转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10): 1679−1687　
/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@
基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2002AA2Z1001-05, 2006AA10Z106)
作者简介: 张小红(1982−), 女, 内蒙古包头人, 在读硕士研究生, 研究方向为农业生物技术; 王春连(1962–), 女, 北京人, 博士, 副研究员,
主要从事水稻遗传育种、生物技术研究。

** 共同第一作者
*
通讯作者(Corresponding author): 赵开军, 男, 研究员, 博士生导师, 研究方向为水稻遗传育种、分子生物学。

E-mail: zhaokj@
Received(收稿日期): 2008-02-26; Accepted(接受日期): 2008-05-04.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01679
转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析
张小红1,2,** 王春连2,3,** 李桂芬2 张晓科1 梁云涛2 孙亮庆2 赵开军2,3,*
(1 西北农林科技大学, 陕西杨凌712100; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部作物遗传育种重点实验室, 北京100081; 3 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程, 北京100081)
摘 要: 在分离克隆抗白叶枯病基因Xa23研究中获得大量转基因水稻材料。

为了系统研究转Xa23基因水稻的抗病稳定性和遗传模式, 本文通过逐株进行抗白叶枯病接种鉴定、PCR 和Southern blot 分子检测, 对一批转Xa23基因水稻植株进行了T 0代到T 2代的跟踪分析。

结果表明, Xa23基因的整合和表达, 使感病受体品种牡丹江8号获得抗病性。

由于Xa23基因插入受体基因组的位点不同, 同是单拷贝插入的转基因T 0代抗病植株, 其抗病程度有明显差异。

T 0代植株的抗病程度, 可以准确、稳定地遗传到T 1代和T 2代。

单拷贝转基因植株分离群体的抗感植株分离比接近3∶1, 表明转Xa23基因遵循孟德尔单基因遗传模式。

已获得2个纯合的单拷贝转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍有差别, 将用于外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病育种。

关键词: 白叶枯病; Xa23基因; 转基因水稻
Genetic Analysis on Bacterial Blight Resistance of Xa23-Transgenic Rice
ZHANG Xiao-Hong 1,2,**, WANG Chun-Lian 2,3,**, LI Gui-Fen 2, ZHANG Xiao-Ke 1, LIANG Yun-Tao 2, SUN Liang-Qing 2, and ZHAO Kai-Jun 2,3,*
(1 Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi; 2 Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agricul-ture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 3 The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081, China)
Abstract: Transgenic rice plants were previously generated by Agrobacterium-mediated transformation during our research on molecular cloning of Xa23 gene, a bacterial blight (BB) resistance gene from the wild rice species Oryza rufipogon . To investigate the stability and inheritance of the transgene and its corresponding BB-resistance phenotype, more than 350 Xa23-trangenic rice plants from T 0, T 1, and T 2 generations were subjected to BB-pathogen inoculation, PCR and Southern blot analysis for the trans-gene. Results showed that, Xa23 gene was incorporated and expressed in the genome of the susceptible receptor rice variety Mu-danjiang 8 that acquired BB-resistance. Due to the difference of the transgene insertion sites, T 0 plants with single-copy insertion performed quite different degrees of resistance and their resistance was accurately and stably inherited to T 1 and T 2 generations. We also observed that the transgene in the single-copy insertion transgenic lines inherited following the Mendelian rules. Two homozygous, single-copy insertion transgenic lines with different resistance degrees have been obtained. Keywords: Bacterial blight; Xa23; Transgenic rice
水稻白叶枯病(rice bacterial blight, BB)是水稻生产中主要的细菌性病害之一, 不仅在整个亚洲, 在美洲及非洲等地的产稻国都有发生, 一般引起减产10%~30%[1]。

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性细菌
黄单孢水稻变种(Xanthomonas oryzae pv . oryzae , Xoo )引起的一种维管束病害, 病原菌通过气孔和水孔侵入, 阻塞水分与养分运输, 导致植株萎蔫甚至枯死, 药剂防治效果不佳。

