均匀设计法优选盐酸小檗碱脂质体的处方
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谭丽蓉 1 ,李国强 2 ,陈俊威 1 ,苏 炜 1 ,容凯文 3
(1. 江门市中心医院 ,广东 江门 529070; 2. 广州市花城制药厂 ,广东 广州 510555; 3. 江门市人民医院 ,广东 江门 529000)
[摘 要 ] 目的 :对盐酸小檗碱脂质体的处方进行优化 。方法 :采用薄膜蒸发 —主动载药法制备盐酸小檗碱脂质 体 ,按均匀设计法 ,以包封率和载药量为考察指标 ,对实验结果进行最优子集法的二次回归优选处方配比 。结果 :采用 优化处方制备的脂质体 ,平均包封率为 79. 33% ,载药量 30. 21,粒径范围为 2. 2μm ～3. 8μm。结论 :用均匀设计法优 化后的处方制得的盐酸小檗碱脂质体 ,包封率和载药量都较高 。
·1386·
实用医技杂志 2007年 4月第 14卷第 11期 (旬刊 ) JPMT, Ap ril. 2007, Vol. 14, No. 11 ( Issued Every Ten Days)
卵磷脂膜后 ,加入枸橼酸缓冲液 (pH = 3. 64) ,水化 ,得空白脂 质体 ;将所得空白脂质体用 0. 8 μm 的微孔滤膜过滤后 ,加入 Bb溶液 ,并加入 NaHCO3 溶液 ( pH = 8. 32)调外水相值 ,水浴 孵化 ,得到 Bb脂质体混悬液 (1 mg /m l) 。 2. 2 包封率及载药量的测定 2. 2. 1 Bb标准曲线的制作 用 pH 7. 0磷酸缓冲液 ( PBS)配 制一定浓度的 Bb溶液及脂质体成膜材料溶液 ,经紫外分光 光度计扫描得知 Bb在 344 nm 处有最大吸收 ,而脂质体成膜 材料如 SPC、CH、VE等在该波长处几乎无吸收 ,故选择 344 nm 为 Bb含量的测定波长 。精密称取 Bb 标准品 20 mg,置 100 m l量瓶中 ,加入 PBS使完全溶解 ,并稀释至刻度 ,摇匀 。 再将该溶液用 PBS稀释成含 Bb 0. 25 mg/L、0. 5 mg/L、1. 0 mg /L、2. 0 mg/L、4. 0 mg /L、8. 0 mg/L、16. 0 mg /L 的溶液 ,以 PBS作参比 ,于 344 nm 处测定吸收光度 。结果表明 ,在 0. 25 mg /L～16. 0 mg /L的浓度范围内 , Bb的吸收度 A 与其浓度 C 呈线性关系 ,线性回归方程为 A = 6. 412 ×1022 C + 2. 540 × 1023 , r = 0. 999 2。 2. 2. 2 包封率的测定 [3 ] 取脂质体混悬液 0. 1 m l 2份 ,一份 直接加入 95%乙醇 6 m l溶解 ,用 PBS稀释至刻度 ,摇匀 ;另一 份加于阳离子交换树脂顶端吸附 ,然后用 PBS洗脱 ,收集滴 出液于 10 m l的量瓶中 ,加入 95%乙醇 6 m l溶解脂质体 ,用 PBS稀释至刻度 ,摇匀 ;分别于 344 nm 处测定吸收光度值 A。 包封率 E% = (A1 /A2 ) ×100% (其中 A1、A2分别为过阳离子 柱和未过阳离子柱样品的 A值 ) 。 2. 2. 3 载药量的测定 [4 ] 载药量 LP = (M1 - M2 ) /M3 ×100 (其中 M1 为脂质体中盐酸小檗碱的总含量 ; M2 为游离药物 含量 ,通过 C2 - C1 求出 ; M3 为卵磷脂的用量 ) 。 2. 3 脂质体的形态和粒径分布 将样品涂在有支持膜的铜 网上 ,用磷钨酸进行负染 ,自然凉干 ,用透射电镜观察脂质体 的形态和粒径分布 。
1. 1 仪器 RE - 52A 型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器 厂 ) ; UV - 2401型紫外分光光度计 (日本岛津 ) ; JEM - 2000 Ex型透射电子显微镜 (日本 ) ; DZF - 6050型真空干燥箱 (上 海精宏实验设备有限公司 ) ; GB 204梅特勒电子天平 (瑞士 ) 。 1. 2 试药 盐酸小檗碱 (简称 Bb,四川什邡华安药物原料有 限公司 ) ;卵磷脂 ( SPC,华东师范大学化工厂 ) ;胆固醇 ( CH , 中国医药上海化学试剂公司 ,分析纯 ) ;维生素 E (VE,浙江医 药股份有限公司新昌制药厂 ) ; 阳离子交换树脂 (上海树脂 厂 ) ;其它试剂为分析纯 。 2 方法 2. 1 Bb脂质体的制备工艺 [3 ] 采用薄膜蒸发 - 主动载药法 制备盐酸小檗碱脂质体 ,按一定比例定量称取 SPC、CH、VE 溶于适Байду номын сангаас无水乙醇 ,于 60 ℃水浴中加热溶解 ,减压蒸发 ;制备
