酵母单杂交手册(translated by mony)

酵母单杂交手册
目录
1简介
2试剂盒包含的内容
3缩写
4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息
5附加材料&酵母培养基
A cDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料
B 相应的培养基要求
6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建
A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒
B方法：构建诱饵-受体酵母菌株
7利用AbA r的表达检测诱饵菌株
A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度
8 cDNA文库的构建
A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链
B方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA第一链
C方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns技术纯化合成的双链DNA
9单杂交的文库的构建和筛选
A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选
10结果分析
11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离
A方法：通过划板确认受体表型
B方法：酵母菌落PCR以消除Duplicate Clones（假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒
D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆
E分析阳性克隆的序列
12问题排除指南
13参考文献
附录A：质粒信息
附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物
附录C：SMART技术原理
图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用
图2 将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株
图3 利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库
图4 通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功
图5 利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART技术进行扩增
图7 利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物
图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异
图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用
图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱
图11 pGADT7-Rec载体图谱
图12 pGADT7载体图谱
表格
表1 Y1HGold酵母菌株基因型
表2 利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型
表3 AbA r本底表达的预期结果
表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系
表5 Matchmaker Gold One-Hybrid问题排除指南
表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分
表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容
A介绍
Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。

Matchmaker Gold Systems具有AbA抗性因而具有很强的筛选能力，可极大地降低背景水平。

这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析蛋白质与DNA之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。

（图1）
图1. 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用
将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告菌株。

一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性(AbAr) 基因的表达。

酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌E.coli内构建的文库。

Matchmaker Gold System方法中的文库构建用到了SMART cDNA合成技术，只需从任意组织部位提取总量为100ng 的RNA，即可使用该方法构建cDNA 文库。

B酵母单杂交的原理——蛋白-DNA互作的一种实验方法
诱饵（Bait）——DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi 载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株（图2）
图 2. 通过同源重组将构建好的pBait-AbAi整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株。

ura3-52基因位于Y1HGold，常态下不活跃，造成不可逆的转座子中断现象，只有通过与野生型中的URA3 gene同源重组才可以修复。

而pBait-AbAi载体就包含URA3 gene。

当用BstBI 或BbsI酶切表达载体后，pBait-AbAi载体呈线性化，用来转化Y1HGold，转化产物可以在SD/-Ura培养基（缺尿嘧啶）的培养基中生长，这些克隆中也包含稳定的Bait-AbAi，可以用来筛选蛋白-DNA之间的相互作用。

C猎物（Prey）在Matchmaker酵母单杂交方法里，可能结合DNA的蛋白，或者说猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4 AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMART PCR扩增的cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库（图3）
图3利用SMART技术和酵母的生物学特性，在酵母中同时构建和筛选文库。

在酵母中同时构建和筛选cDNA文库。

首先，利用SMART技术构建cDNA文库，这些cDNA文库的序列末端与线性化的猎物载体pGADT7-Rec 末端具有同源序列。

将cDNA文库和pGADT7-Rec共转化到Y1HGold-Bait报告菌株中，在酵母中进行同源重组。

将酵母细胞涂布于SD/-Leu/+AbA培养板上，以筛选表达报告基因的阳性的Y1H相互作用。

探寻蛋白-DNA的相互作用——Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.5 礸/ml) 下即可对酵母产生毒性。

包含AbA r gene（AUR1-C突变基因）的转化酵母菌株pBait-AbAi可以获得抗生素抗性。

当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait），GAL4 AD就会激活AbA r 的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长（图1）。

Matchmaker Gold One-hybrid技术可被用于：
鉴定新的蛋白-DNA的互作
验证已知或可疑的蛋白-DNA的互作
明确存在互作的蛋白结构域和同源的DNA序列
方法总述：（包含以下步骤）
第一步：将目的基因（bait）克隆到pAbAi载体上
第二步：将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold酵母菌株中（图2）
第三步：测试Y1HGold bait菌株的AbA r背景表达水平
第四步：通过共转化和体内同源重组构建和筛选cDNA文库（图3）
第五步：确认和解释筛选结果
ATTENTION: Successful use of any yeast one-hybrid system depends upon no/low recognition of your target sequence by endogenous yeast transcription factors, which can cause high background expression of the reporter gene. For this reason it is critical to test your Y1HGold [Bait-AbAi] strain for AbA r expression (AbA resistance) before screening a library (see Section 6).
注意！酵母单杂交系统是否可靠取决于内源酵母转录因子不识别/几乎不识别你的目的片段，如果能识别该目的片段将造成报告基因很高的背景表达。

