绿色木霉在稻壳和麸皮混合基质上固态发酵生产纤维素酶的研究

图! 稻壳 （未经处理） 含量对发酵 结果的影响
@ ! ／ ・ = > ; < ; + A B ? （干物质）
参照文献， 对稻壳进行如下’种预处理： ： 预处 理 ! ( )* + $ , 溶液( .浸泡% ( ［ ］ 0 ； 预处理 ： 溶 液 煮 沸 / %( )* + $ , ! . ! 1
［ ］ 预处理 ’ ： 液! 2 # 3& ； % ), " $ % -!! % 1 .处 % ( 理( （本实验室酸水解稻壳条件） 。以上预处 /
绿色木霉在稻壳和麸皮混合基质上固态发酵 生产纤维素酶的研究
陈书峰 赵 亮 刘德华
（清华大学化学工程系应用化学研究所，北京， ） ! " " " # $ 摘 要 以稻壳和麸皮的混合物为主要原料， 采用绿色木霉 （! ） 固态发酵生 " # $ % & ’ ( " ) *% ’( ’ ) * $ ) &
利用纤维素酶将植物纤维原料水解成单 糖， 继而发酵成酒精或单细胞蛋白， 是合理利用 可再生资源的一条有效途径， 其关键环节是纤 维素酶的生产， 目前普遍采用液体深层发酵工 艺生产， 由于设备投资大， 生产成本高， 此工艺 仍缺乏足够的竞争性。固态发酵由于其特有的 经济、 实用性， 在纤维素酶的生产方面已经引起
09c显示了稻壳含量对发酵结果的影响当稻壳含量为酶活分别为191物质比对照酶活提高了91基质含水量对产酶的影响调节基质的初始含水量是控制培养基含水量的有效措施图表明了不同的初始含水量对发酵结果的影响实验结果明当培养基初始含水量为时绿色木霉的产酶效果最好
" " #$ % #! & ’ ( & % ) $ ) * " % + % # , ) ’ * & 食 品与发酵工业 !
产纤维素酶。浅盘发酵实验表明， 稻壳经$ 以( +的 , . / 溶液 $ " 0 浸泡 ) $ 1后， " + 的质量比添 最优发酵条件为： 加到麸皮中发酵， 滤纸酶活和 2 3 2 酶活比未经处理时提高了 ) 4 ’ 5 +和) 5 ’ ! +； 培养温度( 接种量) 培养基初始含水量$ 此时滤纸酶活和 2 " 0， " +， 5 +! 6 " +， 3 2 酶活可达5 ’ ! 5 ／ （干物质） 和 ／ （干物质） 。 7 89 ( # ’ $ 6 7 89 关键词 纤维素酶， 稻壳， 预处理， 固态发酵
理后的稻壳均水洗至中性。 表!为’种 预 处 理 以 及 未 处 理 的 稻 壳 以
图% 碱预处理后的基质配比对发酵结果的影响
# $ " 基质含水量对产酶的影响 调节基质的初始含水量是控制培养基含水 量的有效措施， 图 ’ 表明了不同的初始含水量
万方数据 （! （H ） -） % (D E F G ’ -* E G ! + I E F ! 0 ’
料代替纯纤维素生产纤维素酶是减少成本的另
［ ， ］ $ 5 。 一条有效途径
以稻壳为原料开发生产化工产品， 具有来
［ ］ 6 ! # 。笔者进行了以 源广泛、 成本低廉的特点
稻壳作为基质添加到麸皮中进行固态发酵生产 纤维素酶的研究。 ! 实验材料和方法 ! " ! 实验材料 ! ’ ! ’ ! 菌 种 绿色木酶菌株 （! ） ， " # $ % & ’ ( " ) *% ’( ’ ) * $ ) & 购自中科院微生物所。 ! ’ ! ’ ) 种子培养基 （ ! " + 麸皮溶液 ! " ! " " " 9麸皮; 9水煮沸) ， 过滤后稀释到! ） 。 " "< ? < = > ! ’ ! ’ ( 发酵培养基
图’ 接种量对发酵结果的影响
! " % 产酶过程曲线研究 将! 种预处理过的稻壳以 ! % ) 的比例添 加到麸皮中进行发酵， 间隔 ( 测定体 # * 取样， 系的纤维素酶酶活 （图+ ） 。 从图 + 纤维素酶的发酵过 ,和图 + - 可见， 程曲线明显分为’个阶段。 % ! ( # *为迟滞期， ( # ! " $ *为第(个上升期， " $ ! + % 为第 ( 个下 降期， + % ! . + *为第#个上升期， . + * 以后为第
参 考 文 献
