金黄色葡萄球菌α溶血素基因的克隆与表达

椰试ｎ—～
Ｂ“ｌＨＩ，ｓａｃＩ双酶切
２．２．９．２ｐＱＥ．３０原核表达载体的构建
Ｉ将ｐＱＥ．３０载体质粒热转化至Ｅ∞打ｘＬＩ．Ｂ１ｕｅ感受态细胞中，３７℃摇床中振荡培养过夜后，提取质粒。

ＩＪ将质粒ｐＱＥ·３０用鼠ｗＨＩ和＆配Ｉ进行双酶切，使用ＤＮＡ纯化／回收试剂盒回收载体。

ｌＩｌ将重组克隆质粒ｐＭＤｌ８．Ｔ＿Ⅱ用肋ｍＨＩ和ｓ∞Ｉ进行双酶切，使用ＤＮＡ纯化／回收试剂盒回收＊溶血素基因片段。

Ⅳ使用Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ，将插入片段金黄色葡萄球菌ｎ一溶血素基因与载体ｐＱＥ一３０连接后．热转化至Ｅｃ０，ｆｘＬＩ－Ｂｌｕｅ感受态细胞中，涂布平板过夜培养菌体。

ｖ挑取白色菌落，提取质粒。

Ⅵ质粒用砌ｍＩ和＆＂Ｉ进行双酶切检测，确认目的片段有无插入载体中。

ｖｕＰＣＲ鉴定重组表达质粒ｐＱＥ－３０一Ⅱ。

ⅥＩＩ重组表达质粒的序列测定和序列分析
按上海生工生物工程技术服务有限公司的要求，取鉴定为阳性的重组表达质粒１个，无菌操作保存为甘油保存菌（４０％甘油与ＬＢ液体菌以体积比１：１的比例混合），装至１．５ｍＬＥＰ管中，封口膜封口后，ＥＭｓ邮寄测序。

所获序列用Ｂｌａｓｔ程序与ＧｅｎＢａｎｋ中己发表的标准序列进行比较。

２－２．１０原核表达
２．２．１０．１表达蛋白提取流程图
黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章实验结果
第三章实验结果
３．１金黄色葡萄球菌睁溶血素基因扩增结果
３．１．１目的基因片段的扩增结果
金黄色葡萄球菌＊溶血素基因的大小为Ｏ．９６ｋｂ：上游引物５’端加入砌，ＨＩ限制性酶切位点，下游引物５，端加入＆ｗＩ限制性酶切位点。

经过３０次循环的ＰｃＲ扩增后，所获ＰＣＲ产物以ｌ％琼脂糖凝胶电泳，ＧｏｌｄｖｉｅＷ“ＤＮＡ染料染色后呈现约０．９６ｋｂ的条带，与预期大小相符，电泳结果见图３．１。

扩增ｎ．溶血素：Ｏ．９６ｋｂ。

图３．１廿溶血素ＰＣＲ产物的电泳分析
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｃｒＤＬ２０００：ｌ：ＰｃＲ产物，ｎ９６ｋｂ
Ｆｉｇｕｒｃ３－ｌＡｇ啪ｓｃｇｅｌｅｌｅｃ仃０ｐｈｏ托ｓｉｓｏｆｔｈｅＰｃＲｐｍｄｕｃｔ
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；ｌ：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ，０．９６ｋｂ
３．１．２目的片段的回收和纯化结果
应用杭州维特洁生化技术有限公司的ＤＮＡ凝胶回ｌ｜殳／纯化试剂盒（ＤＮＡＧｅｌＥ】（ｎ∞ｔｉｏｎＫｉｔ）进行目的Ｄ１ｑＡ片段的回收和纯化，琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。

结果见图３．２。

图３－２ＰｃＲ产物回收纯化电泳结果
Ｍ：Ｄ１ｑＡＭａ妇ＤＬ２０００：ｌ：ＰｃＲ产物，０．９６ｋｂ
ｐｕ瑚硎ｏｎｏｆＰＣＲｐｍｄｕｃｔ
ＦｉｇＬＩｒｃ３—２Ｒｅ埘ｅｖｅｍ衄ｔ卸ｄ
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｃｒＤＬ２０００；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ，Ｏ．９６ｋｂ
黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第三章实验结果３．２Ⅱ一溶血素基因的克隆及序列测定结果
３．２．１克隆载体重组质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ＿ａ的酶切鉴定结果
将上述ＰｃＲ产物回收纯化后，连接到ｐＭＤｌ８－Ｔ克隆载体上，转化到ｘＬＩ－ＢｌＩｌｅ感受态细
胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落扩增培养后提取质粒．用限制性内切酶＆ⅫＨＩ消化重组质粒，筛选出含有ｐＭＤｌ８－１’吨的重组克隆，而后用砌ｌＨＩ剽５幻Ｉ限制性内切酶进行双酶切鉴定。