因此，在进行文库筛选前要严格测试酵母菌株Y1HGold [Bait-AbAi] AbA r的表达（可产生AbA抗性）
2试剂盒包含的内容
The Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System (Cat. No. 630491)包含的材料可以构建5个酵母单杂交文库，推荐使用Advantage® 2 PCR Kit (Cat. Nos. 639206 & 639207) 试剂盒扩增SMART cDNA来获得双链DNA（ds cDNA）
3 缩写
4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息
表1是Y1H Gold 酵母菌株的基因型，表2是在不同SD（营养缺陷型）培养基上的表型。

若想了解更多关于酵母生长和繁殖的信息，请查阅Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Guthrie & Fink, 1991)
5附加材料&酵母培养基
A cDNA扩增、文库构建、文库筛选所需材料
进行PCR时DNA聚合酶的稳定性。

推荐使用the Matchmaker Gold kit扩增SMART单链cDNA，并以此为模板，用Advantage 2 PCR Kit(Cat Nos. 639206 & 639207)扩增ds DNA。

利用Advantage 2聚合酶混合物扩增cDNA(as large as 20 kb)比常规PCR具有更高的保真性。

Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 不包含Advantage 2 PCR Kit。

限制性内切酶BstBI 或BbsI，可使pBait-AbAi质粒线性化，帮助其更好的转化并整合到Y1H-Gold中。

（酵母菌落PCR确认pBait-AbAi质粒已整合到Y1H-Gold基因组中，用rTaq即可）
（PCR仪）
其他实验室常规试剂、酶以及质粒构建、扩增、鉴定等所需试剂。

详见individual protocols for requirements。

B酵母培养基及所需营养成分
（详见附录B）
（AbA，已买，具体介绍、使用说明等见附录B）
酵母培养基（附录B有每一个组分购买、配制等详细介绍说明）
YPDA是用于培养所有S. cerevisiae酵母菌株的一种常规的丰富培养基。

附加的腺嘌呤（adenine）可阻止酵母因继代培养代数过多而变成粉红色。

SD培养基(synthetically defined medium)是用于S. cerevisiae酵母菌株培养和质粒转化鉴定的一种minimal media。

SD base培养基包含了一个酵母细胞生长所需的所有最基本的东西，包括碳源和氮源。

而各种重要的氨基酸分别加到SD base培养基中就形成了minimal media。

Clontech’s Yeast Media Pouches已经包含了预先混合好的各组分。

根据转化质粒的抗性标记基因选择不同的minimal medium以供含有转化质粒的酵母菌株生长。

SD/-Ura DO supplement（缺乏尿嘧啶的SD培养基内容物）用于鉴定bait-reporter是否构建整合到YIHGold菌株中。

SD/-Ura DO supplement中包含了酵母生长所需要的所有营养物质，除开尿嘧啶（这是公司规模化生产的一种商品，DO就是dropped out的意思）。

因为pAbAi质粒编码一个URA3基因，其产物就是尿嘧啶。

因而整合了该质粒的酵母菌株可以在缺乏尿嘧啶的培养基中生长，而普通的酵母细胞中该基因处于抑制状态，不能自己合成尿嘧啶，则不能在这种缺陷型培养基上生长。

SD/-Ura/AbA*培养基。

若prey proteins与bait sequence之间存在相互作用，就会产生Aureobasidin A 抗性，用于筛选的AbA的浓度要根据每个酵母菌株的不同采用滴定法进行确定。

6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建
在开始实验前请仔细阅读该说明书，克隆目标基因详见方法A。

获得Y1hgold target reporter bait strain详见方法B。

A．方法：构建pBait-AbAi 质粒
pBait-AbAi质粒必须包含至少一个目的DNA拷贝，插入到pAbAi 载体AbA r受体基因的上游，(具体说明见Target Sequence Notes)。

