柱型苹果（Columnarapple）是杂交育成的独干苹果系列

柱型苹果（Columnar apple）是杂交育成的独干苹果系列品种的总称[1]，又称芭蕾苹果（Ballerina apple），具有短枝率、萌芽率高，不分生长枝，节间较短的特性。

柱型苹果需要高密度栽植，而本身节间短，枝条少，繁殖苗木时传统的砧/穗嫁接苗的应用受到了很大的限制，因此利用组培方法进行大量育苗就显得十分必要[2]。

离体再生体系不仅是进行遗传转化工作的前提，还可以为快繁和体细胞诱变育种等提供技术支持。

苹果叶片细胞间隙大，易由细胞诱导分化出不定芽，所以柱型苹果的叶片再生在理论研究和生产实践中具有重要意义。

苹果离体叶片再生技术的研究一直是苹果组织培养中重点研究的内容，对苹果生产和科研均起到了积极的推动作用。

植物体的叶片再生与基因型[3-7]、外植体、培养基[8-11]、激素的种类和浓度[5-6，12-13]、暗培养的时间[10，14-15]、放置方式[16-18]以及光照和培养温度等条件有关。

1材料与方法
1.1材料青岛农业大学育成的鲁加16号和普通富士的3年生试管苗。

继代培养基为MS培养基+6-BA1.0mg/L+ NAA0.20mg/L。

1.2方法
1.2.1基本培养基的筛选。

选择鲁加16号和普通富士苹果叶片为试验材料。

切取30d左右的顶部完全展开3~4片叶的试管苗，选取大小一致、生理状态相近的叶片，沿叶片主脉横切3刀，但注意不要切透，切伤后分别接种在MS、B5、1/2MS3种基本培养基上，每种处理接种30个。

在暗处培养2周后再转入光下培养。

培养25d后，统计试验结果，从而确定最适合的基本培养基。

激素浓度为6-BA4.0mg/L+NAA
0.20mg/L。

1.2.2激素对苹果离体叶片再生的影响。

取继代培养30d 的鲁加16号和富士无菌苗上部平展的叶片，沿叶片主脉横切3刀，但注意不要切透，远轴面向上接种于叶片再生培养基（表1）上，暗培养2周，转到光照条件下培养。

培养30d后，统计外植体平均再生芽数和再生频率。

1.2.3不同接种方式对叶片再生的影响。

取大小相同和生理条件相似的鲁加16号的试管苗叶片，以正反不同的方式接种于再生培养基上，暗培养2周，转到光照条件下培养。

培养40d后统计试验结果。

1.2.4暗培养时间对苹果离体叶片再生频率的影响。

取增殖培养30d的幼嫩叶片，切伤后，远轴面接触培养基，分别经过0、5、10、15、20、25d的前期暗培养，后转入光照条件下培养。

培养45d后，统计试验结果。

1.2.5苗龄对叶片再生的影响。

设3个处理，即取20、30、40d 苗龄的试管苗顶部幼嫩叶片诱导再生。

远轴面向下置于再生培养基中，暗培养2周后，转移至光下培养30d后，观察统计试验结果。

1.3培养基与培养条件MS、1/2MS培养基的蔗糖浓度为
表1苹果叶片再生培养基配方组合
Table1Combination of regeneration medium for apple leaf NAA浓度
NAA concentration∥mg/L6-BA
浓度6-BA concentration∥mg/L
1.0
2.0 4.0 6.0 0.05C1C2C3C4 0.10C5C6C7C8 0.20C9C10C11C12 0.40C13C14C15C16
柱型苹果鲁加16号叶片再生研究
张汝刚，朱素贤，魏海霞，祝军（青岛农业大学园艺系果树育种实验室，山东青岛266109）
摘要[目的]建立柱型苹果鲁加16号的最佳叶片再生体系。

