微生物限度检查方法的验证

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加稀释剂至 10ml ，取 1ml 注平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌数：B) 或 3000rpm 离心取沉淀，加稀释剂至 10ml ，取 1ml 注平皿，平行 2 个 平皿（计算平均菌数：B) 试验组：最低稀释级供试液 10ml+离心，500rpm 离心取上清，加稀释剂 至 10ml，取 1ml+1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌数：A)或 3000rpm 离心取沉淀，加稀释剂至 10ml，取 1ml+1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组：取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂 10ml，3000rpm 离心 取沉淀，加稀释剂至 10ml，取 1ml 注平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌 数：D)（稀释剂对照组与试验组同法操作） 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.4 试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法） 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：含 1g 或 1ml 的供试液，过滤冲洗，至少 1 张膜（菌落 计数：B) 试验组：含 1g 或 1ml 的供试液，过滤冲洗，+1ml 菌液，过滤，至少 1 张膜（菌落计数：A) 稀释剂对照组：稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少 1 张膜（菌落计数：D)
过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂培养基平板上， 菌面朝上。过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫瑰红钠琼 脂培养基平平板上，菌面朝上。 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组回收率=D÷C×100%
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11.3 计数方法的确定 细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。 细菌以各试验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的
(3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～ 28℃培养 5～7 天，加 3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出 菌液，取 1ml菌液加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法， 稀释至 10-4～10-6，使菌数约为 50～100cfu/ml。 8.供试品的处理：
生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验
菌，使最终菌浓度为每 1ml 供试液含 50～100cfu，按试验组的供试液
制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
9.结果判断指标
试验组的菌回收率（≥70%）
稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）
10. 回收率计算：
阳性菌 实验次数
1
大肠
2
埃希菌
3
1
枯草芽
2
孢杆菌
3
表 1 试验组回收率测定结果
菌液组 菌落数
试验组 菌落数
供试品对照组 菌落数
回收率％
1
金黄色
葡萄球
2
菌
3
1
白色
2
念珠菌
3
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1
Hale Waihona Puke 黑曲2霉菌
3
注：
（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）
回收率 ＝
× 100％
菌液组平均菌落数
每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每 次试验的回收率。 验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。验证霉菌、酵母菌各平皿倾 入玫瑰红钠琼脂培养基。置规定温度培养 48 或 72h,菌落计数。计算回 收率。 11.回收率测定举例 11.1 供试液不用特殊制备方法 11.1.1 常规法 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml/平皿，平行 2 个平皿（计算供试 液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 1ml+ 1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算 供试液平均菌数：A） 回收率=(A－B)÷C×100% 11.1.2 培养基稀释法（5 个平皿） 菌液组：1ml 菌液/平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml 分别注 5 个平皿，0.2ml /平皿， 平行 2 份，共 10 个平皿（计算 0.2ml 供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 0.2ml+1ml 菌液/平皿，注 5 个平皿，平行 2 份（计算平均菌数：A) 回收率=(A－B)÷C×100% 培养基稀释法可以是 1ml 供试液注 2 个、5 个或更多个平皿。但是 更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。
固体：10g 供试品+稀释剂至 100ml 液体：10ml 供试品+稀释剂至 100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。
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• 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。 8.1 菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的 1ml 菌液（约 50～100cfu），分别注入平皿中，立 即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌 落数。 8.2 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底 菌数。（和试验组采用同法） 8.3 试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 和 50～100cfu 试验菌， 分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿， 按平皿法测定其菌落数。 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 分别 注入 n 个平皿，每个平皿再注入 50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中， 立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 份，按平皿法测定其菌落 数。 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗， 应在最后一次的冲洗液中加入 50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤 法测定其菌数。至少要一张膜。 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许 多药渣，先以低速 500r/min 离心 3～5min，取上清液，再以 3000 r/min
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离心 10～30min，取下面 1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，
将洗涤液与液体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
8.4 稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜
过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微
若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70%，应采用培养基稀释法、 离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除 供试品的抑菌活性，并重新验证。
二、控制菌检查法的验证
1.试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。 1.1 阴性对照菌株:选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外用选用大肠 埃希菌 。 1.2 菌种的要求：不得超过 5 代。采用适宜的方法保存。 1.3 加菌量:10～100cfu
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包括: 1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证——准确性（回收率） 2.控制菌检查法的验证——专属性 3.实例
一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
1.验证的目的： 确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照
此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验 结果的准确、可靠。 2.验证的步骤： •根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 •保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。 •按制定的方法进行试验。 •根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条 件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进 行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。
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表 2 稀释剂对照组回收率测定结果
阳性菌
大肠 埃希菌
实验次数 1 2 3
菌液组菌落数
稀释剂对照组菌落数 回收率％
1
枯草芽
2
孢杆菌
3
1
金黄色
葡萄球
2
菌
3
1
白色
2
念珠菌
3
1
黑曲
2
霉菌
3
注：
稀释剂对照组平均菌落数
回收率 ＝
× 100％
菌液组平均菌落数
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回收率均能达到 70%以上的检测方法为准。 霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达
到 70%以上的检测方法为准。 11.4 计数方法的验证——结果判断
在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。
若试验组的菌回收率均不低于 70%，则按此供试液制备方法和计数 法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法 及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进 行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3. 验证用菌株： 细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。 霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至 10ml营养肉汤中，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7， 使菌数约为 50～100cfu/ml。
(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml改良马丁培养基中，23～ 28℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml， 采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7，使菌数约为 50～100cfu/ml。
试验组回收率测定结果阳性菌实验次数菌液组菌落数试验组菌落数供试品对照组菌落数回收率枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球白色念珠菌微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数回收率稀释剂对照组回收率测定结果阳性菌实验次数菌液组菌落数稀释剂对照组菌落数回收率枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球白色念珠菌稀释剂对照组平均菌落数回收率微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理每一验证菌株均应进行上述试验
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菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中 常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过 5 代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。 4.验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心 沉淀法、联合方法。 5.样品稀释级的选择：最低稀释级，1g 或 1ml。 6.培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养 基、改良马丁琼脂培养基。 7.菌液制备
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11.2 供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等) 11.2.1 常规法 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml /平皿，平行 2 个平皿（计算供 试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 1ml+ 1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算 供试液平均菌数：A） 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂 + 1ml 菌液，平行 2 个平皿 （计算供试液平均菌数：D） 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.2 培养基稀释法（5 个平皿） 菌液组：1ml 菌液/平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml 分别注 5 个平皿，0.2ml /平皿， 平行 2 份，共 10 个平皿（计算 0.2ml 供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 0.2ml+ +加中和剂或乳化剂 1ml 菌液/平皿， 平行 2 个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+ 1ml 菌液，平行 2 个平皿（稀 释剂对照组与试验组同法操作）（计算平均菌数：D) 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.3 供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法） 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 10ml +离心，500rpm 离心取上清，