因此, 选育和推广抗病品
1680作物学报第34卷
种是防治该病最经济有效的措施[2]。

目前国内外已鉴定出抗白叶枯病基因30个[3], 但被育种利用的并不多, 主要原因是有些抗病基因抗谱狭窄容易丧失抗性, 有的为隐性基因而不便利用。

我国主栽水稻品种多含有Xa3、Xa4或Xa21基因[4], 由于多年来长期广泛利用, 在许多稻区发现已丧失抗性[5]。

章琦等[6]从野生稻中发掘的Xa23基因是目前已知抗谱最广的抗白叶枯病基因, 它能抵抗中国、菲律宾和日本所有的代表菌系。

Xa23具有完全显性和全生育期广谱高抗的特点, 对我国杂交稻的改良具有广阔的应用前景。

近年来, 我们采用图位克隆战略, 成功克隆了Xa23基因(另文发表)。

本文对一批转Xa23基因水稻的抗病性从T0代至T2代的稳定性和遗传模式进行了系统的分析, 并获得了遗传纯合、稳定的转Xa23基因抗病种质资源。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1 植物材料由本实验室利用农杆菌介导法将Xa23候选基因克隆T189导入感病受体品种牡丹江8号(MDJ8)获得转Xa23基因T0代植株。

遗传转化载体pYLTAC747HB(含潮霉素抗性基因)由华南农业大学刘耀光教授提供, T189克隆左边界(Left border, LB)与右边界(Right border, RB)之间的部分结构见图1。

参试的4个T1代群体编号分别为2003、2006、2007和2008。

T2代群体编号分别是3001、3002、3006、3007和3011。

含Xa23近等基因系CBB23为抗病对照, 由本实验室培育。

感病受体品种牡丹江8号(MDJ8)由华中农业大学王石平教授提供。

图1表达载体pYLTAC747HB的LB与RB的结构示意图Fig. 1 LB to RB partial structure of expression vector pYL-
TAC747HB
1.1.2 白叶枯病菌系专化的强毒性国际鉴别小种P6(PXO99)引自国际水稻研究所(IRRI), 真空保存于−70℃, 接种前在胁本哲氏培养基上复壮菌株, 于28℃培养48 h, 以无菌水配制接种菌液, 浓度调至1×109 CFU mL−1。

1.1.3 试剂Taq DNA聚合酶购自华美公司; λDNA/Hin d III购自TAKARA公司; DNA分子量标准参照物DL2000购自TRANS(全式金)公司; 引物由上海生工生物工程有限公司合成; DNA提取、电泳、Southern blot等所用试剂为进口或国产分析纯产品。

1.2实验方法
1.2.1 抗病性接种鉴定用人工剪叶接种法分别在植株苗期和成株期接种, 接种后14~20 d, 待感病品种病情趋于稳定时调查, 用病斑面积占叶片面积的百分率作为抗感反应参数。

本试验以15%为抗感界限, >15%为感病, 10%~15%为抗病, <10%为高抗。

1.2.2 水稻总DNA提取及PCR鉴定按McChouch等报道的酚/氯仿法提取水稻基因组DNA[7]。

根据载体T-DNA上的潮霉菌磷酸转移酶基因序列, 设计上游引物HptF: 5′-TCCACTATCGGC GAGTACTTCT-3′和下游引物HptR: 5′-AGAGCCTG ACCTATTGCATCTC-3′, 用此引物对转基因材料进行PCR扩增。

PCR反应体系含模板DNA 80~100 ng, 10×PCR buffer 2 μL, 25 mmol L−1 MgCl2 2 μL, 10 mmol L−1 dNTPs 1.5 μL, 10 μmol L−1 HptF 0.3 μL, 10 μmol L−1 HptR 0.3 μL, 5 U μL−1Taq DNA聚合酶0.2 μL, 补水至20 μL。

PCR反应程序为94℃预变性3 min, 94℃变性50 s, 60℃ 50 s, 72℃ 1 min 30 s, 循环35次, 72℃延伸10 min。

扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.3 转基因水稻的Southern blot鉴定选择PCR 鉴定阳性转基因植株, 提取DNA, 在参考Sambrook等[8]基础上对Southern blot部分实验操作做了改进。

