一种用于组织损伤修复的生物补片[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510273678.1
(22)申请日 2015.05.26
A61F 2/02(2006.01)
A61L 27/20(2006.01)
A61L 27/56(2006.01)
A61L 27/54(2006.01)
A61L 27/18(2006.01)
A61L 27/38(2006.01)
A61L 27/50(2006.01)
(71)申请人南通大学
地址226019 江苏省南通市啬园路9号
(72)发明人杨宇民 顾晓松 李贵才 丁斐
(74)专利代理机构南京知识律师事务所 32207
代理人
张铂
(54)发明名称
一种用于组织损伤修复的生物补片
(57)摘要
本发明公开了一种用于组织损伤修复的生物
补片，包括生物材料基底层和细胞基质层，基质层
附着在基底层上，基底层与细胞基质层的接触面
上设有若干个平行的沟槽。

本发明生物补片基底
层同时具有多孔和沟槽纹路结构，不但可以调控
细胞的取向性生长和分布，沟槽纹路结构所具有
的力学性能可以使细胞基质层能够更好的粘附在
基底层上，避免脱落。

本发明所述产品具有稳定的
结构，合适的孔径、孔隙率及通透性，能够模拟正
常组织结构，能够提供组织生长的管道及细胞基
质，并且可以承载利于组织修复和再生的细胞。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 105769381 A 2016.07.20
C N 105769381
A
1.一种用于组织损伤修复的生物补片，其特征在于包括生物材料基底层和细胞基质层，基质层附着在基底层上，基底层与细胞基质层的接触面上设有若干个平行的沟槽。

2.如权利要求1所述的生物补片，其特征在于所述沟槽为横向或纵向分布。

3.如权利要求1所述的生物补片，其特征在于所述沟槽的尺寸为：宽10-50μm，深10-30μm。

4.如权利要求1所述的生物补片，其特征在于所述生物材料基底层与细胞基质层的接触面上表面以及内部分布有丰富的孔隙。

5.如权利要求4所述的生物补片，其特征在于所述生物材料基底层上的孔隙率为50％-90％，且孔径为10μm-100μm。

6.如权利要求1所述的生物补片，其特征在于所述生物材料基底层厚度为0.1-3mm。

7.如权利要求1所述的生物补片，其特征在于所述生物材料基底层由丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种制成。

8.如权利要求1-7之一项所述的生物补片，其特征在于所述细胞基质层是自体的或同种异体来源细胞分泌形成后脱细胞而获得。

9.如权利要求8所述的生物补片，其特征在于所述细胞是施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种。

10.如权利要求1-9之一项所述的生物补片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：，
(1)设计PDMS弹性印章纹路，将生物材料溶液加到印章上，成型脱模后采用冻干的方法制备获得表面具有沟槽纹路的生物材料基底层；
(2)将生物材料基底层与细胞进行培养，得到贴附生长有细胞的生物材料基底层；
(3)将生长有细胞的生物材料基底层进行脱细胞处理，将其进一步进行冻干，得到生物补片。

一种用于组织损伤修复的生物补片
技术领域
[0001] 本发明涉及医疗器械领域，特别涉及一种用于组织损伤修复的生物补片。

背景技术
[0002] 现实社会中交通事故、工伤事故、运动意外及临床手术等事件均会造成组织损伤，临床上多使用作为生物补片进行替代和修复人体组织的材料。

生物补片是指取自同种一种对组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质的三维框架结构并能用于修复人体软组织的材料。

根据组织来源可分为同种异体材料如真皮脱细胞基质、羊膜、硬脑膜等，异种异体材料如猪小肠黏膜下层、牛、马的心包、牛腹膜等。

虽然这种天然生物补片已经商品化，但是制备繁琐，价格高昂。

寻找价格低廉、简便易得、生物相容性好的人工合成生物补片来替代天然生物补片仍然是研究的热点。

发明内容：
本发明的目的在于提供一种生物相容性好、价格低廉、简便易得的用于组织损伤修复的生物补片。

[0004] 本发明的技术解决方案是：
一种用于组织损伤修复的生物补片，包括生物材料基底层和细胞基质层，基质层附着在基底层上，基底层与细胞基质层的接触面上设有若干个平行的沟槽。

沟槽可以为突出于基底层表面的凸形沟槽，也可以为自基底层表面向内凹陷的沟槽形状。

沟槽为横向或纵向排布。

[0005] 优选沟槽的尺寸为：宽为10-50μm，深为10-30μm。

[0006] 上述的生物补片，所述生物材料基底层上的孔隙率为50％-90％，且孔径为10μm-100μm。

[0007] 上述的人工合成生物补片，所述生物材料基底层厚度为0.1-3mm。

[0008] 上述的人工合成生物补片，所述生物材料基底层由丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种制成。

[0009] 上述的生物补片，所述细胞基质层是自体的或同种异体来源细胞分泌形成后脱细胞而获得，所述细胞是施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种。

