雷帕霉素抑制人神经母细胞瘤细胞株生长及诱导凋亡的机制研究

雷帕霉素抑制人神经母细胞瘤细胞株生长及诱导凋亡的机制研
究
陈盛;顾硕;徐敏;顾松
【摘要】目的研究雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的生长抑制和诱导凋亡作用,以及对靶向信号通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3 K/Akt/mTOR)的影响.方法用不同浓度的雷帕霉素(10、15、20
μmol/L)处理SH-SY5Y细胞(雷帕霉素干预组),以加入相同体积二甲基亚砜(DMSO)的SH-SY5Y细胞作为阴性对照组,设立空白对照组.CCK-8法测定细胞生长率;采用流式细胞仪检测细胞周期,通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡
率;Western blotting检测caspase-3剪切体及PI3 K/Akt/mTOR信号通路上下游分子PI3 Kp85、Akt、mTOR、4E-BP1表达及其磷酸化水平的变化.结果与阴性对照组和空白对照组比较,雷帕霉素干预组细胞生长率显著降低(P ＜0.05或P＜0.01);G0/G1期细胞百分比显著增高(P＜0.05);细胞凋亡率显著升高(P＜
0.01).Western blotting检测结果显示:与阴性对照组和空白对照组比较,雷帕霉素干预组caspase-3剪切体表达水平较高;PI3 K/Akt/mTOR信号通路上下游分子的活性均被抑制,PI3 Kp85、Akt、mTOR、4E-BP1的磷酸化水平均明显降低.结论雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y具有抑制生长和诱导凋亡的作用,其机制可能与抑制PI3 K/Akt/mTOR信号通路有关.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2014(034)004
【总页数】6页(P481-486)
【关键词】神经母细胞瘤;雷帕霉素;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕
霉素靶蛋白;细胞生长;细胞凋亡
【作者】陈盛;顾硕;徐敏;顾松
【作者单位】上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心外科,上海200127;上海
交通大学医学院附属上海儿童医学中心外科,上海200127;上海交通大学医学院附
属上海儿童医学中心外科,上海200127;上海交通大学医学院附属上海儿童医学中
心外科,上海200127
【正文语种】中文
【中图分类】Q25;R73
神经母细胞瘤是起源于神经嵴的交感神经系统肿瘤，是最常见的儿童恶性实体肿瘤，占所有儿童肿瘤病死率的15%。

目前虽然有手术、放射和化学治疗(放化疗)、自体干细胞移植等多种治疗方法，但进展期神经母细胞瘤的预后仍然很差，亟需探索新的、更有效的疗法。

寻找并抑制神经母细胞瘤生长、转移过程中起重要作用的靶蛋白，可能是该病治疗中一种较好的分子靶向疗法。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-
3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，
PI3K/Akt/mTOR)信号通路是调节生长因子、细胞外基质、细胞接触等传递的细胞存活信号的重要通路，同时参与调节与肿瘤形成相关的细胞功能［1］。

许多恶性肿瘤中编码PI3K催化亚基p110α的PIK3CA基因扩增、Akt突变、磷酸酶和张
力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue，PTEN)缺失等都会异常
激活PI3K/ Akt/mTOR通路［2］。

mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是
PI3K/Akt/mTOR通路的关键节点，与肿瘤发生有密切关系。

mTOR控制肿瘤细胞生长、转移、代谢等，常在肿瘤组织中过度激活［3，4］。

雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，最初用作抗真菌药物。

有研究表明:雷帕霉素具有免疫抑制和抗肿瘤作用［5-7］;能够特异性抑制mTOR，将细胞周期阻滞于G1期［1］。

本研究探讨雷帕霉素对神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的生长抑制和诱导凋亡作用，观察该药物的靶点——PI3K/Akt/mTOR通路中信号分子的表达变化。

1 材料与方法
1.1 细胞株和主要试剂
人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购自中科院上海细胞库。