取基因组DNA 10 μg用限制性内切酶Hin d III进行完全消化之后经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离, 将凝胶用0.25 mol L−1 HCl溶液进行脱嘌呤处理10 min, 然后用0.4 mol L−1 NaOH碱法吸印, 将DNA转移到尼龙膜(Hybond-N+, Amersham, UK)上。

吸印16 h左右后用2×SSC (0.3 mol L−1 NaCl, 0.03 mol L−1 C6H5Na307) 洗去碱液并固定DNA。

将制备好的杂交膜置杂交液(含变性鲑鱼精DNA)管中, 65℃预杂交3~4 h, 将标记好的探针(所用探针为潮霉素引物扩增载体的回收产物, 用α-32P-dCTP进行探针标记, 37℃反应1 h)变性后加入杂交液, 65℃过夜杂交, 倒去杂交液后分别用含0.1% SDS的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 3个梯度的洗液于65℃下各洗20 min (洗膜过程中要测杂交信号的强弱,洗膜时间的长短,根据杂交信号
第10期张小红等: 转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析1681
的强弱来定)。

用滤纸吸干膜上水分后用保鲜膜包好, 压在磷屏中, 根据所测杂交信号的强弱确定压膜时间的长短, 用BIO-RAD FX成像系统扫描图像。

2结果与分析
2.1转基因水稻T0代植株的抗病性分析及分子鉴定
对T189载体转化感病水稻品种牡丹江8号获得的一批T0代植株进行了抗白叶枯病接种鉴定和外源DNA插入片段的PCR、Southern blot鉴定。

从表1可以看出, 在29个转基因T0代植株中, 有26株(89.7%)对水稻白叶枯病强致病菌系P6表现抗病, 病斑面积在1%~15%之间, 有3株(10.3%)表现严重感病。

在抗病植株中, 有14株的抗病程度与抗病对照CBB23一致, 病斑面积在1%~5%之间,另外12株的病斑面积稍大一些, 为10%~15%, 但仍为抗病类型。

而3个感病植株的病斑面积达70%~80%, 与感病受体MDJ8的一致, 可见T0代抗感植株间的区别十分明显。

这些结果表明, T189载体携带的外源DNA片段的导入, 确实可以使严重感P6菌株的受体品种牡丹江8号获得抗病性。

但不同的T0代植株之间的抗病程度有一定的变幅。

表1 T0代植株的抗病性及PCR鉴定
Table 1 Bacterial blight resistance and PCR analysis of the T0 plants
植株编号Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
植株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
TB10-1 10 P TB10-50 1 P
TB10-3 15 P TB10-59 5 P
TB10-5 10 P TB10-74 10 P
TB10-6 70 P TB10-84 5 P
TB10-12 3 P TB10-98 3 P
TB10-13 3 P TB10-106 10 P
TB10-15 3 P TB10-107 5 P
TB10-16 3 P TB10-121 10 P
TB10-18 1 P WTB10-6 10 P
TB10-19 70 P WTB10-11 10 P
TB10-22 80 N WTB10-12 15 P
TB10-23 3 P WTB10-14 10 P
TB10-29 10 P WTB10-15 10 P
TB10-30 1 P MDJ8 (CK－) 80 N TB10-43 3 P CBB23 (CK＋) 1−5 N
TB10-48 1 P
P: 阳性, N: 阴性。

P: positive; N: negative.
由于T189载体中的潮霉素抗性选择标记基因(Hyg)位于T-DNA左边界(LB)一侧(图1), 而T-DNA 进入受体基因组一般是由右边界(RB)开始整合, 因此通过PCR检测Hyg基因的存在, 就可以判断T189携带的水稻外源DNA片段(Xa23基因)的存在。

根据引物HptF和HptR在Hyg基因上的位置, 转基因阳性植株可以扩增出734 bp的目的条带(图2)。

表1数据显示, 上述29个转基因T0代植株中有28个植株均表现为PCR阳性, 说明在我们的转基因实验中, 利用潮霉素抗性筛选真实转化体的效率很高, 准确率为96.6%。