[方法]以柱型苹果鲁加16号的3年生试管苗叶片为外植体，研究基本培养基、激素种类及浓度配比、暗培养、接种方式及外植体苗龄对鲁加16号叶片再生的影响。

[结果]3种培养基中以MS培养基为最好，鲁加16号叶片在MS培养基上的再生频率和平均生芽数分别为62.7%和3.3个，明显高于B5(40.2%和2.1个)和1/2MS(50.4%和2.6个)培养基。

该叶片再生芽数与激素的浓度及其配比密切相关。

该叶片最适宜的培养基是：MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。

叶片的正反面接种方式对叶片再生没有显著影响。

暗培养对叶片再生不是必需的，但暗培养2周左右能明显提高
叶片的再生能力。

[结论]选择苗龄25~30d、叶色嫩绿、长势较强的叶片作为外植体，可以显著提高苹果离体叶片的再生频率。

关键词柱型苹果；鲁加16号；叶片再生；暗培养
中图分类号S661.1文献标识码A文章编号0517-6611（2008）11-04424-03
Study of Leaf Regeneration of Columnar Apple Lujia16
ZHANG Ru蛳gang et al(Breeding Laboratory of Fruit Tree,Department of Horticulture,Qingdao Agricultural University,Qingdao，Shandong 266109)
Abstract[Objective]The purpose of study was to extablish the optimum leaf regeneration system of columnar apple Lujia16.[Method]With the leaves of3-year-old tube seedlings of columnar apple Lujia16as explants,the effects of basic medium,hormone kindes and concn.matching, dark culture,inoculation modes and explant age on the leaf regeneration of columnar apple Lujia16were stduied.[Result]Among3mediums MS was best.The regeneration frequency and the mean bud number of Lujia16leaves on MS medium were62.7%and3.3resp.,being obviously higher than on B5(40.2%and2.1)and1/2MS(50.4%and2.6)mediums.The regeneration bud number had close conrelation to the hormone concn.and their matching.The optimum medium for Lujia16leaves was MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.10mg/L+sucrose30mg/L+agar7mg/L. The inoculation modes of the front and the back of leaves had no significant effect on the leaf regeneration.Although dark culture was not necessary for leaf regenerating,dark culture for about14days could obviously enhance the regeneration ability of the leaves.[Conclusion] Selecting25-30d old healthy leaves as explants could obviously enhance the regeneration frequency of apple leaves in vitro.
Key words Columnar apple;Lujia16;Leaf regeneration;Dark culture
基金项目国家科技部、山东省科技厅资助项目。

作者简介张汝刚（1980-），男，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：果
树育种。

通讯作者，教授。

收稿日期2008-02-13
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(11):4424-4426,4474责任编辑金琼琼责任校对卢瑶
30g/L ，B5的蔗糖浓度为20g/L ，琼脂7g/L ，pH 值5.8。

灭菌温度为121℃，时间为20min 。

接种后，暗培养在培养箱中进行，温度为（25±1）℃，然后转入光照培养，光强为2000lx ，光照时间为16h/d ，温度为（25±2）℃。

1.4叶片再生不定芽效率的评价指标及方法叶片在再生培养基上培养45d 后，调查叶片再生不定芽效率[19]（简称再生效率）。

设2个指标，一是再生频率，二是叶片平均再生芽数。

计算方法[20]为：再生频率（%）=再生不定芽的叶片数/接种叶片数×100；单叶平均再生芽数=叶片再生不定芽总数/再生不定芽的叶片数。

2结果与分析
2.1基本培养基的选择
不同培养基对鲁加16号和富士的叶片再生有明显的影响。

由表1可见，在3种基本培养基MS 、B5和1/2MS 中，
以MS 培养基为最好。

表1表明：在6-BA 4.0mg/L 和NAA 0.20mg/L 的情况下，以MS 作为基本培养基，鲁加16号叶片再生频率和单叶平均再生芽数分别为62.7%和3.3个，远比B5和1/2MS 高；B5培养基叶片再生情况最差，再生频率仅为40.2%。