鲁新洁， 张发群 1 固态纤维素酶曲的制备 0 刘淑华， ］ 微生物学通报， ， （ ） ： ［ 2 3 0 & & / 0 & ’ 0 4 0 ! 0 4 ’ ， ， 5 # * # * 698 : ;<== 17 > ? @ A B C D ? E? F / 5 # * # * 678 B ; 6 6 A 6 * B ; D E G ? 6 D @ H G C * C ; F ; > I ; E C * C D ? EJ D C #! " # $ % & ’ ( " ) * 5 <" %? EJ # ; * CG C > * J3L 6 D ; @= D ? B # ; I " ( ( + ( #K M M ， ， ／ ： = D ? C ; B # E ? 6 0 & & $ 4 . 4 " ! ’ ’ ! ! ! / ， ， = ; D # A D: O A ? # A: 1P E # * E B ; @B ; 6 6 A 6 * G ;M > ? H ’ N * ?8 @ A B C D ? E D EF ; @ H Q * C B #G ? 6 D @G C * C ;F ; > I ; E C * C D ? E? F! " # , ， $ % & ’ ( " ) *# " # ’ (8 : H 0 32 5 # ; IN ; B #= D ? C ; B # E ? 6 ， ： 0 & & . $ & ! / & ! ! ’ / ， ， ! 7 ; > G G ? E R N ; > E ; 6 @T , * # E H , * ; > @ * 6 = 1T A E * 6 B ; 6 H S U U ： LX ; Y D ; J3 7 > ? B ; G G= D ? H 6 A 6 ? 6 C D B ; E W I ;M > ? @ A B C D ? E V V ， ， ： 0 & & 0 / $ $ 4 ! . ! B # ; I D G C > V 殷松枝 1 稻壳的综合利用 ［ ］ 4 刘学彬， 2 3现代化农 业， ， （ ） ： 0 & & $/ % "0 0 ’ . ! ’ " 佟启玉1 论黑龙江垦区如何加快稻壳的综 $ 孙爱红， 合利用 ［ ］ ， （ ） ： 2 3应用能源技术， / % % % $ ! ! 0 4 ! 0 $ 崔素萍， 朱桂华， 刘颖等 绿色木霉 1 ’ . 0 0 在稻壳基 . 上产生纤维素酶条件的研究 ［ ］ 2 3黑龙江八一农垦 大学学报， ， （ ） ： / % % %0 /’ & ! ! & . " 5 # ? G ;NZ3 < # ? G ;K ; * G A > ; I ; E C ? F B ; 6 6 A 6 * G ; * B C D Y D C D ; G ［ ］ ， ， （ ） ： 2 3 7 A > ;L 6 15 # ; I 1 0 & " . 4 & / / 4 . ! / $ " M M 袁素珍， 杨军等 1 纤维素酶酶解稻壳的条 & 王淑军， ］ 微生物学通报， ， （ ） ： 件试验 ［ 23 0 & & 4 / / $ ’ 4 ! ! ’ 4 . 宋向阳， 王 捷， 徐 勇等 木质纤维原料制备纤 0 % 1 维素酶的反应历程 ［ ］ ， 2 3林产化学与工业， 0 & & " 0 " （ ） ： ! . 4 ! . " ， ， 0 0 7 * > I D E @ ; >85 9 ; Y D E @ ; >85 < ; > * > @L 15 ; 6 6 A 6 * G ; " ( ( + ( #? E9 D F F ; > ; E C5 ; 6 3 6 A 6 ? G D B 7 > ? @ A B C D ? E7 > ? F D 6 ; ? F!. 8 A Q G C > * C ; G * C[ * > D ? A G ,6 ; Y ; 6 G 3 2 ? A > E * 6 ? F T ; > I ; E C * H M ， ： C D ? E* E @= D ? ; E D E ; ; > D E 10 & & / . ! 0 / $ ! 0 / " U U
［ ］ ! 维素的水解， 便于纤维素酶的作用 。在以后
的实验中采用第!种预处理方式对稻壳进行预 处理。
表! "种预处理对发酵结果的影响
纤维素酶酶活
@ ! ／ ・ 6 7 8 = > ? （干物质）
未处理 （对照）预处理! 预处理% 预处理’ ’ 9 & % 9 & ! ( 9 : ’ % 0 9 C % ( 9 & 1 % : 9 % ( 9 % 1 % ’ 9 : !