从表1还可看出, 在3个感病植株中, 有2株(TB10-6、TB10-19)表现为PCR阳性(图2-A), 说明在其基因组中整合了T189携带的Xa23基因, 但可能由于基因沉默而没有表现出抗病性。

以T189质粒DNA为模板, PCR扩增潮霉素抗性选择标记基因Hyg片段作探针, 对部分T0代植株进行Southern blot分析, 结果表明大多数植株(包括TB10-6、TB10-19)为外源基因单拷贝插入, 少数植株如TB10-48和TB10-3分别为2拷贝和3拷贝插入(资料未显示)。

图3-A显示TB10-1、TB10-18、TB10-23和TB10-30单株的Southern blot检测情况。

2.2 T1代植株的抗病性和遗传分析
从T0代植株中选择4个抗病且外源DNA插入片段为单拷贝的植株(TB10-1、TB10-18、TB10-23
1682 作 物 学 报 第34卷
图2 转Xa23基因植株的PCR 鉴定
Fig. 2 PCR identification of plants of the rice transformed by
Xa23
A: T 0代植株; B: T 1代植株; MDJ8: 牡丹江8号; TAC747: 表达载
体pYLTAC747HB
A: T 0 plants; B: T 1 plants; TAC747: Expression vector pYL-TAC747HB
和TB10-30)收获自交种子, 分别得到编号为2003、2006、2007和2008的T 1代株系。

对这4个株系进行了抗白叶枯病接种鉴定和外源基因的分子鉴定, 结果列于表2和表3。

从表2和表3看出, 上述4个T 1代株系群体对白叶枯菌P6的抗性均出现分离, 其抗病植株的抗性水平与T 0代植株的完全一致, 例如T 0代植株TB10-1的病斑面积为10%, 属于中等抗性, 其T 1代株系(2003)的抗病植株也表现为中等抗性, 病斑面积多在10%~15%, 而T 0代高度抗病植株TB10-18的病斑面积为1%, 其T 1代株系(2006)抗病植株的病斑面积也为1%。

由于T 0代植株TB10-1、TB10-18、TB10-23和TB10-30均为外源DNA 片段单拷贝插入, 根据孟德尔遗传, 它们的T 1代株系如果出现抗病性分离, 理论抗感分离比应为31∶。

实际上2007群体严格符合
图3 转Xa23基因水稻植株的Southern blot 分析
Fig. 3 Southern blot analysis of Xa23-transgenic rice plants
A: T 0代植株; B~D: T 1代植株; MDJ8: 牡丹江8号; M: λDNA/Hin d III 。

A: T 0 plants; B–D: T 1 plants; M: λDNA/Hin d III.
理论分离比, 为34抗∶11感(χc 2
= 0.007, P ＞0.9), 其余3个T 1代群体抗感植株分离比均与理论值有一定偏差, 但统计上也符合31∶的抗感分离比, 其中2003群体的抗感分离比为36抗8∶感(χc 2 = 0.75, P = 0.25~0.50), 2006群体的抗感分离比为28抗16∶感(χc 2 = 2.45, P = 0.10~0.25), 2008群体的抗感分离比
为29抗16∶感(χc 2 = 2.14, P = 0.10~0.25)。