因此，选用MS 为最适宜的基本培养基。

富士也以MS 培养基最好，B5和1/2MS 差别不明显。

2.2不同激素组合对苹果离体叶片再生频率的影响苹果叶片接种后5d 无明显变化。

8d 时，叶片仍为绿色，稍膨大，切口边缘翘起，多数叶片在切口和叶柄切断处有少量愈伤组织，呈白色或淡白绿色（图1）。

之后，愈伤组织迅速膨大，此时愈伤组织主脉处多，侧脉处少，叶片膨大肿胀明显。

15d 后转移到光照条件下，愈伤组织逐渐变为绿色或深绿色。

18~20d 时部分叶片分化出不定芽，
大多发生在叶片切口处和叶柄切断处（图2）。

不定芽在叶片上的分布主要有集中、分散等方式，生长的方向也不一致，向上、向四周生长的情况都存在，但以向上生长为主。

其颜色也由淡黄绿色转
变为绿色或深绿色。

25d 后，愈伤组织仍有少量增加，少量愈伤组织颜色变暗，大部分叶片产生不定芽。

原叶从黄绿变为绿色，愈伤组织也由白变绿，有的变褐，不定芽的数量继续增加，并陆续抽梢成株（图3）。

将再生出不定芽的叶片转移到再生培养基上最终长成无菌苗（图4）。

整个过程中，不同叶片愈伤组织生长情况也不一样，有的愈伤组织很多，整个叶片都被白色或黄白色愈伤组织覆盖，原叶已不可见；有的仅切口或叶柄有少量白色愈伤组
织，原叶清晰可见；有的叶片无愈伤组织。

大部分不定芽是从愈伤组织上长出来的，但也有一小部分是直接从伤口处
表2不同培养基对苹果叶片再生的影响
Table 2Effects of different culture medium on leaf regeneration of
apple
培养基
Culture medium 鲁
加16号Lujia No.16普通富士Common Fuji
单叶平均再生
芽
数Average
regenerated bud
number of single
leaf ∥个Regeneration
frequency
%
单叶平均再生
芽数Average
regenerated
bud number of
single leaf ∥个
Regeneration
frequency
%
MS 3.362.7 2.3
46.1B5 2.140.2 1.938.21/2MS
2.650.4
1.837.1
图1接种后8d 愈伤组织生长状况
Fig.1Growth status of callus inoculated for 8d
图2接种后25d 叶片再生不定芽生长状况
Fig.2Growth status of regeneration adventitious buds
inoculated for 25d
图3接种后40d 叶片再生不定芽生长状况
Fig.3Growth status of regeneration adventitious buds
inoculated for 40d
图4叶片再生获得的不定芽生长成植株
Fig.4Plang growing from adventitious buds by leaf regeneration
张汝刚等柱型苹果鲁加16号叶片再生研究
36卷11期4425
生长出来的。

试验结果表明：叶片再生芽数的多少不仅与激素的浓度有关，而且与激素的配比有关。

叶片平均再生芽数的多少和再生频率的高低基本一致。

培养基中6-BA 浓度过高，容易导致不定芽玻璃化。

当NAA 浓度为0.05mg/L ，6-BA 浓度为2.0、4.0、6.0mg/L 时，
叶片再生率逐渐提高，但再生不定芽小叶片有玻璃化倾向，而且6-BA 浓度越
高，玻璃化程度越大。

另一方面，当培养基中NAA 浓度相对较高时，叶片出芽数相对降低。

由表3可知：鲁加16号叶片再生的最佳培养基是组合C7，即培养基组合为MS +6-BA 4.0mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L 。

2.3不同接种方式对叶片再生的影响叶片放置方式对
离体叶片再生不定芽没有明显影响，离体叶片背面朝上和
叶片正面朝上放置，单叶再生芽数分别为4.0和3.8个，再生频率分别为96.0%和92.0%，差异不显著。

许多试验证
明，叶片放置方式与品种有关[8，21]，解释为叶片背面气孔多，
组织疏松，角质层不发达，容易吸收营养。

邵建柱[18]认为，放置方式还与叶片极性程度有关。

2.4适宜暗培养时间的确定当叶片放置在MS +6-BA 4.0mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L 培养基上培养。