[关键词 ] 盐酸小檗碱 ;脂质体 ;均匀设计法 ;处方优化 [中图分类号 ] R914 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 167125098( 2007) 1121385202
Applica tion of Un iform D esign for Prepara tion of Berber ine Hydrochlor ide L iposom es TAN L i2rong1 , L I Guo2qiang2 , CHEN Jun2wei1 , SU W ei1 , RONG Kai2wen3
( 1. The Cen tra l Hospita l of J iangm en, J iangm en, Guangdong 529070, Ch ina; 2. Huacheng Pha rm acy of Guangzhou, Guangzhou, Guangdong 510555, Ch ina; 3. The People’s Hospita l of J iangm en, J iangm en, Guangdong 529000, Ch ina) Abstract:O b je c tive To op tim ize the formulation in the p reparation of berberine hydrochloride liposomes. M e tho d s U sing thin film evaporation and active loading method to p repared berberine hydrochloride L iposomes according to the uniform de2 sign, a op timum formulation was established by detem ining the encap sulation efficiency and ratio of loading drug. R e su lts The average encap sulation efficiency and ratio of loading drug of the op tim ized liposomes were 79. 33% and 30. 21 , their size range was 2. 2μm～3. 8μm. Co nc lu s io n The app lication of the uniform design is useful to achieve a large encap sulation efficiency and ratio of loading drug. Key words:Berberine hydrochloride; L iposomes; Uniform design; Op timum p reparation
ture[ J ]. Cancer, 1981, 47: 5772582. [ 2 ] Heidenreich A , Engelmann U H, V ietsch H V , et a l. O rgan p reser2
ving surgery in testicular ep idermoid cysts[ J ]. J U rol, 1995, 153:
实用医技杂志 2007年 4月第 14卷第 11期 (旬刊 ) JPMT, Ap ril. 2007, Vol. 14, No. 11 ( Issued Every Ten Days)
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病理检查 , Heidenreich等 [2 ]采用冷冻切片活检睾丸表皮样囊 肿 18例 ,无一例误诊 。鉴别诊断主要为单胚层的畸胎瘤 ,但 组织学上囊壁由被覆鳞状上皮的纤维组织构成 ,不含皮肤附 属器 ,这是与皮样囊肿 /畸胎瘤的重要区别 。在 WHO 的睾丸 肿瘤分类中明确指出 :在连续切片的囊壁中如无皮肤附属器 成分的表皮样囊肿不应列入畸胎瘤范畴 。与精原细胞瘤的鉴
别在于大体所见及组织学表现 ,有报道睾丸组织内有无瘢痕 组织也有 助 于 鉴 别 , 因 瘢 痕 组 织 可 能 代 表 了 , 自 动 消 失 的 ( burnt2out)精原细胞瘤 ,故 B 超或冷冻切片活检应对肿瘤周 围组织进行检查 。此肿物为良性病变 ,可以行单纯肿物完整 切除 ,由于表皮样囊肿被公认为是良性病变 ,且保存患侧睾丸 对于年轻男性的生理需要及心理健康极具意义 ,近年来越来 越多的人主张行保存睾丸的手术 [4 ] 。 Shah 等 [1 ]总结了 141 例病例 ,仅 24例 (17. 0% )采用局部切除或肿瘤剜除术 ,术后 随访 1 a未见复发或转移 。
