晚期糖基化终末产物致软骨细胞炎性反应的潜在机制

晚期糖基化终末产物致软骨细胞炎性反应的潜在机制
赵峻;马翅;杨娜娜;唐欣;刘唐浩;谭扬帆;彭秀娟;陈铖
【摘要】背景:前期研究表明,晚期糖基化终末产物与兔软骨细胞共同孵育后,肿瘤
坏死因子α和基质金属蛋白酶13等炎性因子与基质降解因子表达明显增多.然而,
晚期糖基化终末产物致软骨细胞损伤的机制远未阐明.目的:观察晚期糖基化终末产
物对人关节软骨细胞炎性因子与基质降解因子表达及核因子KB活化水平的影响,
初步探讨晚期糖基化终末产物诱软骨细胞损伤的潜在机制.方法:运用机械分离与两
步酶顺序消化法分离培养人软骨细胞,并用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色以及细胞免
疫荧光对人软骨细胞进行鉴定.采用不同质量浓度晚期糖基化终末产物
(1,10,25,50,100 mg/L)干预人软骨细胞;并以正常人软骨细胞及BSA干预为对
照,24 h后采用Real-time PCR及Western blot检测肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1三者的mRNA及蛋白表达水平,采用Western blot检
测人软骨细胞胞浆中IKBα及胞核中核因子κB p65的含量.结果与结论:①与对照
组比较,晚期糖基化终末产物可浓度依赖性地诱导人关节软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α、白细胞介素1β表达增多,且以100 mg/L组作用最明显;②晚期糖基化终末产物处理组中软骨细胞胞浆中IKBα含量明显减少、而胞核中核因子κB p65的含量明显增多;③结果说明,晚期糖基化终末产物诱导白
细胞介素1、基质金属蛋白酶13和肿瘤坏死因子α表达增多,其机制可能与核因
子KB信号通路有关.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2018(022)024
【总页数】6页(P3786-3791)
【关键词】晚期糖基化终末产物;组织构建;软骨细胞;骨关节炎;核因子κB
【作者】赵峻;马翅;杨娜娜;唐欣;刘唐浩;谭扬帆;彭秀娟;陈铖
【作者单位】湘西自治州人民医院/吉首大学第一附属医院,湖南省吉首市 416000;湘西自治州人民医院/吉首大学第一附属医院,湖南省吉首市 416000;湖南师范大学医学院,湖南省长沙市 410006;湘西自治州人民医院/吉首大学第一附属医院,湖南省吉首市 416000;湘西自治州人民医院/吉首大学第一附属医院,湖南省吉首市416000;湘西自治州人民医院/吉首大学第一附属医院,湖南省吉首市 416000;湘西自治州人民医院/吉首大学第一附属医院,湖南省吉首市 416000;湖南师范大学第二附属医院/解放军一六三医院,湖南省长沙市410003
【正文语种】中文
【中图分类】R318
文章快速阅读：
文题释义：
晚期糖基化终末产物：是过量的糖和蛋白质结合的产物，在体内有两个来源，一是过量的糖和蛋白质在体内合成晚期糖基化终末产物，二是通过进食将食物中存在的晚期糖基化终末产物摄入体内。

晚期糖基化终末产物能够和身体的组织细胞相组合并破坏它们。

目前的研究证明，晚期糖基化终末产物会加速人体的衰老和导致很多慢性退化型疾病的发生。

核因子κB：核因子κB体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。

在多数细胞浆内核因子κB与抑制蛋白
结合形成无活性复合物，当信息物质作用于相应受体后，磷酸化抑制蛋白使核因子κB脱落而活化，核因子κB进入胞核影响基因转录。

0 引言 Introduction
骨关节炎是常见的关节退行性疾病，以关节软骨进行性退变和破坏为特征，其主要临床症状为关节疼痛、畸形和功能障碍。

骨关节炎的发病机制复杂，与年龄、性别、体质量指数、代谢、创伤、遗传、发育等因素有关[1-2]。

研究表明，骨关节炎的
患病率随着年龄的增加而增加，且年龄被公认为是骨关节炎最突出的始动和进展的危险因素之一[3-9]，然而其潜在的具体机制仍不清楚。

随着年龄的增加，大量晚期糖基化终末产物的产生和堆积是体内最显著的改变之一，且研究认为晚期糖基化终末产物是骨关节炎年龄致病因素的分子学基础[10-12]。

炎性因子与基质降解因子在骨关节炎的病理生理过程中起着重要作用[13]，作者前期的研究结果已表明，晚期糖基化终末产物与兔软骨细胞共同孵育后，肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶13等炎性因子与基质降解因子的表达明显增多[3]。