不进行暗培养时，鲁加16号的再生频率仅为16.7%。

随着暗培养时间的增加，单叶平均再生芽数和再生频率迅速增加，暗培养时间15d 时达到最大，显著高于时间短的处理。

此后随着暗培养时间的延长，再生频率和平均再生芽数减少（图5）。

25d 暗培养时分化的不定芽瘦弱，
发黄，质量差。

由试验可知，前期暗培养对叶片再生不定芽是十分必要的。

适宜的暗培养可以促进离体叶片进行脱分化，再生频率升高，叶片平均再生芽数增多。

2.5苗龄对叶片再生的影响由表4可以看出，试管苗的苗龄对离体叶片再生率和出芽数影响显著。

培养25~30d 苗龄的试管苗叶片再生能力最强，叶片再生率和出芽数分别为90.0%和3.6个，而小于20d 和大于35d 苗龄的叶片再生率显著低于25~30d 的苗龄，说明苗龄过小或苗龄过老的叶片都不适宜再生。

苗龄过小，叶片发育不成熟，叶片面积也很小，不宜取材；苗龄过老，叶片衰老，再生能力下降。

此外，叶片的生理状态对不定芽的诱导也有很大的影响。

叶色嫩绿，外观厚实，生长旺盛的叶片再生不定芽的频率较高，而叶色黄绿的幼嫩叶片或外观感觉较薄、生长势弱的叶片不宜再生不定芽。

所以，在叶片再生中要选择苗龄
25~30d 、
叶色嫩绿、长势较强的叶片作为外植体。

3小结与讨论
该研究确定了鲁加16号离体叶片再生的最适宜培养基为MS +6-BA 4.0mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L +琼脂
7g/L 。

叶片离体再生虽说前期暗培养并非必需，接种后完全光照培养也可再生不定芽，但经过黑暗培养可显著提高
再生频率。

该试验结果表明，暗培养14d 为最佳暗处理时
间；采用叶片背面朝上的放置方式可获得较高的再生率；在叶片再生中选择苗龄25~30d 、叶色嫩绿、长势较强的叶片作为外植体，可以显著提高叶片再生的频率和平均再生芽数。

再生培养中，植物激素的种类和浓度是影响苹果离体再生最重要因素之一。

高浓度的细胞分裂素及细胞分裂素与生长素比值有助于外植体分化不定芽[8，21-22]
，但试验中6-
BA 浓度过高易产生玻璃化现象。

加入适宜浓度的生长素NAA ，能提高叶片的再生芽数和再生频率。

Tang 等[23]对樱桃
的研究却表明，生长素类物质抑制樱桃的再生，一般只采用
6-BA 。

该试验中细胞分裂素选用6-BA ，生长素选用NAA ，结果表明，在MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.10mg/L 培养基上，可由叶片直接分化不定芽，这种分化途径可避免或减少经过愈伤组织阶段所发生的变异，有助于获取转基因植株。

该研究结果表明，暗培养可以显著提高鲁加16号苹果叶片的再生能力，但不是必需的。

秦永华等[24]研究表明，随着光强的减弱，草莓不定芽再生率逐步提高。

韩继成等[25]认
（下转第4474页）
表3不同激素配比对苹果离体叶片再生的影响
Table 3Effects of different hormone combinations on regeneration of
apple leaves in vitro
培养基
代号
No.of
culture medium
接种数Inoculation number 个鲁加16号Lujia No.16
富士Fuji 单叶平均再生
植株数Average
regenerated
plant number of single leaf ∥个
再生频率Regenera -tion
frequen -cy ∥%单叶平均再
生植株数
Average
regenerated plant number
of single leaf ∥个
率Regener -
ation
frequency
%C1300.946.40.833.3C230 1.553.3 1.446.7C330 2.173.3 1.540.3C430 1.863.3 1.140.3C530 1.954.30.736.7C630 2.168.20.933.3C730 3.893.3 1.646.7C830 2.678.8 1.853.7C930 1.556.7 1.246.7C1030 1.976.7 1.846.7C1130 3.289.3 2.1
60.8C1230 2.656.7 1.966.2C1330 1.663.3 1.636.7C1430 1.966.7 1.346.7C1530 2.776.7 2.045.6C16
30
2.1
73.3 1.746.7
注：表中不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

