盐酸埃克替尼对人非小细胞肺癌HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响

盐酸埃克替尼对人非小细胞肺癌HCC827细胞凋亡及EGFR
下游信号通路蛋白表达的影响
李磊;钟敏钰;宋海斌
【摘要】Objective To investigate the influence of icotinib hydrochloride on apoptosis of non-small cell lung cancer cell (NSCLC)-HCC827 and the protein expression levels of EGFR downstream signaling pathways in vitro.Methods The influence of icotinib hydrochloride on proliferation of HCC827 cell was detected by MTT,and the effects of icotinib-induced apoptosis of HCC827 cell were observed by flow cytometry,moreover, the expression levels of EGFR signaling pathways downstream proteins including epidermal growth factor receptor (EGFR),protein kinase B (AKT),extracellular signal regulating EGFR kinase (ERK),p-EGFR,p-AKT,p-ERK and Survivin were detected by Western Blot.Results The icotinib hydrochloride had inhibitory effects on HCC827 cell proliferation and could induce apoptosis of HCC827,with a concentration dependent and time dependence manner (P<0.05).With the increase of icotinib concentration,the expression levels of EGFR signaling pathways downstream protein including p-EGFR,p-AKT,p-ERK and Survivin were significantly down-regulated (P<0.05).Conclusion The icotinib hydrochloride can effectively inhibit HCC827 cell proliferation and induce apoptosis of HCC827 cells by inhibiting the expressions of EGFR signaling pathways downstream protein.%目的探讨盐酸埃克替尼(Icotinib)对人非小细胞肺癌(NSCLC)HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响.方法通
过噻唑蓝比色(MTT)法检测Icotinib对HCC827细胞增殖的影响,流式细胞仪观察Icotinib对HCC827细胞凋亡的诱导作用,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、胞外信号调节激酶(ERK)、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平.结果Icotinib抑制HCC827细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用具有浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05);随着Icotinib对HCC827细胞作用的药物浓度升高,p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平均明显下调
(P<0.05).结论 Icotinib可能通过抑制EGFR下游信号通路蛋白的表达,进而有效抑制HCC827细胞的增殖和诱导HCC827细胞的凋亡.
【期刊名称】《河北医药》
【年(卷),期】2017(039)017
【总页数】4页(P2585-2588)
【关键词】盐酸埃克替尼;非小细胞肺癌;凋亡;表皮生长因子受体
【作者】李磊;钟敏钰;宋海斌
【作者单位】430022 湖北省武汉市第一医院肿瘤科三病区;430022 湖北省武汉市第一医院肿瘤科三病区;430022 湖北省武汉市第一医院肿瘤科三病区
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
肺癌是发病率较高的恶性肿瘤疾病，由于临床上缺乏灵敏且有效的早期诊断指标，大多数肺癌患者确诊时已处于晚期阶段，而上述患者仅能采取放化疗或靶向性治疗[1]。

近些年随着研究人员对靶向性治疗认识的不断深入，表皮生长因子受体酪氨
酸激酶抑制剂(epider-mal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)已成为治疗晚期非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)的新型措施，而表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)突变患者疗效更为显著[2]。

盐酸埃克替尼(Icotinib)是一种新研制而成的EGFR-TKI，可特异性和竞争性的与EGFR酪氨酸激酶功能区相互结合，进而有效抑制其生理活性功能，最终起到阻断肿瘤细胞增殖、凋亡等相关信号传导通路的药理作用[3-5]。

本研究拟探讨Icotinib对人非小细胞肺癌HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响，为Icotinib的临床应用提供有利的实验依据。

1.1 研究细胞及实验试剂人非小细胞肺癌HCC827细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，Icotinib购自浙江贝达药业有限公司，RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，四甲基偶氮唑(MTT)购自华美生物公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD公司，兔抗人EGFR、蛋白激酶B(AKT)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin抗体均购自Cell Signaling 公司。

1.2 细胞培养方法 HCC827细胞由本实验室根据常规方法在RPMI 1640培养液(内含10%浓度的胎牛血清、12 kU/L浓度的庆大霉素)，37℃、饱和湿度及
5%CO2的孵育箱内进行传代培养，0.25%胰酶消化液予以消化传代，每间隔2～3 d传代一次。

1.3 MTT检测方法将生长良好的HCC827细胞制备成细胞悬液，使得细胞浓度为1×105/ml，在培养板中依次进行接种，每孔加入90 μl细胞悬液，分别在每孔内加入Icotinib培养液，使孔内Icotinib药物终浓度为0.1、1 μmol/L。

另设阴性对照组及空白组，各设置6个复孔进行对比研究。

在细胞培养箱中分别培养24、
48、72 h后，加入100 μl体积的MTT溶液，室温条件下培养4 h后离心处理后吸弃上层细胞培养液，然后将100 μl体积的DMSO依次加入每孔，与孔内液体
充分溶解15 min。