然而，晚期糖基化终末产物致软骨细胞损伤的机制远未阐明。

大量研究表明核因子κB是骨关节炎发生发展过程中的关键环节之一[3-4，14]。

活化核因子κB可以诱导软骨细胞炎症因子(白细胞介素1﹑肿瘤坏死因子α等)表
达释放而引发炎症反应，以及促进基质金属蛋白酶表达升高，这些炎症因子及酶类又可以进一步活化核因子κB，从而形成恶性循环破坏关节软骨。

因此，文章主要
探讨晚期糖基化终末产物对人关节软骨细胞炎性因子与基质降解因子表达及核因子κB活化水平的影响，初步探讨晚期糖基化终末产物诱软骨细胞损伤的潜在机制，
以期为骨关节炎的防治提供一定的理论基础。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2016年1月在湖南师范大学第二附属医院
中心实验室完成。

1.3 材料
实验用主要试剂：胰蛋白酶(Hycolone公司，美国)；低糖DMEM培养基(Gibco
公司，美国)；胎牛血清(FBS)(Biological Industries公司，以色列)；牛血清白蛋
白(BSA)(北京鼎国公司，中国)；Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，美国)；白细胞介素1α一抗(Abcam公司，美国)；肿瘤坏死因子α一抗(CST公司，美国)；基质金属蛋白酶13一抗(Santa Cruz公司，美国)；白细
胞介素1β一抗(CST公司，美国)；PPARγ一抗(CST公司，美国)；核因子κB一
抗(CST公司，美国)；IKBα一抗(CST公司，美国)；胞浆-核蛋白抽提试剂盒(唯奥基因公司，中国)；2×QuantiFast SYBR Green Mix(Qiagen公司，德国)；晚期
糖基化终末产物(AGEs，Biovision公司，美国)。

1.4 实验方法
1.4.1 人软骨细胞体外分离培养与鉴定无菌条件下，取因严重创伤导致截肢，且无关节炎、糖尿病等相关疾病患者的股骨髁或胫骨平台正常软骨组织(n=3)，年龄(31.2±
2.91)岁，患者对治疗均知情同意，并且自愿捐献截肢的肢体。

新鲜软骨呈乳白浅蓝色、半透明状，略具弹性。

反复清洗除去软骨表面的血液以及可能误带的滑膜、骨组织。

在盛有低糖DMEM培养基的无菌培养皿中将软骨充分剪成小于1 mm×1 mm×1 mm的组织块。

将软骨碎块移入50 mL离心管中，室温离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清液。

加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶，放
入恒温摇箱中，37 ℃条件下摇荡消化30-40 min，轻轻吹打弃去上清液。

用PBS 冲洗3次后，再加入5倍体积的2 g/LⅡ型胶原酶，放入恒温箱中，置于37 ℃水浴中轻微振荡消化3.0-4.0 h。

倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，室温
离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清液。

200目细胞筛过滤后，加入完全培养基(90 mL低糖DMEM培养基+10 mL体积分数10%的FBS+0.1 mL双抗)。

计数后，
将细胞以1×108/瓶接种于25 cm2培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO2浓度的饱和湿度培养箱内进行原代培养。

采用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及细胞免疫荧光对细胞进行鉴定，实验过程中仅采用1-4代的细胞进行实验。

1.4.2 不同晚期糖基化终末产物质量浓度对人软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属
蛋白酶13、白细胞介素1表达及核因子κB活性的影响设置不同质量浓度晚期糖
基化终末产物处理人软骨细胞(2×105软骨细胞，接种于上述完全培养基中)，具
体分组如下：①正常对照组；②BSA对照；③1 mg/L 晚期糖基化终末产物组(1 mg/L组)；④10 mg/L晚期糖基化终末产物组(10 mg/L组)；⑤25 mg/L晚期糖
基化终末产物组(25 mg/L组)；⑥50 mg/L晚期糖基化终末产物组(50 mg/L组)；
⑦100 mg/L晚期糖基化终末产物组(100 mg/L组)。