Note:Different lowercases in the table mean significant differences at 0.05level.
苗龄
Seedling ages d 接种数
Inoculation number
个再生率Regeneration rate ∥%出芽数Budding number ∥个<203075.0b 2.9b 25~303090.0a 3.6a >35
30
60.0c
2.1c
表4苗龄对叶片再生的影响
Table 4Effects of seedling ages on leaf
regeneration
12345020
4060801000
叶片再生频率
图5暗培养对叶片再生的影响
Fig.5Effects of darkness culture on leaf regeneration
暗培养时间Darkness culture time ∥d
处理
Treatment
每穗总粒数
Grain number per
panicle
每穗实粒数
Filled grain number per
panicle 结实率Seed setting rate
%千粒重1000-grain weight
g 有效穗Effective panicle
万/hm 2理论产量Theoretical yield
kg/hm 2实际产量Actual yield kg/hm 2
A 89.479.989.426.6147.03124.52734.5Cc
B 94.083.789.027.7334.57755.06336.0Bb
C 101.987.285.628.0354.08643.07270.5Aa
D 100.680.580.028.0367.58283.07404.0Aa
E 90.6
74.782.427.5385.57918.57603.5Aa
注：产量后的相同字母表示在0.01水平上有差异，不同字母表示在0.05水平上有差异。

Note:Same letter after the yields mean differences at 0.01level,different letters mean differences at 0.05level.
表1氮用量运筹免耕早稻各处理产量构成
Table 1Yield components of nitrogen applying rate of no 蛳tillage early rice in each treatment
可知，氮用量运筹对早稻免耕产量构成因子影响较大。

从有
效穗看，处理C 比处理B 有效穗增加19.5万/hm 2，处理D 比处理C 有效穗增加13.5万/hm 2，处理E 比处理D 有效穗增加18万/hm 2。

可见增施基蘖穗肥都有增加有效穗的作用。

从每穗总粒看，各处理间每穗总粒为82.3~105.9，处理C 最高每穗总粒数为105.9粒，与处理B 和对照在0.01水平上有差异，与处理D 、E 在0.01水平上无差异。

从结实率来分析，随着施氮量的增加结实率呈不同程度下降趋势，经方差分析各处理间在0.01水平上无差异，从千粒重分析，处理C 千粒重最重，达到28g ，与对照在0.05水平上有差异，与其他各处理差异不显著。

从综合产量因素看，处理C 穗粒数最多，结实率高于多施氮的处理D 、E ，千粒重也最高，有效穗
居中，随着施氮量的增加，理论产量均呈下降趋势。

可见施纯氮180kg/hm 2可获较好产量。

3结论与讨论
（1）早稻免耕抛栽以施180kg/hm 2氮素产量较高，效益较好，氮用量为基肥施90kg/hm 2，促蘖肥45kg/hm 2，保花肥45kg/hm 2。

（2）早稻增施氮肥可延长生育期，试验表明每增施3kg 氮素可延长1d 生育期，在生产中要注意安排好茬口和播期。

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（上接第4426页）
为，以NN69为基本培养基，是否暗培养对梨叶片再生无明显影响，而以MS 为基本培养基暗培养是必需的。

暗培养在苹果叶片再生芽中的作用，从现象上看，一方面表现在不定芽数目增多，另一方面表现在叶切口边缘上愈伤组织明显增多。

愈伤组织主要是由组织中IAA 含量升高引起的，光具有使IAA 降解失活的作用，暗培养处理延缓了IAA 的失活，从而使组织中未结合态IAA 含量保持在一定浓度，这就产生了愈伤组织增多的现象。

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