许多研究表明高效的质粒包含三个目的基因的串联拷贝，但是在有些情况下单拷贝也能满足条件。

有多种方法可以获得串联拷贝，其中利用寡核苷酸合成（引物合成）是最为方面可靠的办法，尤其是合成<20 bp的常规片段。

（设计引物时两端酶切位点应不同
mutant bait载体作为负对照，方法见Section 10
若有已知的与目的序列互作的蛋白，可将其整合到pGADT7 vector作为正对照）
1. 针对不同的目的DNA序列，设计两个反向平行的引物，该引物对必须包含pAbAi载体上的酶切位点，
以产生粘性末端。

强烈建议当5’-end选择MCS中SmaI上游的多克隆位点做为酶切位点时（比如SacI），3’-end选择SalI或XhoI作为酶切位点。

建议同时构建一个mutant bait载体，这个载体包含一段可以抑制bait结合文库蛋白的目的DNA序列（RNAi？）
2. 合成的引物在PCR程序过程中，退火之后，引物可以结合到pAbAi载体上。

引物在–20°C保存。

a.溶解引物至终浓度为100 µ M的母液
b.按照1：1比例混合上游引物和下游引物，至终浓度为50 µM（假设100% theoretical annealing)
c.将混合后的溶液在95°C处理30s，使所有二级结构解聚
d.72°C 加热2 min
e.37°C 加热2 min
f. 25°C 加热2 min
g.置于冰上
3. 线性化1 ug pAbAi载体。

用限制性内切酶酶切pAbAi载体，使其带有粘性末端（详见Section 6 A.1）。

跑琼脂糖凝胶电泳，分离线性化的载体，再切胶回收纯化该片段。

4. 连接线性化的pAbAi Vector和ds oligonucleotide
a.将（2g.冰上保存的）引物浓度稀释到0.5 µ M
注意：为了达到较高的连接效率，引物一定要进行稀释，若引物浓度太高会降低连接效率。

b.反应体系：（按照相应比例换成10uL体系）
注意：如想做对照，可用1uL ddH2O替代目的片段
Note: If desired, a control ligation can be assemble d using 1 μl of nuclease-free H2O instead of annealed oligonucleotide.
c.反应混合液置于室温3h，转化大肠杆菌E. coli，菌落PCR鉴定阳性菌落，挑阳性菌落，摇菌扩繁，提质粒，酶切鉴定载体是否构建成功。

B. 方法：获得Bait-Reporter Yeast Strains
将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold菌株中包含以下步骤（示意图见Figure 2）：
第一步：用限制性内切酶BstBI 或BbsI酶切pBait-AbAi，pMutant-AbAi（阴性对照，确定有相互作用后再构建），和p53-AbAi（阳性对照，一定与AD存在互作）质粒，使其线性化。

第二步：将线性化的质粒转入Y1HGold菌株，用SD/-Ura培养基进行筛选。

第三步：菌落PCR鉴定阳性菌落，消除假阳性。

pMutant-AbAi和p53-AbAi如何鉴定？Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)？
第四步：摸索确定抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度。

强烈建议按照以下方法将线性化的p53-AbAi转入酵母做为阳性对照（正对照），构建pMutant-AbAi 作为阴性对照（负对照）。

所需材料：
Y1HGold yeast strain
p53-AbAi质粒以及根据方法A构建的pBait-AbAi质粒和pMutant-AbAi 质粒
限制性内切酶BstBI或BbsI
去DNA试剂盒DNA clean-up kit (e.g. NucleoSpin Extract II, Cat. No. 740609.50)
Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (included)
Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)
SD base+ DO Supplement-Ura 固体培养基（SD/-Ura with Agar）
YPDA液体培养基（可采用YPD代替YPDA）
1. 用限制性内切酶BstBI或BbsI同时酶切2ug pBait-AbAi，pMutant-AbAi和p53-AbAi，将载体
上的URA3基因打断，载体线性化。