雷帕霉素(Bioaustralis);二甲基亚砜(DMSO)和荧光染料PI(Sigma-Aldrich);胎牛血清和DMEM高糖培养基(Gibco);AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Invitrogen);CCK-8试剂盒(Dojindo); RIPA裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒和Super Signal West Pico化学发光显色液(Thermo);PVDF膜(Roche);胱天蛋白酶-
3(caspase-3)剪切体、磷酸化PI3K p85(Tyr 458)、PI3K p85、磷酸化
Akt(Ser473)、Akt、磷酸化mTOR(Ser2448)、mTOR、真核起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein-1，4E-BP1)、磷酸化4E-BP1 (Ser65)一抗(Cell Signaling Technology);β-actin一抗(Abcam);二抗(Santa Cruz)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中(37℃、5%CO2)。

1.2.2 CCK-8法测定细胞生长率在96孔板内以1×103/孔的密度接种细胞，培养12 h细胞贴壁后，用10、15、20 μmol/L的雷帕霉素(溶于DMSO)处理细胞，
阴性对照组加入相同体积的DMSO，设立空白对照，每组设5个复孔。

分别于加
药后12、24、36 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，计算细胞生长率。

细胞生长率=干预组或阴性对照组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。

实验操作重复3次。

1.2.3 细胞周期分析SH-SY5Y细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板，用10、15、20 μmol/L的雷帕霉素(溶于DMSO)处理细胞，设立阴性对照组和空白对照组;处
理12 h后，胰酶消化细胞，PBS洗涤2遍; 70%冷乙醇固定细胞2 h，用含RNA
酶的PI溶液染色，流式细胞仪分析细胞DNA含量。

实验操作重复3次。

1.2.4 细胞凋亡测定以1×105/孔的密度将SHSY5Y细胞接种于6孔板，用10、15、20 μmol/L的雷帕霉素(溶于DMSO)处理细胞，设立阴性对照组和空白对照组;处理12 h后，采用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡，按照试剂盒说明书进行操作:胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，用1×结合缓冲液重悬细胞。

加入AnnexinⅤ-FITC，室温下在暗室孵育10 min;PI溶液共染色细胞，流式细胞仪分析。

实验操作重复3次。

1.2.5 Western blotting分析以1×105/孔的密度将SH-SY5Y细胞接种于6孔板，用10、15、20 μmol/L的雷帕霉素(溶于DMSO)处理细胞，设立阴性对照组和空白对照组。

处理12 h后，用混有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

SDS聚丙烯酰胺凝胶每孔上样30 μg蛋白标本，电
泳后转膜至PVDF膜，并用含5%牛血清白蛋白的 PBST溶液封闭 1 h。

磷酸化
PI3Kp85 (Tyr458)、PI3Kp85、磷酸化Akt(Ser473)、Akt、磷酸化
mTOR(Ser2448)、mTOR、磷酸化4E-BP1(Ser65)、4EBP1、β-actin一抗孵育
过夜。

PBST洗去一抗后用二抗孵育1 h，Super Signal West Pico化学发光显色液显影。

实验操作重复3次。

1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 16.0进行统计学分析。

计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 雷帕霉素抑制SH-SY5Y细胞生长
CCK-8测定结果显示:雷帕霉素干预组SH-SY5Y细胞生长率呈浓度和时间依赖性降低(图1)。

统计学分析结果显示:与空白对照组和阴性对照组比较，雷帕霉素干预组每个时间点的细胞生长率随药物浓度的提高和时间的延长而显著降低(P＜0.01);与空白对照组相比，阴性对照组的细胞生长率略有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 雷帕霉素阻滞SH-SY5Y细胞周期
细胞周期流式细胞仪分析结果显示:雷帕霉素干预组SH-SY5Y细胞G0/G1期比例升高(图2)。