24 h后提取各组细胞总蛋白，并采用Western blot法检测肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13与白细胞介素1、胞浆IKBα蛋白水平与细胞核核因子κB p65蛋白水平。

采用TRIzol法提取RNA后采用Real-time PCR检测肿瘤坏死因子α、基质金属
蛋白酶13、白细胞介素1三者的mRNA水平。

所有引物均由上海生工生物工程
公司设计合成，引物序列见表1。

1.5 主要观察指标①晚期糖基化终末产物对人软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1表达的影响；②晚期糖基化终末产物对人软骨细胞核因
子κB活化水平的影响。

1.6 统计学分析所有数据均代表3次独立重复实验结果，以±s表示，数据分析采用软件SPSS 13.0进行。

当数据满足正态分布及方差齐性时，组间差异比较采用
单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验法。

否则采用Mann-Whitney
U检验，两两比较采用Kruskal-wallis H检验。

上述数据分析中，均设定双侧P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 人软骨细胞培养及鉴定结果Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可见获得细胞胞质中
含有大量棕黄色沉积物，着色较深，说明Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性(图
1A)，提示获得的细胞具有人软骨细胞表型。

为进一步验证上述结果，采用细胞免疫荧光化学方法进一步对细胞进行鉴定，荧光显微镜下Ⅱ型胶原被染为绿色(图
1B)，进一步提示所获得的细胞具有软骨细胞表型。

2.2 晚期糖基化终末产物对人软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白
细胞介素1表达的影响随着晚期糖基化终末产物质量浓度增高，肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α、白细胞介素1β mRNA表达水平逐渐增多(图2)。

在100 mg/L 晚期糖基化终末产物处理组中，白细胞介素1α mRNA表达水平是正常对照组的4.22倍，软骨细胞白细胞介素1β mRNA表达水平是正常对照组的9.39倍，基质金属蛋白酶13 mRNA表达水平是正常对照组的8.71倍，
肿瘤坏死因子α mRNA表达水平是正常对照组的6.13倍，差异有显著性意义(P
< 0.05)。

运用Western blot检测肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α、白细胞介素1β蛋白表达水平，结果发现与对照组比较，晚期糖基化终末产物可诱导人关节软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α、白细胞介素1α表达增多(P < 0.05)，且以100 mg/L 晚期糖基化终末产物组作用最明显(图3)。

2.3 晚期糖基化终末产物对人软骨细胞核因子κB活化水平的影响与对照组比较，晚期糖基化终末产物能诱导促进软骨细胞核核因子κB p65水平升高，且细胞核核因子κB p65水平随着晚期糖基化终末产物质量浓度的升高而升高(P < 0.05)，见
图4。

然而，晚期糖基化终末产物处理组软骨细胞胞浆中IKBα水平明显低于正常对照组(P < 0.05)，且其含量与晚期糖基化终末产物质量浓度呈负相关(见图5)。

3 讨论 Discussion
随着研究的深入，目前人们对骨关节炎的发病机制已有了一定的认识，认为骨关节炎是在机械性和生物性因素共同作用下，关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的降解与合成的生理平衡失调的结果，其病理生理过程主要表现为关节软骨的分解代谢明显大于合成代谢。

关节发生骨关节炎时，各种基质金属蛋白酶和炎性因子表达和含量增高，使得软骨间质的分解增加，而软骨间质分子的降解产物自身又可促进进一步地降解，从而形成持续性的恶性循环。

基质金属蛋白酶中基质金属蛋白酶
13是裂解Ⅱ型胶原作用最强的酶，在骨关节炎的发生发展过程中起着重要的作用。

另外在骨关节炎病变的过程中，病变局部分泌一些细胞因子对关节软骨和滑膜具有明显的破坏作用。

在已知的因子中，肿瘤坏死因子α，白细胞介素1是参与骨关
节炎病理过程的主要炎症递质，其中肿瘤坏死因子α是骨关节炎的发病过程中最
早出现的细胞因子。

因此肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和基质金属蛋白酶13可以作为评判骨关节炎发病及其程度的实验观测指标，也因而成为本课题研究的主要观察对象。

