‘京白梨'优良单株组织培养高效快繁体系构建

‘京白梨'优良单株组织培养高效快繁体系构建
Liu Chun;Gao Tongyu;Su Benying;Li Jinjin;Li Jing;Wu Yajuan;Wang
Wei;Shen Yingbai
【摘要】试验以'京白梨'优良单株'孟3'为试验材料,旨在通过外植体筛选、消毒方
式优化、增殖和生根培养基筛选,建立'京白梨'高效快繁体系,为脱毒苗快速培育提供科学支撑.结果表明:选用老枝条为外植体进行接种后污染率达到93.3％,而采用嫩梢污染率为0,因此在外植体的选择上应尽量采用'京白梨'植株幼嫩组织,如花芽或刚萌发的嫩梢.采用2％的次氯酸钠与0.1％的升汞消毒,污染率分别为33％、18％,虽然升汞比次氯酸钠处理效果好,但考虑到安全和环境保护,建议使用次氯酸钠进行外植
体消毒.1/2 MS培养基与1.5 mg/L赤霉素浓度对'京白梨'花芽愈伤组织诱导较好.
对'京白梨'优良单株的组培体系建立过程中发现,采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3对'京白梨''孟3'外植体的愈伤组织形成、不定芽个数的形成、增殖率、芽长度、叶片生长情况有良好的促进作用,增殖率为94％.生根培养试验结果表明:在S3、S5、S7、S9培养基中,15 d观察后发现'京白梨'组培苗的基部有根
原基形成,但在此期间未诱导形成根,45 d后观察发现,S10、S11培养基中的'京白
梨'组培苗成功诱导生根.以植株幼嫩组织作为外植体、2％的次氯酸钠作为消毒剂、采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3作为增殖培养基、S10和
S11作为生根培养基,可有效提高'京白梨'优良单株组培快繁育苗效率.
【期刊名称】《广西林业科学》
【年(卷),期】2019(048)002
【总页数】6页(P173-178)
【关键词】京白梨;优良单株;组织培养;高效快速繁育
【作者】Liu Chun;Gao Tongyu;Su Benying;Li Jinjin;Li Jing;Wu Yajuan;Wang Wei;Shen Yingbai
【作者单位】;;;;;;;
【正文语种】中文
【中图分类】S661.2
‘京白梨’属于秋子梨（Pyrus ussuriensis）的一个优良品种，是北京市地理标识性水果之一，栽植历史悠久，迄今已有400多年。

在北京的栽培区域主要包括门头沟区妙峰山镇、军庄镇和房山区琉璃河镇等，在我国的河北、辽宁、山西等地也有栽培。

‘京白梨’果实口味细腻独特，是具有重要价值的水果品种，深受广大消费者喜爱。

随着‘京白梨’在市场上供不应求，其市场价格也在逐年提高，给北京‘京白梨’产区带来了良好的经济效益。

但是由于病害、栽培管理粗放、不注重保存优良种质资源等原因，目前‘京白梨’品种退化日益严重，出现风味变淡、果形较小、畸形果增多等现象[1]，严重制约了其产业化发展，急需通过科学技术手段加快‘京白梨’优良植株繁育。

20世纪30年代，Tukey进行了梨胚胎培养并获得成功[3]。

梨及其砧木的繁殖多采用嫁接方法，70年代后关于梨与砧木的组织培养和离体快繁的报道增多，美国和意大利最早使用离体快繁技术对梨及砧木进行商业性生产。

1975年，前苏联学者进行洋梨幼胚培养获得植株[3]。

David与赵惠祥从茎尖培养中，分别得到试管苗和完整的植株。

此外还进行了下胚轴，子叶横切段的培养，都成功获得了不定芽[3]。

现阶段梨的组织培养工作主要集中在叶片培养和茎尖培养两个方面。

研究结
果表明，品种和器官的外植体不同，所采用的培养基种类、植物生长调节剂的比例和浓度、培养条件也不同。

不同的培养基条件对梨的组织培养有很大影响，韩继成等[4]通过试验表明，梨的两个品种冀蜜和丰水分别以N6，NN60，MS为培养基，附加相同的条件（TZD1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+CH 250 mg/L+S.30 mg/L+A.5 mg/L），结果在NN60培养基上获得了最佳效果，不定芽的诱导率为100%。

