液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A1和A2β-酪蛋白

第59卷 第3期吉林大学学报(理学版)
V o l .59 N o .3
2021年5月
J o u r n a l o f J i l i nU n i v e r s i t y (
S c i e n c eE d i t i o n )M a y
2021d o i :10.13413/j .c n k i .j
d x b l x b .2021044液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A 1和A 2β-酪蛋白刘泽阳1,李 明2,吴佩泽2,宁 杨1,梁大鹏1
(1.吉林大学地下水资源与环境教育部重点实验室,新能源与环境学院,长春130012;
2.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京100029
)摘要:建立一种基于液相色谱-高分辨串联质谱(L C -H R M S /M S )方法检测牛奶中A 1和A 2
β
-酪蛋白.采用等电点沉淀法从牛奶中提取酪蛋白,经胰蛋白酶酶解后,将酶解产物进行L C -H R M S /M S 分析,选择含有差异氨基酸残基(第67位)的肽段作为特征肽段对A 1和A 2β
-酪蛋白进行区分.采用T r i s -H C l 缓冲溶液充分溶解酪蛋白,在酶解反应体系中添加乙腈以提高酶解效率.采用高分辨质谱和串联质谱技术,进一步排除杂质产生的干扰信号.采用该方法对市售4种普通牛奶和2种A 2牛奶进行检测,结果表明,普通牛奶中A 1β-酪蛋白的含量约为A 2β-酪蛋白含量的2~4倍,个别A 2牛奶样品含微量A 1β
-酪蛋白.该方法可检测牛奶中的A 1和A 2β-酪蛋白,具有高可靠性㊁高灵敏度等优点,为A 2奶源筛选和质量控制提供支持.关键词:β-酪蛋白;A 2牛奶;液相色谱;串联质谱中图分类号:O 615.4 文献标志码:A 文章编号:1671-5489(2021)03-0696-07D e t e r m i n a t i o no fA 1a n dA 2β-C a s e i n i n M i l kb y L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y -H i g hR e s o l u t i o nT a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y
L I UZ e y a n g 1,L IM i n g 2,WU P e i z e 2,N I N G Y a n g 1,L I A N G D a p e n g
1
(1.K e y L a b o r a t o r y o f G r o u n d w a t e rR e s o u r c e s a n dE n v i r o n m e n t o f t h eM i n i s t r y o f E
d u c a t i o n ,C o l l
e g e o
f N e w E n e r
g y a n dE n v i r o n m e n t ,J i l i nU n i v e r s i t y ,C
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c h u n 130012,C h i n a ;2.D i v i s i o n o f C h e m i c a lM e t r o l o g y &A n a l y t i c a lS c i e n c e ,N a t i o n a l I n s t i t u t e o f M e t r o l o g y ,B e i j i n g 1
00029,C h i n a )收稿日期:2021-01-25.
第一作者简介:刘泽阳(1993 ),男,汉族,硕士研究生,从事环境分析化学的研究,E -m a i l :z e y a n g 716@q q .c o m.通信作者简介:梁大鹏(1978 ),男,汉族,博士,副教授,从事环境化学和环境污染控制的研究,E -m a i l :l i a n g d p @j
l u .e d u .c n .基金项目:国家重点研发专项基金(批准号:2017Y F F 0205403).
