聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

班级：植物118 姓名：凌云学号：1101080807
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
2021.12.11 研究背景：
同工酶是指能催化同一种化学反映，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有
所不同的一组酶。

它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。

最近的研究说明，
同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调剂及抗性等都有必然的关系。

因此，测定
同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，
方式简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观看、记录和保留。

过氧化物酶
是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。

它与呼吸作用、光合作用及生长素
的氧化等都有关系。

在植物生长发育进程中它的活性不断发生转变。

因此，测定
这种酶的活性或其同工酶的转变情形，能够反映某一时期植物体内代谢的转变。

实验原理：
电泳现象：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(简
称EP )。

本实验采纳聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶
同工酶，依照酶的生物化学反映，通过染色方式显示出酶的不同区带，以鉴定小
麦幼苗过氧化物酶同工酶。

阻碍电泳的要紧因素：假设将带静电荷q的粒子放入电场，那么该粒子所收到的
引力F引可用数学式表示如下：F引=E·q （1）
式中E为电场强度，单位为“伏特/厘米”，表示电场中单位距离上的电位差。

若是这种情形发生在真空中，那么带电粒子会朝着电极加速前进而且最后与电极
相撞。

但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的
阻力F引相对抗，故上述现象可不能发生。

依照Stokes公式，阻力的大小取决于
粒子的大小和形状和所在介质的粘度：F阻=6πγηv （2）
式中F阻是球形粒子所受的阻力，γ是球形粒子的半径，η是溶液的浓度，v是粒子移动的速度。

在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此：
E·q=6πγηv （3）
整理可得：v= E·q
6πγμ（4）
由此能够看出，粒子移动速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（γ）和溶液的粘度（η）成反比。

不难想象，非球形粒子（如DNA）在电泳进程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子的形状有关。

由于带电粒子的泳动速度受场强阻碍，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。

为了便于分析比较，经常使用迁移率（泳动度）代替泳动速度表示粒子的泳动情形，迁移率（泳动度）的概念是：
带电粒子在单位电场强度下的泳动速度，假设以m表示迁移率，那么：
m=v/E （5）
将（4）代入（5）式得：m=q/6πγη（6）
由上式可看出，迁移率（泳动度）m仅与带电粒子所带电荷的数量、粒子大小及形状和溶液度有关，而与电场强度无关了。

由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度α随溶液pH转变而转变，因此在实际电泳中，咱们常利用有效迁移率那个概念，有效迁移率（μ）概念为迁移率（m）和那时条件下电离度α的乘积。

即：μ=m·α（7）
将（6）代入（7）式：μ=q·α/6πγη（8）
由（8）式可看出，凡能阻碍溶液粘度η的因素如温度，阻碍分子带电量q及电离度α的因素如pH值的改变，均会对有效迁移率产生阻碍。

因此，电泳尽可能在恒温条件下进行，并选用必然pH的缓冲液。

同时，所选用的pH以能扩大各类被分离物质所带电荷量的不同为宜。

如此，在外部条件大体稳固的情形下，各类成份将按其自身特有的性质在电泳中取得专门好的分离。

以上讨论的大体上是在溶液中进行的自由电泳的情形。

而在实际应用中，为了便于分析、鉴定、保留结果或制备的需要，咱们往往利用适宜的载体。

电泳时应幸免选用高电渗物质作支持介质。

适宜的支持介质是电泳技术成败的关键。

最后要考虑选用离子强度适宜的溶液，一样最适的离子强度在0.02-0.2之间。

在稀溶液中，离子强度I可用下式计算：
I=0.5∑M i Z i²（9）
式中：M i为离子的克分子浓度，Z i为离子的价数。

聚丙烯酰胺凝胶的形成与特点：这种凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合而成的。

Acr和Bis 在它们单独存在或混合在一路时是稳固的，且具有神经毒性，操作时应幸免接触皮肤，但在具有自由基集体系时，它们就聚合，引发产生自由基团的方式有两种，即化学法和光化学法。

化学聚合的引发剂是过硫酸铵，催化剂是N,N,N'N'-四甲基乙胺（TEMED）。

在催化剂TEMED作用下，由过硫酸铵（Ap）形成氧的自由基，从而引发聚合作用。

TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢。

一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，这些因素在实际操作时应予以操纵。

光聚合以光灵敏物核黄素作为催化，痕量氧存在下，不太稳固，因此用它制备大孔痕的浓缩胶较为适合，采纳化学聚合形成的凝胶孔径较小，而
且重复性好，经常使用来制备分离胶。