重组质粒经双酶切后出现０．９６ｋｂ的插入片段和２．６９２ｋｂ的载体，证明所获克隆为正确
的重组体。

将此质粒命名为ｐＭＤｌ８一Ｔ－Ⅱ。

ｐＭＤｌ８·Ｔ克隆载体大小为２．６９２ｋｂ。

结果见图３—３。

图３－３ｐＭＤｌ８－Ｔ．ａ克隆载体重组质粒的酶切鉴定
Ｍｌ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒｂ胁棚ＩⅡｄｉｇｃ咄Ｍ２：ＤＮＡＭａ岫ｒＤＬ２０００；
】：ＤＭＤｌ８．Ｔ，２．６９２ｋｂ；ａ＿溶血素，Ｏ．９６ｋｂ
Ｆｉｇ眦３·３Ｉｄｃｎｔｉ疗僦ｉｏｎｏｆ船ｐＭＤｌ８－～ｖｃ咖ｒ时Ｔｃ矧“０ｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅ弑ｄｉｇｅｓＩｉｏｎ
Ｍｌ：ＤＮＡＭａｒｋｃｒｂ胁柏Ⅲｄｉｇｅ或；Ｍ２：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００：
Ｊ：ｐＭＤｌ８－Ｔ，２．６９２ｋｂ；ａ＿ｈ哪ｏＪ徊Ｄ，０．９６ｋｂ
３．２－２克隆载体重组质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ＿ａ的ＰＣＲ鉴定结果
取重组质粒ｌ止，，作５００。

稀释后，再用ｌ灿作模扳。

ＰｃＲ体系的组成、反应程序同前所述。

扩增完毕后，取５此ＰＣＲ产物上样，ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

结果扩增出约Ｏ．９６ｋｂ大小的一条带，与预计结果相符，表明＊溶血素基因已正确插入克隆载体中。

结果见图３—４。

图３－４ｐＭＤｌ８－Ｔ克隆载体重组质粒的ＰｃＲ鉴定
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋ盯ＤＬ２０００；ｌ：ＰｃＲ产物，Ｏ．９６ｋｂ
ＦｉｇＬ鹏３－４Ｉｄ∞ｄ疗ｃ撕ｏｎｏｆ慨ｐＭＤｌ８－Ｔ．ａｖ。

ｃｔｏｒｂｙＰＣＲ
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｃｒＤＬ２０００；１：ＰＣＲｐｍｄｕｃｔ，０．９６ｋｂ
３．２．３旺．溶血素基因的序列分析结果（波形图见附录）
对含ｑ．溶血素基因的重组质粒进行ＤＮＡ序列测定。

所获序列提交ＧｅｎＢ∞ｋ数据库，用Ｂｌａｓｔ程序与己发表的＊溶血素基因序列进行比较，结果在测序所得的９５４个碱基中，仅有５个碱基差异，分别是第１５４和３１３位的Ｇ变成了Ｔ，３３６位的Ｇ变成了Ａ，６６６位的Ｃ变成了Ａ，８００位的Ａ变成了ｃ．同源性高达９９．９９％以上，说明克隆的ｍ溶血素基因是正确的。

３．２．４蛋白质翻译结果
在ｎ．溶血素序列测定中，共有５个碱基发生突变，其中，有一个碱基为无意义突变，没有引起氨基酸的改变，其余４个碱基引起了氨基酸突变。

即５２位氨基酸Ｖ突变为Ｆ，１０５位氨基酸Ａ突变为ｓ，２２２位氨基酸Ｆ突变为Ｌ，２６７位氨基酸Ｑ突变为Ｐ。

氨基酸同源性高达９９．９８％以上。

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３．３．１ｐＱＥ－３０表达载体质粒的提取结果
将ｐ（疆．３０载体质粒热转化至Ｅｃ础ｘＬＩ－Ｂｌｕｅ感受态细胞中，３７℃摇床中振荡培养过夜后提取质粒。

结果见图３—５。

图３－５ｐＱＥ＿３０表达载体质粒的电泳分析
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒｎ胁硼ｍｄｉｇｅｓＥ：１：ｐＱＢ３０载体，３．４ｋｂ
Ｆｉｇｕｒｃ３－５Ｐｌ踟ｉｄｏｆｐＱＥ－３０“ｐｒｅｓｓＶｅｃｔｏｒ
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋ盯ｎ胁棚ＩⅡｄｉｇｃｓｂｌ：ｐＱＢ３０ｖｅｃ时，３，４ｋｂ
３．３．２ｐＱＥ－３０载体质粒的酶切和回收结果
将质粒ｐＱＥ．３０用肋ｍＨ１和跏１进行双酶切，使用ｕＮＡ纯化，回收试荆盒同收载体。