A b s t r a c t :W ee s t a b l i s h e da m e t h o d b a s e do nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y -h i g hr e s o l u t i o nt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y (L C -H R M S /M S )t od e t e c tA 1a n d A 2β-c a s e i ni n m i l k .C a s e i n sw e r ee x t r a c t e df r o m m i l k b y i s o e l e c t r i c p o i n t p r e c i p i t a t i o n m e t h o d ,a f t e rt r y p s i n h y d r o l y s i s ,t h e h y d r o l y
s a t e s w e r e a n a l y z e db y L C -H R M S /M S m e t h o d .T h e p e p t i d ec o n t a i n i n g v a r i e da m i n oa c i d m o i e t y a tt h e67t h p o s i t i o nw a ss e l e c t e da sc h a r a c t e r i s t i cs p e c i e st od i s t i n g u i s h A 1a n d A 2β-c a s e i n .C a s e i n w a sf u l l y d i s s o l v e d i nT r i s -
H C l b u f f e r s o l u t i o n .T h e a c e t o n i t r i l ew a s a d d e d t o t h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i s s y s t e m t o i m p r o v e t h ee n z y m t i ch y d r o l y s i se f f i c i e n c y .H i g hr e s o l u t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y a n dt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y w e r eu s e d t oe l i m i n a t e t h e i n t e r f e r e n c e s i g n a l o f i m p u r i t y
.F o u rk i n d s o f c o mm o nm i l k a n d t w ok i n d so fA 2m i l k w e r et e s t e db y t
h i s m e t h o d .T h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o n t e n to fA 1β
-c a s e i n i s a b o u t 2 4t i m e s t h a to fA 2β-c a s e i n i nc o mm o n m i l k ,w h i l eas m a l l a m o u n to fA 2m i l k
s a m p l e s c o n t a i n t r a c eA 1β-c a s e i n .T h i sm e t h o d c a n d e t e c tA 1a n dA 2β
-c a s e i n i nm i l kw i t h a d v a n t a g e s o f h i g hr e l i a b i l i t y a n ds e n s i t i v i t y ,w h i c h p r o v i d e ss u p p o r t f o rA 2m i l ks o u r c es c r e e n i n g a n d q u a l i t y c o n t r o l .
K e y w o r d s :β
-c a s e i n ;A 2m i l k ;l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ;t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y 酪蛋白约占牛奶中蛋白含量的80%[1]
,酪蛋白主要包括α,β和κ-酪蛋白,其中β-酪蛋白约占40%[2]
.目前已发现超过10种β-酪蛋白的变体形式,其中最主要的两种是A 1和A 2β-酪蛋白(简称A 1和A 2蛋白)[3]
.A 1和A 2蛋白唯一区别在于其一级结构的第67位氨基酸,A 1蛋白为组氨酸(H i s t i d i n e ,H ),A 2蛋白为脯氨酸(P r o l i n e ,P )[4].尽管两种酪蛋白的差别微小,但在人体内消化时会
产生不同的生物活性肽[5].A 1蛋白产生的β-酪啡肽-7(B C M -7)可诱发多种疾病[6]
,而A 2蛋白则不产生B C M -7[7].研究表明,经常摄入A 1蛋白的人群在Ⅰ型糖尿病[8]㊁胃肠感染[9]和缺血性心脏病[1
0]
中的发病率高于摄入A 2蛋白的群体.文献[11]研究表明,患自闭症儿童尿液中的B C M -7含量明显高于健康儿童,且其B C M -7的浓度与病情严重程度正相关.尽管关于B C M -7的危害尚存在争论[1
2]
,但摄入不同酪蛋白引起的不同结果已得到广泛关注.为区分酪蛋白,本文将仅含有A 2蛋白的牛奶标为 A 2牛奶 ,以此为消费者提供针对性选择.因此,开发一种区分牛奶中A 1和A 2蛋白的检测方法具有重要意义.
检测牛奶及乳制品中β-酪蛋白种类的方法较多,如通过电泳法结合多元线性回归(M L R )
可初步判断奶酪中的酪蛋白种类[13
],尿素-聚丙烯酰胺电泳可区分牛奶中的A 1和A 2蛋白[1
4],也可通过中红外光谱法[15]或聚合酶链式反应[16]
对牛奶中的蛋白质进行分析,确定蛋白质的组成和含量.近年来,色谱和质谱技术的快速发展为各领域提供了高灵敏度㊁高精度和高可靠性的检测方法.液相色谱可分离牛
奶中不同的酪蛋白,高分辨质谱在检测完整蛋白质方面具有非常高的可靠性和灵敏度[17]
.但是不同酪
蛋白间的差异很小,它们通常具有相似的物理㊁化学性质,增大了液相色谱的分离难度.因此,通过对
酪蛋白酶解产生的特征肽段确定β-酪蛋白种类是一种更可行的方法[18].