采用A570nm对每孔的OD值进行检测，并计算细胞生长抑
制率。

1.4 细胞凋亡率检测采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒对细胞凋亡率进行
检测，具体方法按照试剂盒说明书进行操作。

取对照组与0.1、1 μmol/L Icotinib 药物浓度处理8 h、16 h和24 h的HCC827细胞，PBS溶液洗涤2次，调整细
胞浓度为1×106/ml，吸取100 μl细胞溶液到EP管，加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI试剂相互混匀，室温避光孵育15 min，然后加入400 μl×Binding buffer，1 h内送流式细胞仪予以检测。

1.5 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达将对数生长期的HCC827细胞
接种在6孔板(2×105个/孔)，待细胞培养贴壁后分别加入药物浓度为0.1和1
μmol/L的Icotinib。

药物作用24 h后收集HCC827细胞，裂解处理后12 000
r/min离心25 min，吸取细胞上清液，采用Western blot对EGFR、AKT、ERK、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin蛋白予以定量检测。

与3×样品缓冲液混合均匀后，在94℃温度条件下加热处理10 min，将样品予以SDS-PAGE电泳，从
凝胶组织中将蛋白质物质转移至滤膜上，电泳转印处理后行Western Blot检测，一抗以1∶200予以稀释处理，二抗则以1∶750予以稀释处理，采用DAB试剂
盒显色处理，如有蛋白质条带出现立即用大量PBS溶液冲洗以终止Western Blot 反应过程，实验结果采用专用扫描仪器分析和处理，目的蛋白/GAPDH的灰度比
值表示其蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，
P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 Icotinib对HCC827细胞增殖的影响随着Icotinib药物浓度的逐渐增加，其
抑制HCC827细胞增殖的作用逐渐增强(P<0.05)；随着Icotinib作用时间的延长，其抑制HCC827细胞增殖的作用也逐渐增强(P<0.05)。

见表1，图1。

2.2 Icotinib对HCC827细胞凋亡的诱导作用随着Icotinib药物浓度的逐渐增加，其诱导HCC827细胞的凋亡率逐渐升高(P<0.05)；随着Icotinib作用时间的延长，其诱导HCC827细胞的凋亡率也逐渐升高(P<0.05)。

见表2，图2。

2.3 Icotinib对HCC827细胞EGFR下游信号通路蛋白表达的影响随着Icotinib
对HCC827细胞作用的药物浓度升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平均明显下调(P<0.05)。

见表3，图3。

人类EGFR是Erb/HER家族的一个成员，与肺癌发生密切相关，在肺癌组织中常
高表达，从而促进了肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、粘附、侵袭和转移。

EGFR可在胞外相应配体的诱导作用下形成同源/异源二聚体，进而促进酪氨酸激酶的自磷
酸化过程，明显激活活化下游的多条信号传导通路，最终对肿瘤细胞异常增殖、凋亡现象、远处转移及血管组织形成等予以有效调节和控制[6,7]。

目前已知EGFR
有RAS/MAPK/ERK和PI3K/AKT两条主要的信号传导通路等，EGFR的突变可使得其生理学活性功能显著性增强，进而持续激活活化处于下游的各种信号传导通路，有效刺激肿瘤细胞的异常增殖，在肿瘤疾病的发生、发展过程中占有十分重要的作用[8-10]。

Icotinib是由我国研究人员最新研制而成的EGFR-TKI，在化学结构和
作用机制等方面与吉非替尼、厄洛替尼等药物具有较高的相似性，且治疗效果无明显差异性，具有更高的安全可靠性[4]。

Icotinib可有效抑制EGFR的自身磷酸化
作用，从而明显阻止下游信号通路的激活活化过程。

此外，Icotinib还可特异性和竞争性的结合EGFR酪氨酸激酶功能区，从而有效抑制其生理学活性功能，最终对肿瘤细胞增殖及凋亡等信号传导通路予以有效阻断[11,12]。

本研究结果显示，随
着Icotinib药物浓度的逐渐增加和作用时间的延长，其抑制HCC827细胞增殖的
作用和诱导HCC827细胞的凋亡率均明显增强和升高，提示Icotinib抑制
HCC827细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用具有浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)，此结果与国内外相关研究相符[7,13,14]。

此外，还有研究为明确Icotinib在分子
水平的激酶抑制选择性，检测其对88种激酶(包括EGFR-TK及其突变型)的抑制活性，结果显示盐酸埃克替尼仅对EGFR-TK及其突变型有显著抑制作用[15]。

本研究还发现，随着Icotinib作用浓度的升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平均明显下调。

由此可知，Icotinib
有效抑制了EGFR的自身磷酸化及EGFR下游信号通路蛋白的表达，进而有效抑制HCC827细胞的增殖和诱导HCC827细胞的凋亡。

本研究还存在某些不足，如Icotinib对其他正常细胞的毒性作用，Icotinib抑制人非小细胞肺癌HCC827细
胞增殖和诱导凋亡的最佳剂量，这些均需要进一步深入研究。

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