这其中的偏差显然是群体不够大造成的。

PCR 分子检测表明T 1代植株的抗病性与外源DNA 片段的存在直接相关, 即凡是抗病植株其PCR 分子检测均为阳性(表2, 表3, 图2-B)。

在感病植株中, 除2003群体的2个植株(第9、45号植株)和2008
第10期张小红等: 转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析1683
表2 T1代植株抗病性及分子鉴定(2003和2006株系)
Table 2 Bacterial blight resistance and molecular analysis of the T1 populations (2003 and 2006 lines)
2003株系 2003 line2006株系 2006 line
单株编号Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数a
Copy number a
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数a
Copy number a
1 10 P 1 1 70 N 0
2 5 P 2 70 N 0
3 10 P 3 1 P 1
4 10 P 4 70 N 0
5 10 P 1 5 1 P
6 10 P 6 1 P
7 10 P 7 1 P
8 10 P 8 1 P 1
9 70 P 1 9 60 N
11 10 P 11 1 P
12 10 P 12 1 P
13 10 P 13 1 P
14 10 P 14 1 P
15 10 P 15 1 P 1
16 10 P 16 1 P
17 10 P 17 60 N 0
18 10 P 1 18 1 P 1
19 70 N 21 1 P
21 15 P 22 1 P
22 70 N 0 23 1 P
23 70 N 0 24 70 N 0
24 50 N 0 25 1 P 1
25 60 N 0 26 70 N 0
26 15 P 1 27 1 P
27 10 P 28 1 P
28 10 P 29 1 P
29 10 P 31 1 P
31 10 P 32 70 N
32 10 P 33 1 P
33 15 P 34 1 P
34 10 P 35 70 N 0
35 10 P 1 36 50 N 0
36 70 N 0 37 50 N 0
37 15 P 38 1 P
38 10 P 39 1 P
39 5 P 41 1 P
41 15 P 1 42 1 P
42 10 P 43 70 N
43 10 P 1 44 70 N
44 10 P 45 70 N
45 70 P 46 70 N
46 15 P 47 1 P 1
47 10 P 48 1 P 1
48 10 P 49 70 N 0
P: 阳性; N: 阴性。

a随机选择部分植株进行Southern分析, 0: 无杂交带; 1: 1条杂交带。

P: positive; N: negative. a Only part of T1 plants were subjected to Southern blot analysis, 0: no hybridization band; 1: one hybridization band.
1684作物学报第34卷
表3 T1代植株抗病性及分子鉴定(2007和2008株系)
Table 3 Bacterial blight resistance and molecular analysis of the T1 populations (2007 and 2008 lines)
2007株系 2007 line 2008株系 2008 line
单株编号Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数a
Copy number a
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数a
Copy number a
1 5 P 1 1 1 P
2 3 P 1 2 1 P
3 5 P 3 1 P 1
4 5 P 1 4 40 N 0
5 3 P 5 70 N 0
6 3 P 6 50 N
7 70 N 0 7 1 P
8 3 P 1 8 70 N
9 3 P 1 9 50 N 0
11 5 P 11 1 P 1
12 3 P 12 1 P
13 3 P 13 1 P
14 3 P 14 20 N 0
15 70 N 15 1 P 1
16 3 P 16 1 P
17 3 P 17 70 P
18 3 P 18 1 P
19 5 P 19 1 P
21 3 P 1 21 50 N
22 70 N 0 22 1 P
23 3 P 23 50 N 0
24 3 P 24 1 P
25 3 P 25 3 P
26 70 N 26 70 N
27 5 P 27 25 N 0
28 3 P 1 28 1 P 1
29 3 P 1 29 35 N 0
31 70 N 0 31 1 P
32 70 N 0 32 3 P 1
33 3 P 33 3 P
34 70 N 34 1 P
35 3 P 35 1 P
36 70 N 36 1 P
37 5 P 37 25 N
38 3 P 38 1 P
39 5 P 39 1 P
41 5 P 41 1 P
42 3 P 42 35 N 0
43 3 P 1 43 1 P 1
44 3 P 44 45 N
45 3 P 1 45 1 P
46 70 N 0 46 1 P
47 70 N 0 47 70 N 0
48 70 N 0 48 1 P
49 3 P 49 1 P 1
P: 阳性; N: 阴性。

a随机选择部分植株进行Southern分析, 0: 无杂交带; 1: 1条杂交带。

P: positive; N: negative. a Only part of T1 plants were subjected to Southern blot analysis, 0: no hybridization band; 1: one hybridization band.
第10期张小红等: 转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析1685
群体的1个植株(第17号植株)外, 其余的感病植株均表现为分子检测阴性, 表明在染色体分离重组中没有获得外源DNA片段。

对于2003群体的第9、45号植株和2008群体的第17号植株分子检测为阳性, 表明其仍然含有外源DNA插入片段, 但表现为感病, 可能是由外源基因沉默导致的。

选择T1代部分抗病和感病植株进行Southern blot鉴定, 结果确认4个群体的PCR阳性植株其拷贝数都为单拷贝, 但插入基因组的位置都不相同(图3-B~D)。