[0010] 上述生物补片不含有发泡剂和/或交联剂。

[0011] 本发明还公开了上述生物补片的制备方法，
(1)设计PDMS弹性印章纹路，将生物材料溶液加到印章上，成型脱模后采用冻干的方法制备获得表面具有沟槽纹路的生物材料基底层；
(2)将生物材料基底层与细胞进行培养，得到贴附生长有细胞的生物材料基底层；
(3)将生长有细胞的生物材料基底层进行脱细胞处理，将其进一步进行冻干，得到生物补片。

[0012] 本发明的一个优选方案如下：
根据微沟槽的尺寸大小对细胞的形状和铺展行为影响的原则，设计可以引导神经细胞的取向分布的具有沟槽状的微图形结构。

[0013] 本发明所使用的弹性印章为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)，其制备方法为将室温下配制好的PDMS液体和交联剂按10:1的比例混合均匀后，浇铸到事先采用掩膜曝光获得的具有横向或纵向的沟槽状微图形化分布的硅片基母模板上，然后将其放入真空干燥箱中抽真空排除气泡，并进行干燥固化，最后进行固化后剥离即得到平面PDMS弹性印章。

[0014] 用乙酸溶解壳聚糖配制一定浓度(1％、2％和5％)的溶液，然后将该溶液滴加在PDMS上，置于-60℃--90℃，冷冻2-4小时，将冷冻后壳聚糖冰体置于碱性溶液中和固定，用水清洗；对定型的壳聚糖基底层进行冷冻干燥，得到具有多孔结构、表面具有沟槽状分布的多孔壳聚糖基底层。

[0015] 将多孔壳聚糖基底层进行三维细胞培养得到表面贴附生长有细胞的壳聚糖基底层取出。

将生长有细胞的壳聚糖基底层进行脱细胞处理，将其进一步进行冻干，得到本发明所述生物补片。

[0016] 使用扫描电镜检测本发明所述生物补片孔隙的孔径为10μm-100μm。

本发明生物补片基底层同时具有多孔和沟槽纹路结构，不但可以调控细胞的取向性生长和分布，沟槽纹路结构所具有的力学性能可以使细胞基质层能够更好的粘附在基底层上，避免脱落。

本发明所述产品具有稳定的结构，合适的孔径、孔隙率及通透性，能够模拟正常组织结构，能够提供组织生长的管道及细胞基质，并且可以承载利于组织修复和再生的细胞，本发明的产品所用材料为天然可降解性材料，与人体有着良好的生物相容性，制得的产品不含有由制备工艺带入的外源性毒、副作用的发泡剂和交联剂。

本发明具有很好的抗拉强度且具有细胞基质层，更有利于输送细胞生长过程所需的营养物质，给细胞提供良好的生长环境。

使用效果好。

本发明方法简便易行。

附图说明
[0017] 图1为本发明所述生物补片基底层表面沟槽纹路示意图。

[0018] 图2为细胞在本发明所述生物补片表面图形化的基底层上取向性生长示意图。

[0019] 图3为本发明所述生物补片结构示意图(A为凸形沟槽的生物补片示意图，B为凹形沟槽的生物补片示意图，1为基底层，2为沟槽，3为细胞基质层)。

具体实施方式
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。

[0021] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

[0022] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。

应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0023] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

[0024] 实施例1
(1)施万细胞的培养及纯化
取新生一天SD大鼠，处死后酒精消毒，取双侧坐骨神经，置于冰浴操作台去除神经外膜及黏连组织，胶原酶/胰酶混合消化完全后离心弃上清液，完全培养基重悬细胞，接种到PDL事先包被好的培养皿中培养。

24小时更换成含有阿糖胞苷(10μM)的完全培养基培养48小时，更换为含有HRG(50ng/ml)和Forsklin(2μM)的完全培养基继续培养，每3天换液，直到细胞融合。

待细胞融合后，胰酶消化后离心得到细胞沉淀，用1ml含Thy1.1的完全培养基(1:1000)重悬细胞，冰上孵育2小时；离心弃上清，用DMEM和补体的混合物(3:1)重悬细胞，37℃孵育1小时，离心后完全培养基清洗2次，重新接种于培养皿中，隔天换液，细胞长满后即可以使用。

[0025] (2)皮肤来源的成纤维细胞的培养
取新生1天的SD大鼠，处死后酒精消毒，取出背部皮肤置于预冷的解剖液中小心地剔除皮下组织(脂肪和皮下筋膜层、血管等)；PBS清洗3次后，用手术刀片切成小块(<1mm×1mm)，以I型胶原酶(1mg/ml)完全消化后离心弃上清液，完全培养基重悬细胞，接种到培养皿培养，细胞融合90％后传代培养。