酶切后，电泳分离片段，切下目的片段，用试剂盒回收纯化。

可用NucleoSpin Extract II (Cat. No. 740609.50)试剂盒，本实验室用普通胶回收试剂盒。

2. 用Yeastmaker Yeast T ransformation System 2（PT1172-1）里面提到的方法，将线性化的1ug
质粒转到Y1HGold中
3. 将转化后的菌液分别稀释10倍，100倍，1000倍，吸取100 uL稀释后菌液到
SD/-Ura固体培养基上。

4. 培养三天后，挑取5个单菌落，用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1做菌
落PCR，确定阳性菌落（原理见图4）。

用未转化的Y1HGold菌株做负对照。

图4.用菌落PCR验证pBait-AbAi整合到Y1HGold中。

Matchmaker Insert Check PCR Mix 1中的引物位于Y1HGold基因组中的AbA r基因上，处于URA3基因的下游。

如果质粒成功整合到Y1HGold 中，利用这对引物可以扩增出一段包含bait序列的约1.4kb+X的片段。

联系图2更便于理解。

预期的PCR结果分析：
正对照：1.4kb
负对照：没有条带
包含目的片段的菌株：1.35 kb + Insert size（1.5kb）
5. 确认为阳性菌株的各挑一个单菌落，以及正对照p53-AbAi c ontrol上的一个菌落，挑菌在
SD/-Ura培养基上划线，30℃倒置培养平板3天，在4℃至少保存1个月，既构建好Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi] control s train。

6. 挑菌在YPDA (3 ml)液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，加1mL freezing medium (Appendix
B)重悬菌体。

在液氮中速冻后，可在–70℃长期保存。

注意：完整的质粒是非常稳定的，即使在没有URA3选择压力的液体培养基上过夜培养，也不会导致质粒部分结构丢失。

7.利用AbA r的表达检测诱饵菌株
A. 方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度
如果bait sequence整合到pAbAi载体中，在没有猎物蛋白（prey）的诱饵报告菌株（bait reporter stain）
中的本底表达水平是不稳定的。

例如，抑制p53-AbAi control生长的的最低Aureobasidin A浓度是100 ng/ml。

注意：任何酵母单杂交实验成功的关键取决于酵母内源转录因子对你的目的片段不识别/几乎不识别。

因此，
在筛选文库（或验证相互作用）前要用AbA r expression严格测试构建好的诱饵菌株。

以下的实验方法可以帮你确定在文库筛选过程中抑制bait construct本底表达的AbA浓度。

所需材料：
利用第6部分B方法得到的Y1HGold[Bait/AbAi] strain，Y1H[Mutant/AbAi] strain和Y1HGold[p53/AbAi] control strain
SD/-Ura培养基
Aureobasidin A (AbA)
包含100–200 ng/ml AbA的SD/-Ura/AbA培养基
方法：
1. 从bait和control strains中挑选较大的菌落，用适量0.9% NaCl重悬菌液，调至OD600~0.002（即大
约每100uL包含2000个细胞）
2. 分别在SD/-Ura，SD/-Ura with AbA (100 ng/ml)，SD/-Ura with AbA (150 ng/ml)和SD/-Ura with AbA
(200 ng/ml)培养基中各点100uL，30℃倒置培养2-3d
3. 预期结果见表3
注意：如果200 ng/ml的AbA也不能抑制本底表达，可以尝试将AbA浓度加大到500-1000 ng/ml。

但是如果在没有prey的情况下，1000 ng/ml也不能抑制AbA r基因的表达的话，你的bait DNA sequence极有可能被酵母内源转录因子识别，那么你的这段序列就不能用于酵母单杂交的筛选试验。

4. 筛选文库时，用抑制bait strain生长最低的AbA浓度，或者用比最低浓度高50–100 ng/ml的能完全
抑制生长的AbA浓度。

8 cDNA文库的构建
（本实验不需要，此部分未翻译）
包含表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系
图5利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec
图6利用SMART技术得到高纯度的cDNA文库
图7利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物
9单杂交的文库的构建和筛选
（本实验不需要，此部分未翻译）
10 结果分析
在经过单杂交文库的筛选验证后，你可能获得了几个可能与你的序列有相互作用的蛋白，其中，需要你做进一步分析的这种阳性互作的蛋白可能极少，也可能很多。