从图3-B中可以看到2003群体抗病植株可以杂交出一条 2.3~4.3 kb之间的清晰的条带, 但2003-9在接种调查中为感病植株, PCR鉴定中却可以扩增到目的条带, Southern blot鉴定也可以杂交出一条小于1.0 kb的条带, 表明其可能有外源插入片段的丢失, 这很可能是其表现感病的原因。

图3-B中2007群体植株、图3-C中2006群体植株和图3-D 中2008群体抗病植株插入的拷贝数都为单拷贝, 可以看出同一群体植株都杂交出相同的带, 并且插入基因组相同的位置, 而且接种鉴定中抗病表现都相同。

虽然不同群体植株的遗传背景相同, 并且Southern blot鉴定中也都为单拷贝, 但是在接种鉴定中其抗病表现却有差异, 说明抗病表现与T-DNA 插入水稻基因组的不同位置相关。

2.3 T2代植株的抗病性遗传及转基因抗病纯合系的获得
为了进一步分析转基因的遗传模式和稳定性并获得转基因抗病纯合系, 我们从T1代株系中随机选择4个抗病植株(2006-3、2006-18、2007-43和2008-32)收获自交种子, 分别得到编号为3001、3002、3007和3011的T2代群体。

对这4个群体进行抗白叶枯病接种鉴定, 结果列于表4。

从表4看出, 4个群体中抗病植株与它们对应的T1代植株的抗病程度完全一致, 再一次说明转Xa23基因水稻植株的抗病程度可以准确地遗传到下一代。

3001群体和3011群体分离出了感病植株, 说明T1代植株2006-3和2008-32为转基因杂合植株, 它们的抗感分离比分别为25抗15
∶感(χc2 = 2.7, P= 0.10~0.25)和 32抗8
∶感(χc2 = 0.3, P = 0.50~0.75), 符合1个转基因拷贝的孟德尔遗传, 这与T1代的抗性情况相一致。

3002群体的所有单株均高度抗病, 其病斑面积为1%, 与其对应的T1代植株2006-18的抗性水平完全一致, 说明2006-18是一个纯合的单株。

3007群体中只有第20号单株表现感病, 可能是转基因丢失或基因沉默导致, 其余单株均表现抗病, 且它们的抗性水平与其对应的T1代植株2007-43的抗性水平一致, 说明2007-43也是一个纯合的株系。

由此我们获得了2个纯合的转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍有差别, 将用于抗病育种和外源基因插入位置效应的研究。

以上结果表明, 受体品种MDJ8转基因T0代植株的抗病性, 确实由外源DNA插入片段控制, 而且其抗病程度可以准确地、稳定地遗传到T1代, 其遗传模式符合孟德尔遗传规律。

3讨论
3.1转Xa23基因水稻植株分子检测与抗病接种鉴定的一致性
本研究对29个T0代转基因植株和178个T1代植株同时作了抗病接种鉴定和外源DNA片段的分子检测。

对于T0代植株有2株(TB10-6和TB10-19), 对于T1代植株有3株(2003-9、2003-45和2008-17), 其PCR分子检测结果与抗病接种鉴定结果不一致, 两种检测结果的符合率分别为93.1%和98.3%。

表明转Xa23基因水稻植株的PCR分子检测结果与抗病接种鉴定结果有很好的一致性。

由于目前许多育种单位都可以方便地开展PCR分子检测, 而抗病接种鉴定却因条件限制常不便实施, 所以在实际操作上, 可以在早期世代仅对转Xa23基因水稻植株或其衍生后代进行PCR分子检测, 待获得稳定育种株系后再进行抗病接种鉴定。

上述5个两种检测结果不一致的转Xa23基因水稻植株, 均是PCR分子检测为阳性(表明外源DNA 片段存在), 但表现为感病的。

这种现象在许多转基因研究中多有发生[9], 其原因很多, 如不同的转化条件和方法, 以及T-DNA在水稻基因组中整合时造成受体植株基因组中序列的重排和结构的改变; 或者是由于位置效应、转录水平的基因沉默、外源基因插入GC含量高的区域也会打乱它们的正常组合等等[10]。