1147 21150. [ 3 ] Shenoy V , Triest W E, el2Bash O. B ilateral ep idermoid cyst of the
testis: report of a case with p reservation of 1 testis[ J ]. J U rol, 1995,
参考文献 : [ 1 ] Shah K H,Maxted W C, Chun B. Ep idermoid cyst of the testis: a re2
port of three cases and a analysis of 141 cases from the world litera2
2. 4 均匀设计法优选处方 根据预实验结果确定 3个考察 因素 :制备 Bb脂质体 SPC、CH和 Bb的用量 。用均匀设计 3. 0版软件筛选出 U 8 (83 )配方均匀设计表安排 8次实验 ,见表 1。
153: 193321934. [ 4 ] Fu Y T,W ang H H, Yang T H, et a l. Ep idermoid cyst of the testis:
diagnosis by ultrosonography and magnetic resonance imaging resul2
盐酸小檗碱 (黄连素 )是从毛茛科植物根茎中提取的一 种异喹啉生物碱 ,临床主要用于清热解毒 、治疗肠道感染 ,近 年发现还有治疗心律失常 、高血压 、高脂血症 、糖尿病和抗肿 瘤等作用 。研究发现 ,盐酸小檗碱对人类肝癌细胞 、艾氏腹水 瘤 、结肠癌细胞 、食道癌细胞系 、鼻咽癌细胞 、膀胱癌细胞 、恶 性畸胎瘤细胞 、大鼠 9 L 脑肿瘤细胞等都具有一定的抑制和 杀灭作用 [1 ] 。黄林清 [2 ]等在进行抗肿瘤的实验中发现 ,盐酸 小檗碱体内抑瘤作用没有体外作用明显 ,可能与其肠道吸收 差 ,在体内很难达到对肿瘤细胞有效的血药浓度有关 。脂质 体是一种新的给药系统 ,能增加药物局部浓度 ,提高药物疗 效 ,减少药物的不良反应 。本文通过均匀设计法对盐酸小檗 碱脂质体的制备处方进行了优化 。 1 仪器和试药
ting in organ2p reserving surgery[ J ]. B r J U rol, 1996, 78: 1162118. [ 5 ] 武忠弼 ,杨光华. 中华外科病理学 [M ]. 人民卫生出版社 , 11732
1174.
(收稿日期 : 2007201225)
均匀设计法优选盐酸小檗碱脂质体的处方
(1. 江门市中心医院 ,广东 江门 529070; 2. 广州市花城制药厂 ,广东 广州 510555; 3. 江门市人民医院 ,广东 江门 529000)
[摘 要 ] 目的 :对盐酸小檗碱脂质体的处方进行优化 。方法 :采用薄膜蒸发 —主动载药法制备盐酸小檗碱脂质 体 ,按均匀设计法 ,以包封率和载药量为考察指标 ,对实验结果进行最优子集法的二次回归优选处方配比 。结果 :采用 优化处方制备的脂质体 ,平均包封率为 79. 33% ,载药量 30. 21,粒径范围为 2. 2μm ～3. 8μm。结论 :用均匀设计法优 化后的处方制得的盐酸小檗碱脂质体 ,包封率和载药量都较高 。
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实用医技杂志 2007年 4月第 14卷第 11期 (旬刊 ) JPMT, Ap ril. 2007, Vol. 14, No. 11 ( Issued Every Ten Days)
卵磷脂膜后 ,加入枸橼酸缓冲液 (pH = 3. 64) ,水化 ,得空白脂 质体 ;将所得空白脂质体用 0. 8 μm 的微孔滤膜过滤后 ,加入 Bb溶液 ,并加入 NaHCO3 溶液 ( pH = 8. 32)调外水相值 ,水浴 孵化 ,得到 Bb脂质体混悬液 (1 mg /m l) 。 2. 2 包封率及载药量的测定 2. 2. 1 Bb标准曲线的制作 用 pH 7. 0磷酸缓冲液 ( PBS)配 制一定浓度的 Bb溶液及脂质体成膜材料溶液 ,经紫外分光 光度计扫描得知 Bb在 344 nm 处有最大吸收 ,而脂质体成膜 材料如 SPC、CH、VE等在该波长处几乎无吸收 ,故选择 344 nm 为 Bb含量的测定波长 。精密称取 Bb 标准品 20 mg,置 100 m l量瓶中 ,加入 PBS使完全溶解 ,并稀释至刻度 ,摇匀 。 再将该溶液用 PBS稀释成含 Bb 0. 25 mg/L、0. 5 mg/L、1. 0 mg /L、2. 0 mg/L、4. 0 mg /L、8. 0 mg/L、16. 0 mg /L 的溶液 ,以 PBS作参比 ,于 344 nm 处测定吸收光度 。结果表明 ,在 0. 25 mg /L～16. 0 mg /L的浓度范围内 , Bb的吸收度 A 与其浓度 C 呈线性关系 ,线性回归方程为 A = 6. 