聚丙烯酰胺的大体结构，为丙烯酰胺单位组成的长链，链与链之间通过甲叉桥联在一路。

链的纵横交织，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质，网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。

另外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳固的亲水凝胶。

该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。

这些特点，使得聚丙烯酰胺专门适于作区带电泳的支持介质。

聚丙烯酰胺凝胶的质量要紧由凝胶浓度和交联度决定。

每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度。

用T%表示。

凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数称为交联度，用C%表示，改变凝胶浓度和交联度，可取得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各类样品的分离。

一样经常使用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，可骼2.4%的分离核酸。

但依照蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。

凝胶系统：
本实验采纳不持续的聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦苗过氧化物酶的同工酶，系统的不持续性表此刻以下几个方面：
（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。

上层为大孔径的浓缩胶，基层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。

本实验采纳碱性系统。

电极缓冲液为pH8.3的Tris-Gly缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。

而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

（3）由于pH不持续，在电场中形成了不持续的电位梯度。

在如此一个不持续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

在这三种
效应的一起作用下，待测物质被专门好地分离开来。

下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，别离说明三种效应的作用：
（1）电荷效应：各类酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向必然电极，以必然速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳进程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规那么的分子，电泳进程中受到的阻力较大，移动较慢。

这种效应与凝胶过滤进程中的情形不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被紧缩成层，而使原先很稀的样品取得高度浓缩。

其缘故如下：
A.由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。

使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。

B.在聚丙烯酰胺凝胶中，尽管浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，基层分离胶为pH 8.9。

HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl 几乎都全数电离，Cl－布满整个胶板。

待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。

电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。

在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。

如此，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。

在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持散布于界面周围，慢慢形成一个区带。

由于快离子快速向前移动，在其原先停留的那部份地域成了低离子浓度区，即低电导区。

因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：V=I/S
因此在电流恒定条件下低电导区双侧就产生了较高的电位梯度。

这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。

本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在那个追赶中被慢慢地紧缩聚集成一条更为狭小的区带。

这确实是所谓的浓缩效应。

在此区带中，各类酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成假设干条离得很近但又不同的“起跑线”。

当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变成8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。

现在，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不持续的高电位梯度再也不存在。

于是，尔后的电泳进程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。

与持续系统相较，不持续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前普遍利用的分离分析手腕。

8.样品的检出及分析鉴定和保留
仪器试剂：
材料：小麦幼苗
仪器：电泳仪一套（稳压电源及垂直板电泳槽）北京六一仪器厂
微量进样品，100μl 上海医用激光仪器厂
试剂：2%琼脂、分离胶缓冲液pH8.九、浓缩胶缓冲液pH6.7、过硫酸铵溶液、电极缓冲液pH8.3、pH4.7乙酸缓冲液、样品提取液、0.5%溴酚蓝溶液、联
大茴香胺染色液、TEMED(四甲基乙二胺)
实验步骤：
1.贮液配制（已配好）
2.凝胶的制备
（1）将贮液由冰箱掏出，待与室温平稳后再配置工作液
（2）安装电泳槽。

安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡使劲，以避免夹碎玻璃片（3）用2%的琼脂糖封底，以防漏胶
（4）按下表所示配制分离胶
在小烧杯中混匀后，当即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端中央某点，警惕估倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2厘米左右即可，放平电泳槽，当即用滴管在胶的上层警惕轻缓地覆盖约2-3毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，阻碍结果，刚加水时，可看出界面，后慢慢消失，等到再显现界面时，说明分离胶已聚合，再静置一会儿，即可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后预备灌注浓缩胶。

（5
）按下表所示配制浓缩胶
左右即可，然后当即插入样品槽模板（梳子）。

明确聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后警惕拨出梳子，预备点样。

3.样品的制备（实验前已完成）
4.点样向样品液中滴加1至2滴溴酚蓝溶液做为前沿指示，然后用微量进样品警惕吸取样品液加到样品槽内。

上样量：叶片样液和根部样液均以梯度上样：5μl、15μl、30μl、50μl
5.电泳
接好电源线(注意电极!)。

打开电源开关，调剂电流，初始时操纵在15mA左右，当前沿进入分离胶后，可调剂电流到30mA 左右，待前沿指示染料下行至距胶板结尾1-2厘米处，即可停止电泳。

6.剥胶、染色及记录结果
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳终止以后，将垂直板从电泳槽上取下，警惕地将两块玻璃板分开，并警惕地将凝胶置于大培育皿中，进行染色反映（浓缩胶能够去掉）。