目前对‘京白梨’优良单株组织培养快繁技术的研究报道较少，研究‘京白梨’的组织快繁体系，包括消毒方式、外植体筛选以及增殖和生根培养基配比，具有一定的生产实践意义。

通过组培快繁技术获得脱毒苗，可以减少梨树自身潜隐病毒带来的危害，为‘京白梨’优良植株种质资源保存和繁育提供理论基础和技术支撑，同时，也可为解决北京地区‘京白梨’品种退化提供有效途径，从而推动‘京白梨’产业化发展。

1 材料和方法
试验于2018年4月至2019年6月在北京市门头沟区科技开发试验基地组培实验室内进行。

1.1 试验材料
植物材料：选用‘京白梨’优良单株‘孟3’为试验材料，外植体选用枝条水培萌发出的幼嫩芽尖和春季树体萌发的幼嫩新梢。

化学药剂及材料：75%酒精、2%次氯酸钠、琼脂糖、MS培养基、NAA、IBA、IAA、GA3、蔗糖、氢氧化钠、盐酸、蒸馏水、抗坏血酸、活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、蛭石、营养土。

1.2 试验处理与方法
1.2.1 外植体消毒方式筛选
采集‘京白梨’优株‘孟3’枝条，经水培抽芽后，每个瓶内接种3个‘京白梨’花芽和叶芽，5瓶为一个生物学重复，14 d后观察外植体污染结果。

采用2%的次
氯酸钠和0.1%的升汞溶液进行消毒处理。

1.2.2 组培外植体筛选
外植体采用带芽的越冬枝条以及水培抽出的花芽，接种到相同的培养基中，观察生长情况，统计污染率。

1.2.3 花芽愈伤组织培养基筛选
采用以下MS和1/2 MS两种培养基配制方法，30 d后观察花芽愈伤组织诱导情况。

表1 不同培养基花芽愈伤组织诱导处理Tab.1 Treatment of callus induction of flower buds in different mediums处理Treatment细胞分裂素6-BA/（mg/L）萘乙酸NAA/（mg/L）赤霉素GA3/（mg/L）MS 1/2 MS 2 2 0.05 0.05 3 3
1.2.4 ‘京白梨’组培快繁培养基优化
外植体选用‘京白梨’水培萌动的嫩芽，设计不同条件的培养基，包括MS类型，不同激素及浓度处理，通过观察组培苗增殖生根情况，筛选出最优培养基方案（表2、3）。

表2 组培苗增殖不同激素处理Tab.2 Different hormone treatments for proliferation of tissue culture seedlings处理Treatment CK T1 T2 T3 T4 T5
T6 T7 T8 T9 T10细胞分裂素6-BA/（mg/L）0.00 1.00 2.00 3.00 1.00 2.00
3.00 1.00 2.00 3.00 0.50萘乙酸NAA/（mg/L）0.00 0.05 0.05 0.05 0.50 0.50
0.50 1.00 1.00 1.00 0.50赤霉素GA3/（mg/L）0.00 1.50 2.00 3.00 2.00 3.00
1.50 3.00 1.50
2.00 0.00
1.2.5 数据处理方法
通过Excel 2013进行数据的整理计算；采用DPS 7.05统计软件进行方差分析，
采用单因素方差分析各处理差异的显著性水平，采用最小显著差数法（P＜
0.05,LSD）进行不同处理间均值的显著性差异比较。

污染率（%）=（污染外植体/接种外植体总数）×100；分化率（%） =（已分化的外植体数/接种外植体总数）×100；增殖率（%）=（处理后的有效芽数/接种外植体总数）×100。