412 ×1022 C + 2. 540 × 1023 , r = 0. 999 2。 2. 2. 2 包封率的测定 [3 ] 取脂质体混悬液 0. 1 m l 2份 ,一份 直接加入 95%乙醇 6 m l溶解 ,用 PBS稀释至刻度 ,摇匀 ;另一 份加于阳离子交换树脂顶端吸附 ,然后用 PBS洗脱 ,收集滴 出液于 10 m l的量瓶中 ,加入 95%乙醇 6 m l溶解脂质体 ,用 PBS稀释至刻度 ,摇匀 ;分别于 344 nm 处测定吸收光度值 A。 包封率 E% = (A1 /A2 ) ×100% (其中 A1、A2分别为过阳离子 柱和未过阳离子柱样品的 A值 ) 。 2. 2. 3 载药量的测定 [4 ] 载药量 LP = (M1 - M2 ) /M3 ×100 (其中 M1 为脂质体中盐酸小檗碱的总含量 ; M2 为游离药物 含量 ,通过 C2 - C1 求出 ; M3 为卵磷脂的用量 ) 。 2. 3 脂质体的形态和粒径分布 将样品涂在有支持膜的铜 网上 ,用磷钨酸进行负染 ,自然凉干 ,用透射电镜观察脂质体 的形态和粒径分布 。
1. 1 仪器 RE - 52A 型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器 厂 ) ; UV - 2401型紫外分光光度计 (日本岛津 ) ; JEM - 2000 Ex型透射电子显微镜 (日本 ) ; DZF - 6050型真空干燥箱 (上 海精宏实验设备有限公司 ) ; GB 204梅特勒电子天平 (瑞士 ) 。 1. 2 试药 盐酸小檗碱 (简称 Bb,四川什邡华安药物原料有 限公司 ) ;卵磷脂 ( SPC,华东师范大学化工厂 ) ;胆固醇 ( CH , 中国医药上海化学试剂公司 ,分析纯 ) ;维生素 E (VE,浙江医 药股份有限公司新昌制药厂 ) ; 阳离子交换树脂 (上海树脂 厂 ) ;其它试剂为分析纯 。 2 方法 2. 1 Bb脂质体的制备工艺 [3 ] 采用薄膜蒸发 - 主动载药法 制备盐酸小檗碱脂质体 ,按一定比例定量称取 SPC、CH、VE 溶于适Байду номын сангаас无水乙醇 ,于 60 ℃水浴中加热溶解 ,减压蒸发 ;制备
[关键词 ] 盐酸小檗碱 ;脂质体 ;均匀设计法 ;处方优化 [中图分类号 ] R914 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 167125098( 2007) 1121385202
Applica tion of Un iform D esign for Prepara tion of Berber ine Hydrochlor ide L iposom es TAN L i2rong1 , L I Guo2qiang2 , CHEN Jun2wei1 , SU W ei1 , RONG Kai2wen3
( 1. The Cen tra l Hospita l of J iangm en, J iangm en, Guangdong 529070, Ch ina; 2. Huacheng Pha rm acy of Guangzhou, Guangzhou, Guangdong 510555, Ch ina; 3. The People’s Hospita l of J iangm en, J iangm en, Guangdong 529000, Ch ina) Abstract:O b je c tive To op tim ize the formulation in the p reparation of berberine hydrochloride liposomes. M e tho d s U sing thin film evaporation and active loading method to p repared berberine hydrochloride L iposomes according to the uniform de2 sign, a op timum formulation was established by detem ining the encap sulation efficiency and ratio of loading drug. R e su lts The average encap sulation efficiency and ratio of loading drug of the op tim ized liposomes were 79. 33% and 30. 21 , their size range was 2. 2μm～3. 8μm. Co nc lu s io n The app lication of the uniform design is useful to achieve a large encap sulation efficiency and ratio of loading drug. Key words:Berberine hydrochloride; L iposomes; Uniform design; Op timum p reparation