此时，建议您先按下列步骤进行检查：
A 阳性候选蛋白很少的情况
●Have you screened >1million independent clones? Refer to Section 9.A, step 6 to calculate
whether you have screened at least 1 million independent clones. Optimize the transformation procedure and repeat the screening procedure.
●Check that your growth media performs as expected with the positive and negative controls.
●Retest the minimal inhibitory concentration of AbA for your bait strain
●Try increasing the number of repeats of your target sequence. Generally we find that three
repeats work well.
B阳性候选蛋白很多的情况
●Have you determined the optimal AbA concentration for your bait as described in Section
7.A?
●Check that your media performs as expected with the positive and negative controls.
●If you used 100 ng/ml AbA, repeat the screen with 200 ng/mL.
●Pick only large healthy colonies after 3–5 days to analyze further in Section 10.
●Your bait may interact with a partner that is abundant in the library. Sort duplicates by yeast
colony PCR (Section 11.B). After the clones have been sorted into groups, a representative of each unique type can then be analyzed for false positive interactions (Section 11.D).
11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离
请在开始实验前完整阅读本方法
表型确认的详细说明见方法A，酵母菌落PCR消除假阳性见方法B，能有效激活AUR1-C reporter的文库质粒的提取与分离见方法C，阳性互作和假阳性互作的区分见方法D。

下列推荐的方法可以帮助你确认真正的阳性互作，但是，请注意：your preferred order of events may be somewhat determined by the number of positives obtained from your assay. 比如，如果与你的bait sequence存在相互作用的蛋白在文库里是功能冗余的，你将会得到许多候选的阳性蛋白，需要你进行分类，它们中甚至很多可能是同一个蛋白，在这种情况下，在分离质粒前你可以通过进行菌落PCR实验(Section 11.B)消除因酵母繁殖造成的复制克隆。

但是如果候选的阳性克隆很少，你就可以省略菌落PCR筛选步骤。

A.方法：再划板确认报告表型
所需材料：
●在SD/-Leu/AbA*培养基上筛选文库得到的单克隆菌落
（本实验将构建好的AD转到Y1HGold中，用SD/-Leu/AbA*培养基得到单克隆）
●SD/-Leu/AbA*培养基（见Appendix B）
方法：
1.挑取阳性克隆在SD/-Leu/AbA*培养基上再划板获得单克隆(Appendix B)
2.真正的阳性克隆在30℃倒置培养2-4天后会再长出健康的单菌落，这些单菌落要进行
扩大培养以进行随后的分析。

B．方法：酵母菌落PCR消除假阳性（Duplicate Clones）
1.用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Cat. No. 630497)扩增的你的文库插入片段（prey），这个试剂盒预先混合了酶，反应液（buffer）和引物，可以扩增出pGADT7载体上的cDNA 插入。

接下来你可通过第2-4步，用限制性内切酶酶切的方法排除假阳性。

强烈推荐使用此试剂盒，因为在使用过程中方便可靠。

2.用0.8%TBE的琼脂糖凝胶电泳分析菌落PCR产物，扩增出多条条带属正常现象，因为一个细胞中可能包含多个prey质粒。

注意：为了确认大小相近的条带是否包含相同的插入片段，可用AluI、HaeIII或其他常用的内切酶酶切PCR产物，再用2%的琼脂糖凝胶分析产物（用浓度大的胶可以更好的分离片段）。

3.如果大多数的克隆里都包含一个大小相同的片段（AD/library insert），expand your PCR analysis to another batch of 50 colonies.
4.在此阶段，为了尽快的确认克隆片段，在照胶时只显示一条带的菌落可以用离心柱纯化（是否要挑菌提质粒？还是直接送菌液？或者直接切胶回收，回收产物即可用T7扩出来？），用T7引物确定序列（送测序，用通用引物T7）。

C．方法：能有效激活的文库质粒的提取与分离
1.分离酵母文库中的质粒
转化后的酵母细胞体内可以同时存在多个不同的相关质粒（不用于转化后的E.coli细胞），这意味着在一个酵母细胞中，除开包含一个编码与bait序列相互作用的蛋白的prey质粒外，还可能包含其他没有相互作用的prey质粒。

