菌种的管理和保藏

4～6℃
芽孢菌3～6个月，其他 细菌约1个月
酵母菌 霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂 斜面培养基
4～6℃
一般3～6个月
真菌 PDA琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基
4～6℃
一般3～6个月
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液体冷冻保藏法
菌种
保存液（2mL）
保存温度 保存时间
金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌
大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌
铜绿假单孢杆菌 生孢梭菌
白色念珠菌 黑曲霉
营养肉汤
1%蛋白胨 甘油水
胆盐乳糖增菌液
疱肉培养基
改良马丁培养 基
10%～40% 甘油
-30～ -80℃
半年以上 或数十年
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液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨1.5ml 加入甘油0.15ml ,接种新鲜培养物,培养. 保存条件 -80℃可保存数年.
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4 、菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌 悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬 液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜 孢子悬液使用。
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菌种的保藏和管理
杜平华
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菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技 术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结 果的正确性。
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菌种的来源
国内或国外认可的菌种收藏机构的 标准菌株，或使用与标准菌株所 有相关特性等效的商业派生菌株。
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3 、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基 中，培养5～7天。 加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化 钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至 无菌试管内，用含0.05％（（v/v）聚山梨酯80的0.9%无 菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
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菌液的制备和使用
斜面培养物 ↓
稀释（比浊或预实验） ↓
菌液稀释 ↓
平板计数 ↓
验证实验、阳性对照
平板计数也可和试验同时进行
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三、菌种的检查与复壮
菌种的衰退 菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用 而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
控制菌种的衰退方法 控制传代次数 创造适宜的培养条件 采用有效的保藏方法
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菌种的传代和使用
• 冻干菌种（0代）
↓
• 增菌液培养（1代）
•
↓
• 增菌液培养（2代） → 分装冷冻保存
•
↓
• 增菌液培养
• 适宜的斜面培养基 → 使用
• 工作菌株（3代）
•
↓
• 工作菌株传代（4代） → 冷冻保存
•
↓
• 工作菌株传代（5代） → 冷冻保存
• 如使用蛋白胨、甘油水，可取各代的斜面培养物，加入培养基中，在规 定条件培养后冷冻保存。
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瓷珠菌种保存
使用方法 -用接种环挑取18-24小时新鲜培养物接入冻存液中 -拧紧瓶盖，来回颠倒制成均匀的菌悬液 -使菌悬液充分吸附在小瓷珠内外表面 -将冻存管中的菌悬液吸出 -使用时充分摇匀使管内瓷珠分散,取出小瓷珠，可以直接在平板 培养基上划线接种或接种液体培养基,培养。 保存条件 室温保存12个月、-20℃保存12个月、-80℃可保存24个月
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菌种的检查与复壮
定期检查 定期检查 复活、分离、纯化、检查鉴定和再保藏。发现变异 或衰退，应及时给予恢复。 主要检查项目 菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检 查。
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菌种的检查与复壮
菌种的复壮 主要采用分离纯化的方法。经过形态特征、生理生化特 征、代谢产物、血清学等一系列实验鉴定，证明复壮 后的菌种与原种完全一致，方可认为菌种已被复壮。
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菌种的保藏
抑制微生物的代谢和生长繁殖， 如低温、干燥和真空等 标准储备菌株经纯度和特性确认后，分装于小瓶中, 可采用低温冷冻干燥，液氮储存，超低温冷冻(低 于-70℃)等方法保存。
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菌种的保藏
低于-70℃或低温冷冻干燥可以延长菌种的保存时间. 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作 菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻 或再次使用。
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菌种的保藏
方法
主要原理
适用的微生物
保藏时间
特点
液氮超低温保藏法
超低温
广泛
数十年
复杂、需要专门设备，有效
冷冻真空干燥保藏法
干燥、缺氧、低温
广泛
5～10年以上 复杂、需要专门设备和方法，有效
干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、无营养
产孢微生物
1～10年
较简便，需制备沙土管，有效
液体石蜡保藏法
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常用培养基种类
斜面培养基 半固体斜面培养基 液体斜面培养基 平板斜面培养基
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接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等
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分离：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成 单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的 操技术。 分离一般采用平板培养基。 分离方法主要有分段划线法、连续划线法、 涂布分离法、倾注分离法等。
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二、菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代从菌种 保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造 成菌种变异。
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细菌的接种、分离和培养
接种：将微生物的培养物、含有 微生物或可能污染有微生物的样 品接种到培养基上的一种操作技 术。
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菌种保藏的中心任务
- 广泛收集各种有用的微生物菌种。 -选择最适宜的保藏方法。
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常用菌种保藏方法
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性 降低微生物细胞的代谢强度。
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菌种的保藏
标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明 或按验证的方法进行。 标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构获得的标准菌株 经复活并在适宜的培养基中生长后,既为标准储备菌株。
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详细记录
菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴定等均应 做好详细记录。包括菌保存位置、环境(温度)、种传代或使 用时间、名称、菌号、代数、传代或保存形式、分离、复壮 方式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。
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菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证 明和登记，并包装严密。 菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细 记录。
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菌种的管理
菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥 发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。 由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的 菌种进行检查，一般每年1～2次，（或定期更换冻干菌种）。 发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现 象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。
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培养
接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，培养基放 在适宜微生物生长的环境中温度、湿度、氧气等），使其生长 繁殖的过程。 需气菌培养法 厌氧培养法
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培养后微生物的生长判断
固体培养基 有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。 液体培养基 浑浊、菌膜、沉淀等。
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四、菌种的管理
使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知 识和技术水平，并应具有较强的责任心。
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菌种的管理
实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度； 包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进 出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的 申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传 代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置 和条件及其它需要的程序。
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菌种的保藏
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍 生物仅可用作工作菌株。
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菌种的保藏
不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的 保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：
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菌种的保藏
⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽 孢死亡代谢作用弱，同时对恶劣环境 有很强的抵抗力。 ⑶选择最适宜的方法。 ⑷定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保 藏方法的有效性。
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菌悬液的制备与保存
采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限度试验 用菌悬液的制备如下： 1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时. 2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼 脂培养基中，培养24～48小时。 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～ 100cfu的菌悬液。
低温、缺氧
广泛
1年以上
简便
琼脂斜面低温保藏法
低温 4℃
广泛
短时间
简便
液体冷 冻保藏 法
液体培养基 一定比例甘油
瓷珠冷冻保藏法
低温 低温、缺氧 低温
广泛 广泛 广泛
半年以上 数十年以上
1年以上
简便 简便 简便
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琼脂斜面低温保藏法
菌种
培养基
保存温度
传接时间
细菌 一般为营养琼脂斜面培养基，或根据 菌种规定选用培养基