表1 肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1及β-actin的Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR基因Forward primer sequences (5’→3’) Reverse primer sequences (5’→3’)基质金属蛋白酶13 GGA AAC CAG GTC TGG AGA TAT GA TGG AAT TTG CTG GCA TGA CG肿瘤坏死因子α GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC C CTG ATG GTG TGG GTG AGG AG白细胞介素1α CAA CCA GTG CTG CTG AAG GA AGC ACA CCC AGT AGT CTT GC白细胞介素1β AGG ATA TGG AGC AAC AAG TGG T AAC ACG CAG GAC AGG TAC AG β-actin TCA TGA AGT GTG ACG TGG ACA TC CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT
图1 人软骨细胞鉴定结果(x100)Figure 1 Identification of human
chondrocytes (x100)图注：图A为人软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果；B为人软骨细胞免疫荧光化学结果。

图2 晚期糖基化终末产物对人软骨细胞白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和基质金
属蛋白酶13 mRNA表达的影响Figure 2 Effects of advanced glycation end products on the mRNA expression levels of interleukin-1, tumor necrosis factor-α and matrix metal loproteinase 13 in chondrocytes图注：c为正常对照组，与正常对照组比较，aP < 0.05。

图3 晚期糖基化终末产物对人软骨细胞白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和基质金
属蛋白酶13蛋白表达的影响Figure 3 Effects of advanced glycation end products on the protein expression levels of interleukin-1, tumor necrosis factor-α and matrix metallo proteinase 13 in chondrocytes图注：c为正常对照组，与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物可诱导人关节软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α、白细胞介素1β表达增多(P < 0.05)，且以100 mg/L晚期糖基化终末产物组作用最明显。

图4 Western blot检测晚期糖基化终末产物对人软骨细胞胞核核因子κB p65表
达的影响Figure 4 Effect of advanced glycation end products on the expression level of nuclear factor-kB(p65) in nucleus detected by western blot assay图注：上图为条带灰度分析；下图为核因子κB p65蛋白表达。

c为正常对照组，与正常对照组比较，aP < 0.05。

图5 Western blot检测晚期糖基化终末产物对人软骨细胞胞浆IKBα表达的影响Figure 5 Effect of advanced glycation end products on the expression level of nuclear factor-kB inhibitor α in cytoplasm detected by western blot assay图注：上图为条带灰度分析；下图为IKBα蛋白表达。

c为正常对照组，与
正常对照组比较，aP < 0.05。

骨关节炎发病机制复杂，年龄、体质量指数、性别、创伤、代谢、遗传和发育等都是骨关节炎致病因素。

随着骨关节炎基础和临床研究的不断深入，年龄这一骨关节炎致病因素被认为是骨关节炎发生发展的关键原因之一，然而其潜在的具体致病机制仍不清楚。

有研究表明体内晚期糖基化终末产物水平与年龄呈正相关，提示晚期糖基化终末产物可能是年龄这一危险因素的潜在分子机制。

晚期糖基化终末产物在正常机体内合成缓慢，但在应激、高血糖、老化、炎症等状态下，晚期糖基化终末产物形成明显增多。

晚期糖基化终末产物体内具体形成过程如下：①蛋白质、脂肪及核酸等大分子的氨基与还原糖(包括果糖、葡萄糖等)分子中的醛基发生亲核加成反应，形成可逆的Schiff碱，其反应主要取决于还原糖浓度，如血糖浓度下降时，Schiff碱数量将明显减少；②Schiff碱发生Amadori重排反应，形成相对稳定的醛胺类产物。

Schiff碱与相对稳定的醛胺类产物统称为早期糖基化产物；③Amadori产物再经过脱水、重排后，形成的羰基化合物能同蛋白质的自由氨基反应最终导致晚期糖基化终末产物形成。

晚期糖基化终末产物及其蛋白加成产物非常稳定，其降解主要依赖于所结合蛋白质的降解，如糖化血红蛋白，因而晚期糖基化终末产物通常在自我更新较慢的组织或器官中堆积。

与糖化血红蛋白不同，软骨组织中胶原蛋白半衰期长达数百年，因此软骨组织中容易发生晚期糖基化终末产物聚集与堆积，且随着年龄增长其含量逐渐增高。

研究报道，80岁老年人关节软骨组织中晚期糖基化终末产物含量高达(56.6±28.7) nmol/L，是20岁关节软骨组织的5倍[10，15]。

基于上述研究，作者设置了不同晚期糖基化终末产物浓度，以期模拟随着年龄增长体内晚期糖基化终末产物逐渐升高对正常人软骨细胞的影响。

同时，与其他研究仅使用晚期糖基化终末产物化合物中某一种单一物质不同，作者购买的晚期糖基化终末产物混合物包含了CML、petosidine以及其他类型晚期糖基化终末产物化合物，更能反映生理状
态下晚期糖基化终末产物对软骨细胞的影响。