结果见图３－６。

图３－６ｐＱＢ＿３０载体质粒麓切回收电泳分析
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒｋ肋硼ＩＩＩｄｉｇｅｓｔ；１：ｐＱＥ·３０载体，３．４ｋｂ
Ｆｉｇｌｌ化３－６Ｒｅｓ晡ｃｎ蚰ｅｎｄ伽ｕｃｌ龃ｓｅｄｊｇｃｓｔｉｏｎａｎｄｒｃ啊ｅｖｃｍｅ士ｌｔｏｆｐＱＥ．３０ｖｃｃｔｏｒ
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒｎ胁埘ＩＩＩｄｉｇｃｓｔ；ｌ：ｐＱＥ－３０ｖｅｃｔｏｒ’３．４ｋｂ
３．３．３酶切ｐＭＤｌ８－Ｔ－Ⅱ克隆重组质粒，获得外源片段洳溶血素
将克隆重组质粒ｐＭＤｌ８．Ｔ．ａ用＆ＭＨＩ和ｓ∞Ｉ进行双酶切，使用ＤＮＡ纯化，回收试剂盒回收Ⅱ－溶血素基冈片段。

结果见图３—７。

图３．７酶切回收外源片段ｎ．溶血素
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００：１：ＰｃＲ产物，０．９６ｋｂ
Ｆｉｇｕｒｅ３·７Ｒｅ矧ｃｔｉ叩锄ｄ蚰ｕｃｌｃａ辩ｄｉｇｅｓｎｏｎ柚ｄ脯ｉｅｖｅｍｅｎｔｏｆⅡ·ＨＬ
Ｍ：ＤＮＡＭ出ｒＤＬ２０００；ｌ：ＰＣＲｐｒｏ“吐，０．９６ｋｂ
３．３．４表达载体重组质粒ｐＱＥ．３０＿旺的酶切鉴定结果
质粒用肋ｍＨＩ和ｓ斑Ｉ进行双酶切检测，确认目的片段有无插入载体中。

其中，ｐＱＥ·３０载体大小为３．４ｋｂ，插入片段即为金黄色葡萄球菌Ⅱ—溶血素，人小为０．９６ｋｂｏ酶切结果切出约３．４ｋｂ和０．９６ｋｂ大小的两条带．与预计结果相符，表明舡溶血素基因已正确插入表达载体中。

黑龙江八一农垦大学颁士学位论文第三章实验结果结果见图３．８。

图３·８酶切鉴定表达载体重组质粒ｐＱＥ－３０ｍ
Ｍｌ：ＤＮＡＭ盯ｋｃｒＤＬｌ５０００；Ｍ２：ＤＮＡＭａｒｋｃｒＤＬ２０００；１、２：ｐＱＥ－３０—ａ
Ｆｉｇｕｒｅ３－８ｌｄｅ州ｎｃ砒ｉ∞ｏｆｔｈｃｐＱＥ·３０＿ａｂｙ他鲥州帅ｅｎｄｏ叫ｄｃ船ｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍ１：Ｄ州ＡＭａｒｋｅｒＤＬｌ５０００：Ｍ２：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；ｌ、２：ｐＱＥ－３０－ａ．
３．３．５表达载体重组质粒ｐＱＥ－３０－ａ的ＰＣＲ鉴定结果
取重组质粒ｌｐｌ，作５００。

稀释后，再用１山作模板。

ＰｃＲ体系的组成、反应程序同前所述。

扩增完毕后，取５山ＰＣＲ产物上样，１％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

结果扩增出约０．９６ｋｂ大小的一条带，与预计结果相符，表明＊溶血素基因已正确插入表达载体中。

结果见图３．９。

围３—９ＰｃＲ鉴定表达载体重组质粒ｐＱＥ．３０吨
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋ盯ＤＬ２０００．
１、２：ＰｃＲ产物，Ｏ．９６ｋｂ．
Ｉｄｃｎ廿６ｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐＱＥ－３０＿ⅡｂｙＰｃＲ
Ｆｉｇｕｒｃ３－９
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００．
１、２：ＰＣＲｐｍｄｕｄ，０９６ｋｂ
３．４ｑ．溶血素基因的表达结果
重组质粒转化到ＥｃＤ疗ｘＬＩ－Ｂｌｕｅ后，经ＩＰｌ℃诱导，提取蛋白，进行ＳＤｓ－ＰＡＧＥ电泳。

天然Ⅱ一溶血素蛋白大小约３３ＫＤａ，与天然蛋白大小相符。

结果见图３．１０。

图３－１０ｓＤｓ．ＰＡＧＥ电泳结果
Ｍ：标准低分子量蛋白质Ｍ咄ｅｒ．
１：＊溶血素，诱导后３小时
２：＊溶血素，诱导后５小时
３、４：空菌体对照
３－１０Ｅｌｅｃ口ｏｐｈｏｒ商ｓｒｃｓｕｌｔｏｆｓＤｓ－ＰＡＧＥ
Ｆｉｇｕｒｅ
Ｍ：ＬＭＷＭａｄ口：
ａ船．ｍｄｕｃｔｉ蚰
ｌ：讪铷Ｏｌｙｓｉｎ，３ｈＬ
２：ｍ锄Ｏｌｙｓｉｎ，５ｈ出盯．ｍｄｕｃｔｉｏｎ
３、４：ｃｏｎｎＤｌｏｆｎｌｌｌ血ａｌｌｕｓ
３１。