2 结果与分析
2.1 外植体消毒方式对污染率的影响
外植体接种14 d后观察结果，采用2%浓度次氯酸钠的消毒方式污染率为33%，采用0.1%升汞的消毒方式污染率为18%。

表3 不同激素处理下‘京白梨’组培苗生根的培养基Tab.3 Mediums for rooting of tissue culture seedlings of‘Jingbaili’treated with different hormones处理Treatment CK S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13引哚乙酸IAA/（mg/L）0.00 0.10 0.20 0.30 0.10 0.20 0.30 0.10 0.20 0.30 0.00 0.00 0.50 1.00萘乙酸NAA/（mg/L）0.00 0.05 0.05 0.05 0.10 0.10 0.10 0.20 0.20 0.20 0.50 1.00 0.00 0.00 MS培养基类型Medium type of MS 0 1 1/2 1/4 1/2 1/4 1 1/4 1 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2
2.2 不同外植体的接种对比分析
外植体直接采用带叶芽及花芽的老枝条，经消毒接种到培养基后污染率达到
93.3%；而选用新发的花芽及嫩芽试验，污染率为0。

‘京白梨’组培试验中外植体的选择应避免使用老枝条，尽量选用刚萌动的嫩梢和花芽。

2.3 不同培养基对花芽愈伤组织形成的影响
在1/2 MS培养基中的‘京白梨’花芽外植体形成的愈伤组织比MS数量多，MS 愈伤组织分化率为33.3%，在1/2 MS培养基中愈伤组织的分化率为60%。

但是在1/2 MS中的愈伤组织出芽率较低。

2.4 赤霉素浓度对花芽愈伤组织诱导的影响
30 d后观察外植体生长状况，结果表明花芽在3 mg/L（图1b）和1.5 mg/L（图
1c）赤霉素浓度中均能诱导出愈伤组织，其中在1.5 mg/L浓度中生长良好，愈伤组织诱导个数较多，45 d后花芽愈伤组织分化出完整植株（图1a）。

图1 不同浓度赤霉素的‘京白梨’培养情况Fig.1 Culture of‘Jingbaili’with different concentrations of GA3
2.5 组培快繁技术培养基的优化
2.5.1 激素处理浓度对嫩梢外植体愈伤组织增殖的影响
不同处理间组培苗生长情况（表4），愈伤组织个数以T3、T9处理最高，约10个，其次为T6、T4处理，约为9个，与CK相比具有显著性差异；不定芽个数以T6处理最高，约为14个，其次为T3，约为13个，与CK相比具有显著性差异；增殖率以T6、T3处理最高，分别为94%、92%，显著高于CK；芽长度以T2、T4、T5处理最大，均为0.58cm，与CK相比具有显著性差异。

综合以上指标以及组培苗后期生长情况（表5），采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培养基最有利于组培苗增殖。

表4 不同激素处理对‘京白梨’外植体组培苗生长影响Tab.4 Effects of different hormone treatments on explants growth of‘Jingbaili’不同小写字母表示P=0.05的水平上差异显著性。

Different lowercase letters indicate significant differences at level of 0.05.处理Treatment CK T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10接种个数Inoculation number 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15愈伤组织个数Numb er of callus 02.44±1.59 b 07.38±2.73 a 07.95±1.62 a 10.19±3.01 a 09.52±2.08 a 08.08±4.28 a 09.64±1.59 a 08.59±1.01 a
07.88±0.61 a 10.38±2.6 a 07.92±3.5 a不定芽个数Number of adventitious buds 01.95±0.63 d 09.03±1.08 ab 02.90±0.63 ab 13.80±2.83 a 06.17±1.02 ab 11.12±1.27 ab 14.10±2.25 a 06.90±0.63 ab 04.95±0.59 ab 07.95±0.63 ab 09.45±0.14 c增殖率Multiplication rate（%）13 60 53 92 40 74 94 46 33
53 63芽长度Bud length/cm 0.18±0.16 d 0.51±0.1 ab 0.58±0.12 a
0.46±0.06 abc 0.58±0.08 ab 0.58±0.06 ab 0.52±0.1 ab 0.26±0.05 cd
0.37±0.11 abcd 0.31±0.05 bcd 0.48±0.12 abc
表5 不同激素处理的‘京白梨’外植体组培苗30 d生长特征Tab.5 Growth characteristics of‘Jingbaili’explants treated with different hormone treatments for 30 days处理Treatment CK组培苗生长特征Growth characteristics of tissue culture seedlings叶片发褐色，有褐色愈伤组织形成，叶片绿色较少，枝条发黑，生长较差，整个植株生长缓慢。