空白对照组和阴性对照组G0/G1期细胞比例分别为(54.66±0.89)%和(56.41±1.06)%，10、15、20 μmol/L雷帕霉素干预组G0/G1期细胞比例分别为(59.46±2.11)%、(70.70±1.05)%和(71.33± 1.22)%，雷帕霉素干预组G0/G1期细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05或P＜0.01)，且呈药物浓度依赖性。

图1 CCK-8法测定细胞生长率Fig 1 Cell proliferation rates measured by the CCK-8注:①P＜0.01与空白对照组和阴性对照组比较。

图2 流式细胞仪测定细胞周期Fig 2 Cell cycles detected by the flow cytometry注:①P＜0.05，②P＜0.01与空白对照组和阴性对照组比较。

2.3 雷帕霉素诱导SH-SY5Y细胞凋亡
AnnexinⅤ-FICT/PI双染流式细胞仪测定结果显示:雷帕霉素干预组细胞早期(AnnexinⅤ阳性)和晚期(AnnexinⅤ/PI双阳性)凋亡率均显著高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01)(图3)。

Caspase-3剪切体表达提示内源性凋亡通路被激活。

Western blotting分析结果显示:雷帕霉素干预组细胞caspase-3剪切体表达水平升高，且随药物浓度的升高而递增(图4)。

2.4 雷帕霉素对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响
Western blotting结果显示:雷帕霉素干预组PI3K/ Akt/mTOR通路上下游各信号分子的磷酸化均被抑制，而总蛋白表达水平均无明显变化;磷酸化PI3Kp85 (Tyr458)和磷酸化4E-BP1(Ser65)的表达水平随药物浓度的升高而递减;当雷帕霉素浓度为10 μmol/L时，Ser2448和Ser473表达被明显抑制，当雷帕霉素浓度提高至15、20 μmol/L时，磷酸化mTOR(Ser2448)和磷酸化Akt(Ser473)表达完全消失(图5)。

图3 AnnexinⅤ-FICT/PI双染流式细胞仪测定细胞凋亡Fig 3 Cell apoptosis
d etected by AnnexinⅤ-FICT/PI doubl
e staining and flow cytometry
图4 Western blotting测定caspase-3剪切体表达Fig 4 Expressions of cleaved caspase-3 detected by Western blotting
图5 W estern blotting测定PI3K/Akt/m TOR信号通路关键蛋白的表达Fig 5 Expressions of key proteins of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway detected by Western blotting注:A.磷酸化PI3Kp85(Tyr458);B.磷酸化Akt(Ser473);C.磷酸化mTOR(Ser2448);D.磷酸化4E-BP1(Ser65)。

3 讨论
雷帕霉素是一种从吸水链霉菌中分离出来的大环内酯类抗生素，起初作为抗真菌药物，接着发现其免疫抑制功能，可用于器官移植后的抗排异［5］。

随后雷帕霉素被证实具有抗肿瘤作用，可在体内、体外抑制恶性肿瘤生长［6，7］;其作用机制为在细胞内结合mTOR，抑制mTOR下游的2个重要信号分子S6激酶1(S6 kinase 1，S6K1)和真核起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein-1，4E-BP1)，从而抑制mRNA翻译，阻止细胞从G1期进入S
期［3］。

此外，雷帕霉素还有促进淋巴瘤、白血病、肺癌和肝癌等肿瘤细胞凋亡的效应［8-11］。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在很多细胞功能中起到重要作用，如调控细胞生长、凋亡、代谢和运动等，并且与肿瘤的发生密切相关［12］。

许多人类癌症中
PI3K/Akt/mTOR信号通路异常激活，能够促进肿瘤细胞增殖、存活以及耐药［13］，并且与肿瘤进展、病理分级、预后不良相关［14］。

PI3K是一种脂质激酶，由催化亚基p110和调节亚基p85构成，可磷酸化磷酸肌醇的D3位点，产
生生物活性分子3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇和3，4-二磷酸磷脂酰肌醇，这2种
分子使3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(3-phosphoinositidedependent kinase 1，PDK1)和Akt移位至细胞膜，从而激活整条信号通路［15］。