本文建立一种基于液相色谱-高分辨串联质谱(L C -H R M S /M S
)的检测方法,通过检测特征肽段区分牛奶中的A 1和A 2蛋白.先用等电点沉淀法提取牛奶中的酪蛋白,经胰蛋白酶酶解后,再采用
L C -H R M S /M S 对酶解产物进行分析.考虑到A 1和A 2蛋白差异点在第67位氨基酸,所以选择酶解
后的蛋白片段49~97作为特征肽段.除色谱保留时间和一级质谱质荷比数据外,通过诱导碰撞解离(C I D )
模式的二级质谱实验对特征肽段进行分析,提高了结果的可靠性.为验证方法的实用性,对市售4种普通牛奶和2种A 2牛奶进行检测.结果表明,本文方法具有高可靠性㊁高灵敏度等优点,可为
A 2奶源筛选和A 2乳制品的质量控制提供技术支持.
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
C R21GⅢ型高速冷冻离心机(日本日立公司);F E 20-K 型p H 计(美国M e t t l e rT o l e d o 公司)
;S I 500型振荡培养箱(英国S t u a r t 公司);M E 614S 型电子分析天平(德国S a r t o r i u s 公司);M E 36S 型电子分析天平(德国S a r t o r i u s 公司);M i l l i -Q I n t e g r a l3型超纯水仪(美国F i s h e rS c i e n t i f i c 公司);1250系列色谱仪(美国T h e r m oF i s h e r 公司);V e l o s P R O 型(L T Q )-O r b i t r a p 高分辨串联质谱仪(美国T h e r m oF i s h e r 公司);C 18色谱柱(150mmˑ4.6mm ,2.6μm ,10n m ,美国P h e n o m e n e x 公司).聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o nX -100)㊁牛胰蛋白酶㊁牛β-酪蛋白和乙腈购自美国S i g m a -A l d r i c h 公司;氯化钠(质量分数为99.99%)购自德国S u p r a p u r 公司;三羟甲基氨基甲烷(T r i s )购自北京G P C 生物科技有限公司;盐酸(G R )购自北京化工厂;甲酸(体积分数为98%)购自瑞士F l u k a 公司;A 1和A 2特征肽标准品购自广东赛百威信息科技有限公司.牛奶样品购自长春市某超市.
1.2 样品预处理
取10m L 牛奶样品,加入40m L 的T r i s -
H C l 溶液(50mm o l /L ,p H =8.5),混匀,60ħ恒温振7
96 第3期 刘泽阳,等:液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A 1和A 2β-酪蛋白
896吉林大学学报(理学版)第59卷荡1h.取15m L上述溶液,加入15m LN a C l溶液(0.5m o l/L,含体积分数为0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚),用甲酸溶液将其p H值调至4.6[19]后,于4ħ静置过夜.离心(4ħ,10000r/m i n,15m i n)分离出沉淀的酪蛋白.用25m L的T r i s-H C l溶液再次溶解沉淀,取500μL复溶液加入100μL胰蛋白酶(0.7m g/m L),加水定容至1m L后,加入330μL乙腈.37ħ恒温反应6h,用20μL体积分数为10%的甲酸溶液终止酶解反应,样品离心(10000r/m i n,10m i n)后,取上清液备用.
1.3色谱-质谱条件
色谱.流动相A:体积分数0.1%的甲酸水溶液;流动相B:体积分数0.1%的甲酸乙腈溶液;梯度洗脱程序:50m i n内将流动相B从5%线性提升至55%;进样体积:10μL;流速:0.3m L/m i n.
质谱.电喷雾电离(E S I)正离子模式;电压:+2k V;鞘气:10;辅助气:2;吹扫气:0;毛细管温度:375ħ;轨道阱分辨率:300000;质量范围(m/z):150~2000;C I D碰撞能:24e V.
1.4数据处理
质谱数据通过仪器配备的X c a l i b u r®软件进行处理;A1和A2蛋白被胰蛋白酶酶解后产生的肽段序列由网站(h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/p e p t i d e_c u t t e r/)提供的P e p t i d e-C u t t e r工具进行计算;利用网站(h t t p s://p r o s p e c t o r2.u c s f.e d u/p r o s p e c t o r/c g i b i n/m s f o r m.c g i?-f o r m=m s p r o d u c t)提供的M S-P r o d u c t程序计算特征肽段的一级质谱和C I D产物离子的理论数据.