成纤维细胞在原代培养过程中会有上皮细胞污染，大多数杂细胞(上皮和内皮细胞)会在几次传代后逐渐死亡。

因此，本发明所用细胞为传3代以上细胞。

[0026] (3)皮肤干细胞的培养及定向沿施万细胞分化
皮肤干细胞的培养及分化参照文献《Isolation of skin-derived precursors(SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny》(Jeffrey A Biernaskie,Ian A McKenzie,Jean G Toma&Freda D Miller，NATURE PROTOCOLS,2006(1):2803-2812)，简单描述如下：取新生1天的SD大鼠，处死后酒精消毒，取出背部皮肤置于预冷的解剖液中小心地剔除皮下组织(脂肪和皮下筋膜层、血管等)；PBS清洗3次后，用手术刀片切成小块(<1mm×1mm)，以0.1％的胰酶或XI型胶原酶(1mg/ ml)37℃消化45–60min,完培终止消化离心弃上清液，以增殖培养基(DMEM/F12(3:1)包含0.1％双抗,40μg/ml fungizone,40ng/ml FGF2,20ng/ml EGF,2％B27supplement)进行悬浮培养。

悬浮培养的细胞球可以进行传代培养已获得足够数量的皮肤干细胞。

[0027] 将获得的皮肤干细胞进行分化培养以获得施万细胞，具体步骤如下：将皮肤干细胞以分化培养基I(DMEM/F12(3:1)包含0.1％双抗,40μg/ml fungizone,40ng/ml FGF2,20ng/ml EGF,2％B27supplement,10％FBS)培养3天后再于分化培养基II(DMEM/ F12(3:1)包含0.1％双抗,5μm forskolin,50ng/ml heregulin-1β,50μg/ml,2％N2supplement,1％FBS)中培养2-3周后即可获得施万细胞集落。

挑取集落后扩增的可得大量皮肤干细胞分化的施万细胞(SKP-SC)，免疫组化结果显示呈S100阳性。

[0028] (4)骨髓间充质干细胞的培养
脱臼处死成年SD大鼠，75％酒精浸泡5min，无菌条件下取股骨、胫骨，暴露骨髓腔，IMDM基础培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓。

注射器反复抽吸收获的骨髓，制成单细胞悬液。

200目筛网过滤，置水平离心机中离心，1000rpm×5min，弃上清。

以4×105/cm2的密度接种于IMDM完全培养液(含有胎牛血清10％)，置于37℃培养。

24h后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每3d半量换液。

倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。

当细胞铺满皿底达90％融合，传代培养。

[0029] 实施例2生物补片的制备
(1)弹性印章的制备
本发明所使用的弹性印章为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)，其制备方法为将室温下配制好的PDMS液体和交联剂按10:1的比例混合均匀后，浇铸到事先采用掩膜曝光获得的具有横向或纵向的沟槽状微图形化分布的硅片基母模板上，如图1所示。

然后将其放入真空干燥箱中抽真空排除气泡，并进行干燥固化，最后进行固化后剥离即得到平面PDMS弹性印章。

[0030] (2)微图形化壳聚糖基底层的制备
首先用乙酸溶解壳聚糖配制一定浓度(1％、2％和5％)的溶液，然后将该溶液滴加在 PDMS上，置于-60℃--90℃，冷冻2-4小时，将冷冻后壳聚糖冰体置于碱性溶液中和固定，用水清洗；对定型的壳聚糖基底层进行冷冻干燥，得到具有多孔结构、表面具有沟槽状分布的多孔壳聚糖基底层；
(3)细胞基质层的构建
将完全培养基缓慢注入培养容器，再加入2.5×107个细胞及无菌处理过的将壳聚糖基底层，再将完全培养基注满整个容器，控制细胞最终密度为1×105/ml，排尽系统内空气后，
培养箱中，前24小时转速开始旋转微重力循环灌注培养；旋转式生物反应器放入37℃CO
2
为10转/分钟，使细胞与壳聚糖基底层充分接触，贴附；24小时后调整旋转式生物反应器旋转速度，使壳聚糖基底层能悬浮到培养液中；继续培养2天后更换为分化培养基培养，以促进细胞外基质分泌；培养2周后终止培养将表面贴附生长有细胞的壳聚糖基底层取出。

显微镜显示细胞在表面图形化的壳聚糖基底层上取向性生长，如图2所示。

将生长有细胞的壳聚糖基底层进行脱细胞处理，PBS清洗后去离子无菌水37℃低渗10min；加入细胞抽提液于37℃裂解细胞10-15min；PBS清洗3次后加入Dnase I(4mg/ml)37℃消化30min去除DNA，将其进一步进行冻干，得到本发明所述生物补片，如图3所示，A为凸形沟槽的生物补片示意图，B为凹形沟槽的生物补片示意图，1为基底层，2为沟槽，3为细胞基质层。

[0031] 扫描电镜结果显示壳聚糖基底层表面上均匀分布了支持细胞分泌的细胞外基质成分，已制成含有天然细胞基质层的壳聚糖基底层可在-80℃保存备用，也可进一步冷冻干燥保存。

然后经冷冻干燥得到含细胞基质的壳聚糖生物补片，壳聚糖基底层表面以及内部分布有丰富的孔隙，细胞基质层附着在基底层以及孔隙表面。

经测定孔隙率89％，平均孔径为87-98μm。

图1
图2
图3。