编码 PI3K通路关键蛋白的基因变异可导致致癌性的PI3K信号，包括PIK3CA基因扩增、PTEN缺失、Akt突变、RTK扩增等［2］。

一些致癌性的生长因子受体(如表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、上皮间充质转化因子等)也可激活PI3K［16］。

神经母细胞瘤中PI3K信号可通过mTOR和低氧诱导因子1α调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达。

如PI3K被抑制，小鼠神经
母细胞瘤的VEGF表达下降，肿瘤内微血管密度降低，肿瘤体积缩小［17］。

Opel等［18］报道Akt激活是神经母细胞瘤预后不良的指标，预示着无病生存率或总体生存率降低，在他们的研究中，Akt激活和神经母细胞瘤的侵袭特征相关，如MYCN基因扩增、染色体1p36异常、肿瘤进展、组织类型不良等。

mTOR是PI3K/ Akt/mTOR通路的关键节点，控制肿瘤细胞增殖、血管生成、代谢等功能［3］。

最近的一项研究分析了原发性神经母细胞瘤MYCN驱动的转录组，发现mTOR相关基因的转录组上调，说明mTOR异常激活是MYCN驱动的神经母细
胞瘤存活的关键信号［19］。

4E-BP1和S6K1是mTOR下游的2个重要信号分子，可被磷酸化的mTOR激活。

4E-BP1磷酸化后与真核起始因子 4E(eukaryotic
initiation factor 4E，eIF4E)分离，eIF4E释放后进行帽依赖的翻译［3］。

目前癌症治疗中以PI3K/Akt/mTOR通路为靶点是一个新颖的、有潜力的方向，但最佳
治疗策略仍有待开发。

本文研究了雷帕霉素对神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的生长抑制和诱导凋亡作用及其对PI3K/ Akt/mTOR信号通路的影响。

CCK-8法检测结果显示:雷帕霉素可显著抑制神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y生长，抑制效应与药物浓度和处理时间有关。

流式细胞仪分析结果显示:与空白对照组和
阴性对照组相比，雷帕霉素干预12 h后，G0/G1期细胞比例明显增加，说明该药物可将SH-SY5Y细胞阻滞于G0/G1期。

AnnexinⅤ-FICT/ PI双染流式细胞术检
测发现，雷帕霉素干预组细胞的早、晚期凋亡率随药物浓度的升高而显著上升。

Caspase-3剪切体是另一重要的凋亡指标，Western blotting分析结果显示，在
空白对照和阴性对照组中caspase-3剪切体的表达很弱，雷帕霉素干预后caspase-3表达水平明显增高，且随药物浓度的升高而上升。

以上研究结果均说
明雷帕霉素可诱导神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y凋亡，凋亡效应具有药物浓度依赖性。

为了确定雷帕霉素对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制作用，本研究采用Western blotting测定该信号通路上下游分子表达的变化情况。

分析结果显示:雷帕霉素作为mTOR抑制剂，当干预浓度为10 μmol/L时，磷酸化mTOR的表达
显著降低;当干预浓度为15 μmol/L时，磷酸化mTOR的表达被完全抑制。

此外，信号通路中PI3K p85、Akt、4E-BP1的磷酸化也受到明显抑制;当雷帕霉素干预浓度为10 μmol/L时，磷酸化PI3K p85开始被抑制，干预浓度提高到15、20
μmol/L时，抑制作用逐渐增强。