ture[ J ]. Cancer, 1981, 47: 5772582. [ 2 ] Heidenreich A , Engelmann U H, V ietsch H V , et a l. O rgan p reser2
ving surgery in testicular ep idermoid cysts[ J ]. J U rol, 1995, 153:
实用医技杂志 2007年 4月第 14卷第 11期 (旬刊 ) JPMT, Ap ril. 2007, Vol. 14, No. 11 ( Issued Every Ten Days)
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病理检查 , Heidenreich等 [2 ]采用冷冻切片活检睾丸表皮样囊 肿 18例 ,无一例误诊 。鉴别诊断主要为单胚层的畸胎瘤 ,但 组织学上囊壁由被覆鳞状上皮的纤维组织构成 ,不含皮肤附 属器 ,这是与皮样囊肿 /畸胎瘤的重要区别 。在 WHO 的睾丸 肿瘤分类中明确指出 :在连续切片的囊壁中如无皮肤附属器 成分的表皮样囊肿不应列入畸胎瘤范畴 。与精原细胞瘤的鉴
别在于大体所见及组织学表现 ,有报道睾丸组织内有无瘢痕 组织也有 助 于 鉴 别 , 因 瘢 痕 组 织 可 能 代 表 了 , 自 动 消 失 的 ( burnt2out)精原细胞瘤 ,故 B 超或冷冻切片活检应对肿瘤周 围组织进行检查 。此肿物为良性病变 ,可以行单纯肿物完整 切除 ,由于表皮样囊肿被公认为是良性病变 ,且保存患侧睾丸 对于年轻男性的生理需要及心理健康极具意义 ,近年来越来 越多的人主张行保存睾丸的手术 [4 ] 。 Shah 等 [1 ]总结了 141 例病例 ,仅 24例 (17. 0% )采用局部切除或肿瘤剜除术 ,术后 随访 1 a未见复发或转移 。
1147 21150. [ 3 ] Shenoy V , Triest W E, el2Bash O. B ilateral ep idermoid cyst of the
testis: report of a case with p reservation of 1 testis[ J ]. J U rol, 1995,
参考文献 : [ 1 ] Shah K H,Maxted W C, Chun B. Ep idermoid cyst of the testis: a re2
port of three cases and a analysis of 141 cases from the world litera2
2. 4 均匀设计法优选处方 根据预实验结果确定 3个考察 因素 :制备 Bb脂质体 SPC、CH和 Bb的用量 。用均匀设计 3. 0版软件筛选出 U 8 (83 )配方均匀设计表安排 8次实验 ,见表 1。
153: 193321934. [ 4 ] Fu Y T,W ang H H, Yang T H, et a l. Ep idermoid cyst of the testis:
diagnosis by ultrosonography and magnetic resonance imaging resul2
盐酸小檗碱 (黄连素 )是从毛茛科植物根茎中提取的一 种异喹啉生物碱 ,临床主要用于清热解毒 、治疗肠道感染 ,近 年发现还有治疗心律失常 、高血压 、高脂血症 、糖尿病和抗肿 瘤等作用 。研究发现 ,盐酸小檗碱对人类肝癌细胞 、艾氏腹水 瘤 、结肠癌细胞 、食道癌细胞系 、鼻咽癌细胞 、膀胱癌细胞 、恶 性畸胎瘤细胞 、大鼠 9 L 脑肿瘤细胞等都具有一定的抑制和 杀灭作用 [1 ] 。黄林清 [2 ]等在进行抗肿瘤的实验中发现 ,盐酸 小檗碱体内抑瘤作用没有体外作用明显 ,可能与其肠道吸收 差 ,在体内很难达到对肿瘤细胞有效的血药浓度有关 。脂质 体是一种新的给药系统 ,能增加药物局部浓度 ,提高药物疗 效 ,减少药物的不良反应 。本文通过均匀设计法对盐酸小檗 碱脂质体的制备处方进行了优化 。 1 仪器和试药
ting in organ2p reserving surgery[ J ]. B r J U rol, 1996, 78: 1162118. [ 5 ] 武忠弼 ,杨光华. 中华外科病理学 [M ]. 人民卫生出版社 , 11732
1174.
(收稿日期 : 2007201225)
均匀设计法优选盐酸小檗碱脂质体的处方