%。

批间试验获得的Ct 值
标准差为0.71、1.17, 变异系数为2.22%、4.58%。

证实所建立的方法重复性能满足检测要求。

2.4 定量PCR灵敏度用细胞计数仪对孢子准确计数，孢子浓度稀释为:1×102、1×103、1×104、1×105、1×106个/mL，分别提取DNA后进行定量PCR检测。

结果证实其灵敏度为1×102个孢子/mL。

2.5 病理切片GMS染色结果第5天和第7天处死的小鼠病理切片GMS染色，分别有2和5只可见曲霉菌丝；对照组未见孢子或菌丝(图1)。

图1 接种后第7天小鼠肺组织GMS染色切片(×100)
2.6 肺组织与BALF培养结果于第3、5、7天分批处死小鼠各12只，3个时
间点所有小鼠肺组织和各有2、4、7只小鼠BALF培养呈阳性。

肺组织与BALF
真菌定量培养结果与PCR结果相比更趋于稳定，菌落数分别约为105与102个。

2.7 定量PCR检测小鼠烟曲霉肺部感染小鼠肺组织烟曲霉DNA拷贝数随感染时间延长逐渐增多(图2)。

BALF检测3个时间点各12只小鼠均呈阳性，但结果个体差异较大(图3)。

图2 实验组小鼠肺组织定量PCR检测结果
图3 实验组小鼠BALF定量PCR检测结果
3 讨论
大多数测定曲霉DNA的PCR法选取无种间特异性真菌核糖体18S rRNA作为检
测的靶基因[6-7]，无法鉴定到种的水平。

另有研究选择具有种间特异性基因
Mto1作为检测的靶基因[8]，但Mto1不是多拷贝基因，有可能降低检测的灵敏度。

最近研究表明位于核糖体基因间的ITS区不仅具有一定的种间特异性，可区分曲霉菌不同种之间的变异[9]，且为多拷贝。

因此我们选用ITS1为烟曲霉检测的靶基因，不仅可以将真菌检测鉴定到种的水平，且能充分发挥核糖体基因作为多拷贝基因在检测中的优势。

与传统培养方法比较，定量PCR的灵敏度明显优于培养方法。

在感染第3天，虽
然将BALF离心增加培养灵敏度，但只有2只鼠的BALF培养阳性，而定量PCR
检测的阳性率为100%。

肺组织定量培养与肺组织定量PCR在检测的3个时间点
阳性率均为100%，但不适用于临床。

表明选用BALF为PCR检测对象不仅更适
合临床检测的开展，而且不影响检测结果的灵敏度。

本研究中，PCR共进行40轮
循环，Ct值≤35时，判定为反应阳性；Ct值>35时，反应阴性，以此排除PCR 的非特异性扩增。

对于任何一种检测方法，目前仍需结合患者的临床表现进行定植菌与感染菌区分。

本研究中采用免疫抑制小鼠气管滴入霉菌孢子的方法进行接种，因此Ct值≤35时，均判定为感染菌。

肺组织定量培养结果显示在小鼠感染后7 d内，肺组织的荷菌数相对稳定；肺组织定量PCR结果表明肺内烟曲霉靶基因拷贝数明显增加。

这可能是由于烟曲霉菌丝是多细胞的结构，肺内定植的孢子萌发菌丝后，细胞核数量增加，菌丝量(孢子量)并没明显的增加而导致肺组织定量培养与肺组织PCR结果的差异。

这同时也表明定量PCR更准确地反映了烟曲霉在肺组织内的增殖情况。

4 参考文献
[1]Luzzaro F, Mantengoli E, Perilli M, et al.Dynamics of a nosocomial outbre ak of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa producing the PER-
1 extended-spectrum beta-lactamase[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(5):1865-1870.
[2]Thompson GR. Pulmonary aspergillosis[J]. Semin Respir Crit Care Med, 2 008, 29(2):103-110.
[3]Tanriover MD, Metan G, Altun B, et al.False positivity for Aspergillus anti genemia related to the administration of piperacillin/tazobactam[J]. Eur J I ntern Med,2005, 16(7):489-491.
[4]Hage CA, Reynolds JM, Durkin M, et al. Plasmalyte as a cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fl uid[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(2):676-677.
[5]Griffiths LJ, Anyim M, Doffman SR, et al. Comparison of DNA extraction methods for Aspergillus fumigatus using real-
time PCR[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(Pt9):1187-1191.
[6]Bowman JC, Abruzzo GK, Anderson JW, et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate[J]. Antimicr ob Agents Chemother,2001, 45(12):3474-3481.
[7]Sheppard DC, Marr KA, Fredricks DN, et al. Comparison of three method ologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis[J]. Clin Microbiol Infect, 2006, 12(4):376-380.
[8]刘金华，史艳宇，贺丹,等.应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的初步研究[J].生物技术，2009，19(11):34-36.
[9]Henry T, Iwen PC, Hinrichs SH. Identification of Aspergillus species using internal transcribed spacer regions 1 and 2[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(4): 1510-1515.。