图! 基质初始含水量对发酵结果的影响
! " # 培养温度的对产酶的影响 用烧杯静止进行发酵， 当装料量少， 料层比 较薄时， 基质内外的温差并不大， 可以将环境温 度近似地认为是发酵温度。从图 " 可以看出， 绿色木霉在# 酶产量最高， 因此， 选 $ ! ! % & 时， 取# $ ! ! % &为固态发酵培养温度。
［ ］ ! ! ( 。采 用 廉 价 的 木 质 纤 维 原 了广泛的 重 视
麸皮， 稻壳 （粉碎后过 6 ， 营养盐溶 " 目筛） 液 ［ （, ） 、 、 、 / @ . "9 A / B . 2 C ’ 5 9 2 9 $ ) $! ) $( )" 。 3 @ . " ’ 5 " " " < ?蒸馏水中］ 9 9溶于! $ ! " # 实验方法 ! ’ ) ’ ! 种子制备 将5 "< ? 种子培养基置于 5 " "< ? 三角瓶 中于! ， 冷却后接入斜面孢子， ! 5 0 灭菌 ! 5< = > ／ 。 ( " 0下! ( " D < = >的摇床中培养) $ 1 ! ’ ) ’ ) 固态发酵培养方法 称取稻壳和麸皮混合物 ( " " "< ?烧 9于 5 杯中， 加入适量营养盐溶液， 混匀后于 ! ) ! 0灭 菌( ， 冷却后接入6< "< = > ? 种子液在一定温度 下培养$ 。 E ! ’ ) ’ ( 酶活测定方法 称取! 加入! ／ " < ?" ’ 5 < F C ?醋酸 9固体曲， 缓冲液( ， 过滤， 滤液经$ ／ " 0浸提( 1 " " " D < = >离 心! 上清液即为粗酶液。另取一 5 < = >去除孢子， 定量固体曲# 烘干至恒重， 测定含水量。 " 0 滤纸酶活力 （G 和" ， B H） I ! $ 葡聚糖内切酶 活力 （2 ） 按照国际理论和应用化学协会 3 2 % J ［ ］ 4 推荐的标准方法测定 ， 换算成每克干物料含 ／ （干物质） 表示。 有的酶活， 以7 8 9 ) 实验结果与讨论 # " ! 稻壳预处理对发酵结果的影响
# $ # 预处理后基质比例对产酶的影响 图%显示了稻壳含量对发酵结果的影响， 当稻壳含量为 ’ 滤纸酶活和 ) 的质量 比 时， ／ ／ （干 ; < ; 酶活分别为 1 9 ’ 1 = > 1 9 ! ( = > ?和 ’ ? 物质） ， 比对照酶活提高 了 % & 9 1 )和% 1 9 ! )。 因此， 以后的实验以’ ) 的比例添加第 ! 种预 处理的稻壳到麸皮中发酵。
万方数据
在发酵过程前期， 微生物利用麸皮中的无 定型纤 维 素 生 产 纤 维 素 酶， 这段时间大致在 ， 从图+也可以看出几条曲线在 " % ! " $ * $ *前
（总第( # % % "年第! %卷第(期 . !期）
（( (）
生产与科研经验
几乎没有差别， 进一步说明了微生物在这一阶 段消耗麸皮合成纤维素酶。! 麸皮能够 " # 后， 被微生物利用的部分基本被利用完， 微生物转 而利用稻壳， 即从利用淀粉和无定型纤维素转 向利用结晶纤维素。在微生物利用麸皮到利用 稻壳之间需要有一段时间来适应在结晶纤维素 上的生长， 导致在这一段时间不能合成纤维素 酶， 从曲线上可以看出这一段时间为! 。 " ! $ % # 一旦微生物适应了在稻壳上的生长， 产酶行为 又重新开始。在 $ ， 微生物适应了在结 %!& $ # 晶纤维素上的生长， 体系酶活重新升高， 从图 $ 可以看出， 这种差 !条曲线出现了较大的差别， 别来自于!种稻壳之间的差别。 ’ 种预处理过 程不同程度地使稻壳的结构和性质发生了变 化， 使得微生物利用的难易程度也不相同， 这就 导致了其产酶行为有了显著的区别。 ’ 结 论
第一作者： 硕士研究生。 收稿时间： ) " " ( : " ( : ) 6
万方数据
（总第! ) " " $年第( "卷第!期 * (期）
（* ）
生产与科研经验
图!所示为未经预处理的稻壳以不同比例 添加到麸皮中的最终发酵结果。可以看到， 添 加稻壳未能明显提高发酵效果， 这是因为稻壳 质地坚硬， 表面角质化严重， 而且含有一定量的 ， 以致微生物很难直接利用 & 。但是， 实验 " # $ % 中若采用纯麸皮进行发酵， 灭菌后固态培养基 容易结团， 使基质利用不充分， 而且增加染菌机 率， 所以有必要对稻壳进行适当的预处理后添 加到麸皮中发酵。
［ ］
! 4 ! 的质量比添加到麸皮中发酵 ( 5 的结果比 较， 稻壳经过预处理之后， 最终酶活得到了明显 地 提 高。% 种 碱 预 处 理 使 6 7 8’ 9 & )和 酸 % : 9 ’ )， ; < ; 酶活提高了 ( ’ 9 )和’ 1 9 ’ )； 预处 理 使 6 7 8和; < ; 酶活分别提高了 ! ( 9 0 )和 ! 1 9 )。这是由于碱预处理能打破 半纤维素和木质素之间的酯键， 破坏两者之间 的复合结构， 溶解大部分木质素， 除去半纤维的 乙酰基， 使细胞壁膨胀疏松， 而且碱还可以除去 稻壳表面的大部分 " ， 降低稻壳的结晶度， # $ % 从而使菌体易于利用； 酸预处理可以导致半纤
对发酵结果的影响， 实验结果明， 当培养基初始 含水量为( 绿色木霉的产酶效果 1 )! C )时， 最好。
生产与科研经验
! " $ 接种量对产酶的影响 从图 ’ 可以看出， 在( % ) !# % ) 范围内， 纤维素酶产量较高； 而且实验中观察到菌丝体 生长良好。接种量 !( 发酵效 % ) 或 "# % ) 时， 果有所下降。固态发酵中常采用大接种量以防 止染菌， 因此， # % )为合适的接种量。
图" 培养温度对发酵结果的影响