●如果你没有首先排除掉那些没有相互作用的prey，就采用转化E.coli来提取质粒的话，
那么你有可能得到并不存在相互作用的prey质粒。

●为了增加提取到阳性质粒的可能性，建议在SD/-Leu/AbA*培养基上划板2-3次，每次都
挑取单菌落再划板，这样质粒就可以在这些克隆中分离出来（见第2步）。

2.从酵母细胞中分离出文库质粒
推荐使用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Cat. No. 630467)来提取SD/-Leu/AbA*培养基上长出的酵母细胞中的质粒，以便于确认是否为阳性互作。

3.提取到的质粒转化E.coli，分离文库prey质粒
因为pGADT7-Rec包含一段Amp抗性基因，所以prey质粒可以转化到任何E.coli菌株中，比如DH5α，并用含有100µg/mL Amp的LB板进行筛选。

D．方法：区分阳性互作和假阳性互作
使用酵母单杂交筛选系统，有可能出现假阳性，因此，按照下列标准排除bait 序列和a prey 蛋白之间的假阳性互作就十分重要。

阳性互作（Genuine Positive）：激活AbA r报告基因要求同时存在Bait序列和Prey。

假阳性互作（False Positive）：prey和突变的bait序列一起激活AbA r报告基因。

图8. 说明报告基因表达模式在阳性互作和假阳性互作之间的差异
所需材料：
●Yeastmaker Yeast Transformation System 2 reagents
●Y1HGold[Bait/AbAi] y east
●Y1HGold[Mutant/AbAi] y east（暂时先不做，突变就要做结构域缺失）
●SD/-Leu培养基
●SD/-Leu/AbA*培养基
方法：
1.使用Yeastmaker Transformation System 2中的试剂以及小剂量转化步骤，分别将分离出
的prey质粒转化100ng到下列酵母菌株中。

●Y1HGold[Bait/AbAi]
●Y1HGold[Mutant/AbAi]
注意：建议在进行这些实验时同时加入正对照和负对照（Section 5）。

2.将转化后得到的酵母菌液分别稀释10倍、100倍后滴100uL到下列培养基中：
●SD/-Leu培养基
●SD/-Leu/AbA*培养基
3.在30℃恒温箱中倒置培养3-5天后，预期结果：
图9是使用共转方法并通过筛选培养基验证单杂交的互作。

图9. 通过共转化选择性培养基验证相互作用
E 阳性克隆的序列分析
一旦这种相互作用被证明是阳性的，就可以通过从E.coli中提取质粒DNA的方法测得prey 的序列，可通过下列步骤测得AD/文库cDNA插入片段的序列：
●Matchmaker AD LD-Insert Screening Amplimer Set (Cat. No. 630433)
●T7序列引物
Verify the presence of an open reading frame (ORF) fused in frame to the GAL4 AD sequence, and compare the sequence to those in GenBank, EMBL, or other databases.（本实验已经知道AD 序列，只需验证是否存在相互作用）
注意：建议先排除你的克隆是假阳性（Section 11.D），再考虑下列可能性。

（遇到实际问题时再详细看）
13 参考文献
附录A：质粒信息
图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱
图11 pGADT7-Rec载体图谱
图12 pGADT7载体图谱
附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物
表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分
表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容
B．培养基配置方法
配置好的培养基溶于500mL ddH2O，121℃高压蒸汽灭菌15min，在使用前要降至常温，（液体培养基也可以过滤灭菌）。

灭菌时间不能过长。

Clontech公司提供的预先混合好的培养基不需要调pH，但是如果配置使用的ddH2O偏酸性，就要将pH调到5.8。

关于培养基配置的更多细节可以查询Clontech Yeast Media Protocol-at-a-Glance (PT4057-2)。

C. 保菌用的培养基
将100mL YPDA（已灭菌）和50mL 75%甘油（已灭菌）混合，如有必要，可以过滤灭菌。

D．Aureobasidin A: 母液储存条件
将1 mg Aureobasidin A溶于2 ml无水乙醇，配置成500 µg/ml的母液，4°C保存。

E Aureobasidin A: 工作液浓度为100–200 ng/ml
配置好的固体培养基经高压蒸汽灭菌后降温至约50℃时，加入适量AbA母液至终浓度，混合均匀后倒板。

附录C：SMART技术原理。