过氧化物酶在分解过氧化氢的进程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反映，产生褐色的化合物，因此用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位能够看到褐色的谱带。

染色过程如下：
（1）向大培养皿中倒入约50mlpH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡6-7分钟。

（2）用漏斗回收乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20分钟，在此期间会显现过氧化物酶同工酶的谱带，观看记录酶谱。

实验现象：
结果分析：
全模式根部电泳共显现了5条酶带，由上向下可编号为一、二、3、4、5，叶部电泳共显现4条酶带，与根部对照缺少4号酶带。

一、二、3号酶带靠近负极，4、5号酶带靠近正极。

对照如下：
整体：小麦幼苗根部同工酶总含量高于叶部，上方的同工酶含量根部少于叶部，下方根部多余叶部。

分析：一、二、5带迁移率相同，能够看做小麦幼苗的特点谱带，但明显这3者在叶片和根部的含量和活性是不同的。

与各营养器官执行的功能有直接联系。

4号带在根部有，叶部却没有。

反映了小麦生长初期的代谢特点。

依照5条带迁移
情形，可判定5种过氧化氢同工酶的分子量1>2>3>4>5.（设带电量相同）小麦根部的POD同工酶分子量小，形状更接近球形，要紧进行脂肪的β-氧化，产生乙酰辅酶A，经乙醛酸循环，由异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸，加入三羧酸循环.小麦叶部的POD同工酶分子量较大，要紧参与光呼吸作用，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢。

试探题：
一、凝胶的化学聚合与光聚合有何不同？
答：化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3，催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺。

在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵形成的自由基又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。

TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。

这些因素在实际操作时都应予以操纵。

光聚合以光灵敏物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引发聚合作用。

过量的氧会阻止链长的增加，应幸免过量氧的存在。

光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时刻的延长而慢慢变小，不太稳固，因此用它制备大孔径的浓缩胶较为适合。

采纳化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，经常使用来制备分离胶。

二、两个电泳槽中的电极缓冲液用过一次后，是不是能够混合后再用？什么缘故？
答：不能。

因为电极缓冲溶液的缓冲能力与组成缓冲溶液的组分浓度和pH值有关，在电泳进程中水会被电离生成氢气和氧气，两个电泳槽的电极缓冲液用过一
次后，缓冲液里离子的浓度会增大，造成缓冲液的缓冲能力发生转变，离子强度过大，会阻碍到蛋白质的活性，使电泳速度减慢，条带不清楚。

因此不能混合后再利用。

3、样品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？
答：①增加样品比重，使得样品能够沉到加样孔底部，而可不能漂出来，避免样品扩散，从而能够使样品最大限度地跑到胶里去
②避免细菌生长
4、本实验的关键步骤有哪些？什么缘故？
答：①凝胶的制备：两种胶制备完成后需当即灌胶，因为加入TEMED和过硫酸铵后，胶即刻反映，假设不及时灌胶那么会致使凝胶凝固不均匀，形成条带形状不规那么。

覆盖水层时要轻缓，假设过猛那么会冲撞胶面致使分离起点不一致阻碍实验结果。

灌胶完毕后要当即插入梳子，不然凝胶凝固再插梳子那么会毁胶。

拔梳子时应垂直向上，均匀使劲，缓慢拔出，不然会致使样品槽损毁。

总之，假设凝胶制备显现问题那么直接致使电泳条带不清楚、变形、拖尾等，直接阻碍实验结果。

②电泳：电泳时应注意正负接线柱的正确连接，矮玻板连接负极，长玻板连接正极，以避免样品反方向泳动。

电流的调控，接触不良、缓冲液液位太低或缓冲液离子强度过小致使电阻太大,电流变小.这时若是通过调高电压来使电流增大还可能会烧胶。

电流过大、过热也会致使凝胶变性从而达不到分离样品的目的。

参考文献：
1.基础生物化学实验指导中国农业大学2020.08
2.基础生物化学赵武玲主编中国农业大学出版社2020.05
3. 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
实验小结：
一直都对电泳很感爱好充满好奇心，也一直都想做那个实验，今天终于做完了，可能是因为很感爱好，因此操作进程中都专门顺利，没有显现任何过失，较靠前完成了整个实验。

因此我感觉爱好专门地重要，一下午都感觉过的好快。

以后要尽可能培育自己在其他方面的爱好，尽力寻觅情形的闪光点。