雷帕霉素对磷酸化Akt、4E-BP1的抑制作用同
样随着干预浓度升高而增强。

因此，雷帕霉素可抑制PI3K/ Akt/mTOR信号通路
上下游信号分子的活性。

总之，本研究证实雷帕霉素通过抑制PI3K/Akt/ mTOR信号通路，抑制神经母细
胞瘤细胞株SH-SY5Y的生长，并诱导凋亡。

［参考文献］
［1］Shaw RJ，Cantley LC.Ras，PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth［J］.Nature，2006，441(7092):424-430.
［2］Yuan TL，Cantley LC.PI3K pathway alterations in cancer:variations on a theme［J］.Oncogene，2008，27(41):5497-5510.
［3］Meric-Bernstam F，Gonzalez-Angulo AM.Targeting the mTOR signaling network for cancer therapy［J］.J Clin Oncol，2009，27 (13):2278-2287.
［4］Gomez-Pinillos A，Ferrari AC.mTOR signaling pathway and mTOR inhibitors in cancer therapy［J］.Hematol Oncol Clin North AM，2012，26(3):483-505.
［5］Heidt S，Roelen DL，Eijsink C，et al.Effects of immunosuppressive drugs on purified human B cells:evidence supporting the use of MMF and rapamycin［J］.Transplantation，2008，86(9):1292-1300.
［6］Zeng Q，Yang Z，Gao YJ，et al.Treating triple-negative breast cancer by a combination of rapamycin and cyclophosphamide:an in vivo bioluminescence imaging study［J］.Eur J Cancer，2010，46 (6):1132-1143.
［7］Kaylani SZ，Xu J，Srivastava RK，et al.Rapamycin targeting mTOR and hedgehog signaling pathways blocks human rhabdomyosarcoma growth in xenograft murine model［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，435(4):557-561.
［8］Cen O，Longnecker R.Rapamycin reverses splenomegaly and inhibits
tumor development in a transgenic model of Epstein-Barr virus-related Burkitt's lymphoma［J］.Mol Cancer Ther，2011，10(4):679-686.
［9］Sillaber C，Mayerhofer M，Böhm A，et al.Evaluation of antileukaemic effects of rapamycin in patients with imatinib-resistant chronic myeloid leukaemia［J］.Eur J Clin Invest，2008，38(1):43-52. ［10］Miyake N，Chikumi H，Takata M，et al.Rapamycin induces p53-independent apoptosis through the mitochondrialpathway in non-small cell lung cancer cells［J］.Oncol Rep，2012，28(3):848-854.
［11］Zhang Y，Zhang JW，Lv GY，et al.Effects of STAT3 gene silencing and rapamycin on apoptosis in hepatocarcinoma cells［J］.Int J Med Sci，2012，9(3):216-224.
［12］Marone R，Cmiljanovic V，Giese B，et al.Targeting phosphoinositide 3-kinase:Moving towards therapy［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1784(1):159-185.
［13］Yu LL，Dai N，Yu HG，et al.Akt associates with nuclear factor kappaB and plays an important role in chemoresistance of gastric cancer cells［J］.Oncol Rep，2010，24(1):113-119.
［14］Tian WY，Chen WC，Li R，et al.Markers CD40，VEGF，AKT，PI3K，and S100 correlate with tumor stage in gastriccancer［J］.Onkologie，2013，36(1-2):26-31.
［15］Mahalingam D，Sankhala K，Mita A，et al.Targeting the mTOR pathway using deforolimus in cancer therapy［J］.Future Oncol，2009，5(3):291-303.
［16］Chen Y，Wang BC，Xiao Y.PI3K:a potential therapeutic target for
cancer［J］.J Cell Physiol，2012，227(7):2818-2821.
［17］Kang J，Rychahou PG，Ishola TA，et al.N-myc is a novel regulator of PI3K-mediated VEGF expression in neuroblastoma［J］.Oncogene，2008，27(28):3999-4007.
［18］Opel D，Poremba C，Simon T，et al.Activation of Akt predicts poor outcome in neuroblastoma［J］.Caner Res，2007，67(2):735-745. ［19］Schramm A，Köster J，Marschall T，et al.Next-generation RNA sequencing reveals differential expression of MYCN target genes and suggests the mTOR pathway as a promising therapy target in MYCN-amplified neuroblastoma［J］.Int J Cancer，2013，132(3):E106-E115.。