由于我们是通过PCR检测T189载体中位于T-DNA左边界一侧的潮霉素抗性选择标记基因Hyg来判断Xa23基因的存在, 因此另一种原因可能是虽然Hyg还存在, 但Xa23基因序列有缺失, 例如T1代的2003-9植株在Southern blot分子检测中, 其杂交信号带确实比同群体的其他抗病植株的杂交信号带小(图3-B), 这可能是导致2003-9植株感病的真正原因。

1686作物学报第34卷
表4 T2代植株抗病性鉴定a
Table 4 Bacterial blight resistance of the T2 populations a
3001群体 3001 line 3002群体 3002 line 3007群体 3007 line 3011群体 3011 line
单株编号Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
1 50 1 1 1 5 1
50
2 1 2 1 2 5 2
40
3 1 3 1 3 5 3
3
4 1 4 1 4
5 4
3
5 1 5 1 5 5 5
3
6 50 6 1 6 10 6 3
7 1 7 1 7
10 7
3
8 1 8 1 8
10 8
3
9 50 9 3 9 10 9 3
10 1 10 1
10 5 10
3
11 50 11 1 11 15 11 3
12 3 12 1
12
10 12
3
13 1 13 1
13
10 13
3
14 1 14 1
14
10 14
3
15 70 15 1 15 5 15
40
16 1 16 1
16 5 16
3
17 60 17 1 17 5 17 3
18 70 18 1 18 5 18
50
19 50 19 1 19 5 19 3
20 1 20 1
20
50 20
3
21 1 21 1
21
10 21
3
22 1 22 1
22 5 22
3
23 1 23 1
23 5 23
3
24 60 24 1 24 5 24
50
25 70 25 1 25 5 25 3
26 1 26 1
26 5 26
70
27 70 27 1 27 5 27 3
28 1 28 1
28 5 28
5
29 70 29 1 29 5 29 3
30 1 30 1
30
10 30
3
31 1 31 1
31
10 31
3
32 70 32 1 32 5 32 5
33 70 33 1 33 10 33 3
34 1 34 1
34 5 34
3
35 1 35 1
35
10 35
3
36 1 36 1
36
10 36
3
37 50 37 1 37 5 37 3
38 1 38 1
38 5 38
3
39 1 39 1
39 5 39
50
40 1 40 1
40 5 40
40
a T
2
代株系3001、3002、3007和3011分别来自T1代抗病单株2006-3、2006-18、2007-43和2008-32, 该4个单株的抗性水平(病
斑面积%)分别为1%、1%、3%和3%。

a T
2
lines 3001, 3002, 3007, and 3011 were progenies of T1 plants 2006-3, 2006-18, 2007-43, and 2008-32 (Table 2), respectively; the
BB resistance levels (lesion area, %) of the four T1 plants were 1, 1, 3, and 3, respectively.
第10期张小红等: 转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析1687
3.2 T-DNA插入位点不同影响Xa23基因的抗病表达程度
外源基因均为单拷贝插入的T0代抗病植株之间, 其抗病程度有明显差异。

例如我们跟踪分析的TB10-1、TB10-18、TB10-23和TB10-30植株的株高、株型等外观形态一致(资料未显示), 但它们的病斑面积, TB10-18和TB10-30为1%, TB10-23为3%, TB10-1为10%。

而且这种抗病程度的差异可以准确地遗传到后代, 即T1代、T2代群体中抗病植株的抗病程度与其对应的T0代植株的抗病程度一致。

很多研究表明,外源基因的表达受插入位点的性质及其侧翼序列, 即位置效应(position effect) 的影响。

通常认为不同转化体间外源基因的定量表达差异常归因于外源基因不同的整合位点。

我们确实可以从Southern blot杂交图谱上看到TB10-1、TB10-18、TB10-23和TB10-30植株的单条杂交信号带的大小不同(图3-A), 说明其外源基因插入的位点不同, 这很可能是导致它们抗病程度不同的原因。