现有研究表明，晚期糖基化终末产物是许多慢性疾病病理生理过程中重要的致病分子，如阿尔茨海默病、慢性胰腺炎、糖尿病及其并发症、系统性红狼疮等退行性或炎症性疾病[3，16-18]。

晚期糖基化终末产物致病机制主要通过以下两条途径：①晚期糖基化终末产物直接沉积于组织中或与组织中蛋白发生交联，从而使该蛋白的生物学功能发生改变；②晚期糖基化终末产物与其特异性受体(Receptor of advanced glycation end products，RAGE)结合后能够激活核因子κB通路，导致炎性反应增加[3-4，14]。

在关节软骨中，晚期糖基化终末产物在关节软骨中形成和沉积后，可加速其老化与功能衰退，这一过程可能与抗衰老酶以及促进细胞凋亡有关。

其次，晚期糖基化终末产物可与关节软骨中胶原蛋白等大分子发生交联，使其脆性增加、抗剪切力以及抗压力减弱，导致关节软骨对机械应力损伤更敏感，这也正是非负重关节或体质量指数在正常范围也会发生骨关节炎的原因之一。

虽然晚期糖基化终末产物合成抑制剂与交联抑制剂能减少晚期糖基化终末产物的生成和抑制已生成的晚期糖基化终末产物与蛋白质的进一步交联，具有防止晚期糖基化终末产物直接损伤作用，但两者均不能分解已生成的晚期糖基化终末产物，对晚期糖基化终末产物受体介导的间接作用无效[19-20]。

因此阐明晚期糖基化终末产物致骨关节炎病变的细胞内机制，
寻找关键有效地药物对于骨关节炎的防治具有重要的意义。

有研究报道，晚期糖基化终末产物与软骨细胞膜上RAGE结合后，可活化一系列细胞内信号传导通路导
致白细胞介素1、肿瘤坏死因子α﹑基质金属蛋白酶13表达增加，这是晚期糖基
化终末产物导致骨关节炎病变的主要途径[3-4，12，14]。

作者的研究以人软骨细胞为受试对象，分别用不同质量浓度晚期糖基化终末产物(1，10，25，50，100 mg/L)干预人软骨细胞24 h后发现，晚期糖基化终末产物处
理组软骨细胞中肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1α、白细胞介
素1β表达显著高于正常对照和BSA对照组，且上述反应随着晚期糖基化终末产
物质量浓度增高而增高，以100 mg/L 晚期糖基化终末产物组反应最为明显，这
与前期文献报道一致。

大量研究表明核因子κB是骨关节炎发生发展过程中的关键环节之一[3-4，14]。

核因子κB家庭由p50/p105、Rel、p65(也称RelA)、RelB和p52组成，这些蛋白质二聚化后形成功能性核因子κB，其中以p50-p65二聚体最常见。

在胞质内
核因子κB p65与IKB结合后呈失活状态，多种刺激物可引起胞质中核因子κB
p65与IKB的解离，激活核因子κB通路诱导各种“损伤反应基因”的表达。

值得注意的是，激活的核因子κB可以诱导炎症因子(白细胞介素1﹑肿瘤坏死因子α等)表达释放而引发炎症反应，以及促进基质金属蛋白酶表达升高，这些炎症因子
及酶类又可以进一步活化核因子κB，从而形成恶性循环破坏关节软骨。

因此，作
者选择检测胞核IKBα含量和胞核核因子κB p65反应核因子κB的活化水平。

研
究结果发现，晚期糖基化终末产物处理组软骨细胞胞质中IKBα含量减少、胞核中核因子κB p65含量增多，且随着晚期糖基化终末产物浓度的增高上述作用越明显，提示晚期糖基化终末产物是通过增强核因子κB活化水平诱导软骨细胞肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13、白细胞介素1表达增多。

总的来说，晚期糖基化终末产物参与了骨关节炎的发生发展，可诱导软骨细胞炎性因子与基质降解因子表达增多，其机制可能与核因子κB有关。

因此，通过抑制核因子κB活性有可能成为防治骨关节炎的新途径。

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