The leaves are brown with brown callus formation.The leaves are less green，the branches are black and the growth is poor.T1 T2 T3 T4 T5 T6 The whole plant grows slowly.中间叶片绿，较小，叶片边缘焦黄The middle leaves are green,smaller，and edges of the leaves are scorched yellow.叶片边缘焦黄，中间叶片绿Leaf margin is scorched yellow，middle leaves are green.叶片边缘焦黄，枝条切口处有愈伤组织形成Leaf margin is yellow with callus formation at branch incision.叶片较大，生长良好，叶片伸展，边缘无焦黄The leaves are large，well-growth，with extended leaves and no scorch on the edges.叶片生长良好，边缘无焦黄Leaf blades grow well with no scorch on edges.叶片较小，生长良好，萌发枝较多，叶片淡黄、浅绿Leaves are small，grow well，have more germinating branches and light yellow and green leaves.T7 T8 T9 T10植株矮小，叶片皱Short plants with wrinkled leaves.叶片皱，植株矮小，中间枝条发黑Leaves wrinkled，plants are short,middle branches blacken.植株矮小，叶片皱，叶片边缘焦黑Short plant，crinkled leaves，black edge of leaves.叶片嫩绿，茎干分枝较多Leaves are tender green and stems have more branches.
2.5.2 激素处理浓度对组培苗生根的影响
组培苗生根试验主要是通过NAA、IAA、IBA不同生长激素的浓度处理，以及使用不同类型的MS（MS、1/2 MS、1/4 MS）接种。

S3、S5、S7、S9生根培养基中，在15 d观察期内，发现组培苗基部有根原基形成，但在此期间未诱导形成根。

其中1/4 MS培养的‘京白梨’组培苗叶片在生长过程中出现发黄的现象。

45 d观察后（图2），S10、S11培养基中的‘京白梨’组培苗成功诱导生根，NAA激素浓度控制在0.5～1范围内都可以促进根系生成，但形成的根系较脆，移栽时容易断裂。

图2 ‘京白梨’组培苗诱导生根生长情况（45 d后）Fig.2 Rooting growth
of'Jingbaili'tissue culture seedlings（45 days later）
3 讨论
植物不同部位器官发育程度、遗传因素等生理状况存在一定差异性，因此，不同器官组织的外植体增殖系数存在一定差异性，多则可分化5～6个芽，少则分化1～2个芽，甚至无增殖现象。

适宜外植体的选择对离体组织培养成功至关重要，王萍等[5]以马铃薯的幼叶、茎段、微型和种薯的块茎为外植体进行诱导愈伤组织和植株再生试验，结果表明马铃薯的分化率在不同外植体间差异较大。

本研究发现，选用‘京白梨’优良植株老枝条为外植体进行接种污染率显著高于嫩梢，因此在外植体的选择上应尽量采用‘京白梨’植株幼嫩组织，如花芽或刚萌发的嫩梢。

植物不同外植体分化成芽体的时间也存在较大差异，陈桂敏等[6]利用蝴蝶兰的茎尖、根尖、叶片、花、花梗等外植体进行组培繁殖，发现不同外植体的增殖速度和增殖系数各有差异，其中花梗诱导花梗腋芽效果最佳，其它部位不能诱导原球茎。