2结果与讨论
2.1酪蛋白提取与酶解
为充分溶解蛋白质,通常用尿素和二硫苏糖醇等搭配无机盐配制缓冲溶液[20],有助于展开蛋白质空间结构,从而提高蛋白质提取和酶解效率.为避免污染检测器,含有这类缓冲液的样品在液相色谱-质谱(L C-M S)分析前需进行脱盐处理.但脱盐处理操作繁琐,耗时长且容易导致样品损失,因此本文开发了一种不引入盐杂质的蛋白质提取和酶解方法.采用T r i s-H C l水溶液提取酪蛋白,在充分沉淀后经低温离心分离酪蛋白.低温离心可减少乳蛋白中疏水基之间的相互作用,防止乳清蛋白和酪蛋白聚集[21].但在酶解实验中,β-酪蛋白标准品和牛奶样品中提取的酪蛋白均未展现良好的酶解效果,这是由于溶液中的酪蛋白处于折叠结构所致.因此,在酶解体系中加入可使蛋白质变性的乙腈试剂[22].添加乙腈显著提高了酶解效率,同时乙腈作为液相色谱分离中的流动相B,无需在质谱检测前进行去除.经优化,最终确定体积分数为25%的乙腈对酶解效率提升最明显.
2.2液相色谱分离与质谱全扫描
使用A1和A2特征肽混合标准品溶液(15μg/m L)优化梯度洗脱程序.由于胰蛋白酶特异性切割蛋白质中碳端的赖氨酸和精氨酸残基[23],因此选择包含第67位氨基酸残基的蛋白片段49~97作为区分A1和A2蛋白的特征肽段.研究表明,核壳结构填料的C18色谱柱对相似结构的多肽分离效果优异[24],因此用其对A1和A2蛋白酶解后的特征肽段进行分离,结果如图1所示.由图1可见,经优化后, A1和A2蛋白的特征肽段可完全分离.分离后的肽段进入高分辨质谱进行全扫描分析,结果如图2所示.
在一级质谱图中,A1和A2蛋白的特征肽具有不同的带电荷情况,其中四电荷A1特征肽离子(核质比(m/z):1340.72)和三电荷A2特征肽离子(m/z:1773.95)的信号最强,特征肽段带电荷存在差异是由于二者的氨基酸组成不同所致[25],即A1特征肽比A2特征肽多一个碱性氨基酸残基(67位组氨酸).2条特征肽段检测到的分子量数据与理论数据(h t t p s://w w w.s i s w e b.c o m/m s t o o l s/
i s o t o p e.h t m)一致,质量偏差均小于4ˑ10-6.A1和A2特征肽段的相关信息列于表1.
2.3牛奶中A1和A2蛋白的测定
为验证该方法的实用性,选取市售的4种普通牛奶和2种A2牛奶进行分析,编号1~4为普通牛奶,5,6为A2牛奶.
采用L C-H R M S/M S方法,通过A1和A2特征肽的色谱保留时间和一级质谱数据可确定β-酪蛋白的变体形式.若样品中存在保留时间相近且相对分子质量相似的杂质,则会产生不易分辨的干扰信号.用串联质谱的二级质谱模式对其优化,可提高检测结果的可靠性.将特征肽进行串联质谱C I D分
析,对碎片离子信息进行解析和标注,结果如图3所示.由图3可见,碎片离子与理论数据吻合.