由此可以推断, 在通过基因工程利用Xa23基因育种时, Xa23基因的抗病表达程度会受到T-DNA插入位点的影响。

3.3转Xa23基因抗病纯合系的利用
Xa23基因是来源于普通野生稻的广抗谱、完全显性、全生育期高抗的优异抗白叶枯病基因, 在高产优质抗病的杂交稻研制上具有重要的应用价值。

鉴于国家对优良种质资源的保护, 含Xa23基因的水稻材料还不能输出到国外。

Xa23基因的克隆, 将使我国拥有Xa23基因的知识产权, 从而有可能通过基因产权输出使Xa23基因在水稻白叶枯病十分严重的东南亚国家发挥作用。

目前国内外推广的杂交稻基本上是籼稻, 而大多数籼稻品种的转基因十分困难, 或其遗传转化率很低, 因此本研究获得的转Xa23基因抗病纯合系可以用于杂交稻的恢复系选育。

另外, 本研究获得的2个转Xa23基因抗病纯合系均为外源基因单拷贝插入, 但抗病程度有一定差异, 因此可以分离它们的T-DNA插入位点旁侧序列, 以进一步分析其抗病程度差异的分子机理。

4结论
以农杆菌介导将水稻抗白叶枯病基因Xa23导入感病品种牡丹江8号基因组中并获得抗性表达。

由于Xa23基因插入受体基因组的位点不同, 其转基因植株抗病程度有明显差异。

T0代植株的抗病程度, 可准确、稳定地遗传到T1代和T2代。

转Xa23基因遵循孟德尔遗传模式。

获得的纯合单拷贝转基因抗病株系, 为外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病育种提供了材料基础。

References
[1] Mew T W. Current status and future prospects of research on
bacterial blight of rice. Annu Rev Phytopathol, 1987, 25: 359−382
[2] Zhang Q(章琦). Genetic evaluation and utilization of resis-
tance to rice bacterial blight in China. Sci Agric Sin (中国农
业科学), 1991, 24(3): 26−36 (in Chinese with English ab-
stract)
[3] Jin X-W(金旭炜), Wang C-L(王春连), Yang Q(杨清), Jiang
Q-X(江祺祥), Fan Y-L(樊颖伦), Liu G-C(刘古春), Zhao K-J(赵开军). Breeding of near-isogenic line CBB30 and mo-
lecular mapping of Xa30(t),a new resistance gene to bacterial blight in rice. Sci Agric Sin(中国农业科学), 2007, 40(6): 1094−1100 (in Chinese with English abstract)
[4] Zhang Q(章琦). Utilization and strategy of gene for resistance
to rice bacterial blight in China. Acta Phytophylacica Sin (植
物保护学报), 1995, 22(3): 241−246 (in Chinese with English abstract)
[5] Zeng L-X(曾列先), Zhu X-Y(朱小源), Yang J-Y(杨健源),
Wu S-Y(伍圣远), Chen Z(陈珍), Chen S(陈深). A new pathotype of Xanthomonas oryzae pv. oryzae was found and tested for pathogenicity in Guangdong. Guangdong Agric Sci (广东农业科学), 2005, (2): 58−59 (in Chinese with English abstract)
[6] Zhang Q, Wang C L, Zhao K J, Zhao Y L, Caslana V C, Zhu
X D, Li D Y, Jiang Q X. The effectiveness of advanced rice lines with new resistance gene Xa23 to rice bacterial blight.
Rice Genet Newsl, 2001, 18: 71−73
[7] McCouch S R, Kochert G, Tu Z H, Wang Z Y, Khush G S,
Coffman W R, Tanksley S D. Molecular mapping of rice chromosome. Theor Appl Genet, 1988, 76: 815−729
[8] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. pp 474−503
[9] Liu M(刘梅), Xu T(徐同). Genetic stability and enhanced re-
sistance of transgenic rice with ThEn-42 gene. Agric Bio-
technol (农业生物技术学报), 2003, 11(5): 444−449 (in Chi-
nese with English abstract)
[10] He G-Y(何光源), Yang G-X(杨广笑), Liu Y(刘勇). Plant
Gene Engineering (植物基因工程), 10th edn. Beijing: Tsinghua University Press, 2006. pp 217−241 (in Chinese)。