本研究发现，‘京白梨’优良植株花芽愈伤组织分化成芽体的时间与嫩梢相比较晚，且不同器官的外植体增殖部位有差异性，有的从侧芽增殖，有的从基部愈伤组织增殖。

筛选合适的培养基对植物组织培养具有重要意义。

不同的培养基对外植体愈伤组织的诱导情况是有所差别的，如MS培养基容易诱导出愈伤组织，而B5培养基只能够形成芽点和根。

高疆生等[7]对1/2 MS、MS等几种培养基的梨外植体芽增殖率作了比较，发现MS培养基增殖率为15%～25%，1/2 MS培养基为70%。

本试
验结果表明采用1/2 MS培养基有利于‘京白梨’花芽愈伤组织的形成，但MS
培养基有利于组培苗后期生长，原因可能是前期的愈伤组织对MS大量元素要求
不高，但后期组培苗的生长需求MS量加大，以支撑苗株后期生长。

外源激素作为植物主要的生长调节剂，对组培苗的诱导分化、增殖和生根起到关键性的作用。

在梨的组培试验中，愈伤组织的形成、芽的分化、增殖系数与外源激素的种类、浓度及各激素间的配比有很大关系[8]。

本试验中，发现1.5 mg/L浓度GA3可能对组培苗的生长有一定影响，低浓度的生长调节剂NAA能促进茎干的
分支。

本试验中6-BA、NAA、GA3不同配比对梨的增殖效果明显，结果表明在
6-BA浓度不变的条件下，降低NAA浓度、提高GA3浓度或提高NAA浓度、降低GA3浓度均能促进梨组培苗的增殖。

外源激素梯度处理可在今后试验中继续优化，增加其它几种激素的处理，如TDZ等，进一步观察这些激素在不同水平下对
组培苗生长的影响。

梨属于难生根植物，只有极少数品种生根容易，绝大部分梨品种生根较难[9]。

‘京白梨’诱导生根试验中，S10、S11培养基中的‘京白梨’组培苗成功诱导出根系，证明在0.5～1 mg/L浓度范围内的NAA适合‘京白梨’组培苗根系生长。

‘京白梨’组培苗生根培养基S1～S9目前只能形成根原基，尚未成功诱导成根，梨组培苗生根条件比较复杂，与温度、光照、激素水平、碳源等外界条件有关。

本研究构建‘京白梨’优良单株组织培养高效快繁体系，通过研究不同外植体、消毒方式，以及不同激素处理对组培增殖生根的影响，为‘京白梨’的离体培养提供理论基础和科学依据。

近阶段，随着基因工程和生物技术的广泛应用，梨的离体培
养在基因工程育种中应用逐渐增多[10-14]。

梨组培过程中不易生根，很难在生产
实践中应用，且不同品种间的梨树基因型的差异性[15-17]增大了梨树离体培养体
系构建的难度。

因此，在今后的探索研究中，不断改进组培技术，减少试验成本，解决组培实际存在的问题将是今后努力发展的方向。

4 结论
选取水培枝条8～15 d后萌发的新嫩梢和茎尖作为外植体进行接种试验，可有效
减少污染率，提高‘京白梨’组培苗脱毒繁育成功率；‘京白梨’花芽愈伤组织在1.5 mg/L浓度赤霉素中生长良好，分化个数较多；采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培养基对‘京白梨’组培苗愈伤组织形成、不定芽生长个数、增殖率、芽长度、叶片生长情况均有良好的促进作用，其中T10培养基更有利于
新生枝干的萌发；在生根培养过程中，S10、S11培养基中的‘京白梨’组培苗在45 d后成功诱导生根。

因此，‘京白梨’优良单株组织培养快速繁育可以通过以
植株幼嫩组织作为外植体、以2%的次氯酸钠作为消毒剂、采用3 mg/L 6-
BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3作为增殖培养基、S10和S11作为生根培养基等来实现。

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