图1 A 1和A 2特征肽混合标准品溶液(15μg
/m L )中A 1特征肽(A )和A 2特征肽(B )的提取离子色谱F i g .1 E x t r a c t e d i o n c h r o m a t o g r a p h y o fA 1c h a r a c t e r i s t i c p e p t i d e (A )a n dA 2c h a r a c t e r i s t i c p e p t i d e (B )i nm i x e d s t a n d a r d s o l u t i o n (15μg /m L )o fA 1a n dA 2c h a r a c t e r i s t i c p e p
t i d e s 图2 分离后肽段的高分辨质谱
F i g .2 H i g h r e s o l u t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y o f s e p a r a t e d p e p
t i d e 表1 A 1和A 2特征肽段的相关信息
T a b l e 1 R e l a t e d i n f o r m a t i o no fA 1a n dA 2c h a r a c t e r i s t i c p e p
t i d e s 特征肽段氨基酸序列
理论相对分子质量实测相对分子质量相对分子质量偏差A 1I H P F A Q T Q S L V Y P F P G P I HN S L P Q N I P P 5355.895355.881.9ˑ10-6L T Q T P V V V P P F L Q P E VMG V S K
A 2
I H P F A Q T Q S L V Y P F P G P I P N S L P Q N I P P 5315.8
5315.85
3.8ˑ10-6
L T Q T P V V V P P F L Q P E VMG V S K 相比于一级质谱,从二级质谱中得到的提取离子色谱(E I C )
可排除样品中可能存在的具有相似保留时间和质量的杂质,进一步提高了分析方法的可靠性和准确性.在二级质谱中,碎片离子y 13是2种特征肽碎裂后信号最强的碎片离子,所以选择该信号构建A 1和A 2特征肽的E I C ,结果如图4所
示.牛奶样品中A 1和A 2蛋白的相对含量如图5所示.由图5可见:在1~4号牛奶样品中可同时检
测到A 1和A 2特征肽,根据峰面积半定量分析,普通牛奶中A 1蛋白约为A 2蛋白含量的2~4倍;
9
96 第3期 刘泽阳,等:液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A 1和A 2β-酪蛋白
007吉林大学学报(理学版)第59卷
图3牛奶样品中A1(A)和A2(B)特征肽的C I D谱
F i g.3C I Ds p e c t r a o fA1(A)a n dA2(B)c h a r a c t e r i s t i c p e p t i d e s i nm i l k s a m p l e s
5号牛奶样品中仅存在A2特征肽信号;6号牛奶样品中出现强度较小的A1特征肽信号,其信号强度明显低于其本身的A2特征肽信号,表明该样品中存在少量A1β-酪蛋白,可能是由于筛选A2奶源所
用的分析方法灵敏度较低所致.
图4 牛奶样品A 1和A 2特征肽的提取离子色谱(提取二级质谱中的最强信号m /z :1428.92)F i g .4 E x t r a c t e d i o n c h r o m a t o g r a p h y o fA 1a n dA 2c h a r a c t e r i s t i c p e p t i d e s i nm i l k s a m p
l e s (t h em o s t i n t e n s i t y s i g n a l m /z :1428.92e x t r a c t e d f r o ms e c o n d a r y m a s s s p
e c t r u m )图5 牛奶样品中A 1和A 2β-酪蛋白相对含量示意图F i g .5 S c h e m a t i c d i a g r a mo
f r e l a t i v e c o n t e n t s o f A 1a n dA 2β-c a s e i n i nm i l k s a m p
l e s 综上所述,本文建立了一种基于液相色谱-高分辨串联质谱方法,通过检测蛋白被酶解后的特征肽段测定牛奶中的A 1和A 2蛋白.在蛋白提取和
酶解的样品处理中,采用T r i s -H C l 作为缓冲液,乙腈作为蛋白变性剂,简化了实验操作,缩短了实验时间.利用检测特征肽段实现了A 1和A 2β-酪蛋白的鉴别,避免了完整蛋白质分析法中色谱分离难等缺点.通过液相保留时间㊁高分辨一级质谱和串
联质谱分析,进一步排除了可能产生的干扰信号,提高了方法的可靠性.通过对市售6种牛奶的分析,该方法具有较高的稳定性和灵敏性,可帮助企业开发A 2产品和服务政府部门进行质量监管.
参
考
文
献
[1] N G U Y E N D D ,S O L A H V A ,B U S E T T I F ,e t a l .A p p l i c a t i o n o f U l t r a -H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y C o u p l e dt o H i g h -R e s o l u t i o n M a s sS p e c t r o m e t r y (O r b i t r a p T M
)f o rt h e D e t e r m i n a t i o no fB e t a -C a s e i nP h e n o t y p e s i nC o w M i l k [J ].F o o dC h e m i s t r y
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07 第3期 刘泽阳,等:液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A 1和A 2β-酪蛋白
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