转化生长因子-1对角膜移植术后外周淋巴细胞亚群的影

转化生长因子-β1对角膜移植术后外周淋巴细胞亚群的影响
冯广忠,崔　浩,张旭辉
(哈尔滨医科大学第一临床医学院眼科,黑龙江哈尔滨150001)
摘要:目的　研究TG F -β1对全层角膜移植术后外周淋巴细胞亚群C D 4,C D 8活化的影响,来阐明TG F -β1的免疫抑制作用机制,为治疗角膜移植排异反应提供理论依据。

方法　
采用C D 4,C D 8免疫荧光标记及流式细胞仪检测技术,对同种异体大鼠角膜移植术后不同时期外周血中C D +4、C D +8的表达进行分析。

结果　TG F -β1组角膜移植术后7、
14、28d C D +4活化率明显低于阳性对照组、自体对照组及地塞米松组。

结论　角膜移植术后应用外源性TG F -β1治疗,可抑制特异性抗原介导的,以及非特异性炎症介导的移植排异反应。

关键词:眼科学;转化生长因子-β1;角膜移植;C D +4;C D +
8学科分类代码:320137 中图分类号:R779165;R97915 文献标识码:A 文章编号:1004-5775(2003)03-0188-02
作者简介:冯广忠(1971-),男,汉族,主治医师,硕士研究生。

角膜病是致盲的主要眼病之一,角膜移植是治疗角膜盲的复明手术。

虽然角膜移植手术具有较高的成功率,但在血管化移植床进行角膜移植或2次角膜移植,其发生率却高达
50%以上〔1〕。

因此,免疫排异反应仍是角膜移植手术失败的主要原因〔2〕。

免疫抑制剂的应用,虽然大大提高了角膜移植
的成功率,但是仍有部分病例排异反应不能逆转,特别是在高
危角膜移植中,免疫抑制剂效果较差〔3〕。

近年来的研究显示,
一些细胞因子在免疫应答的负性调控中发挥着重要作用,其
中转化生长因子-β(TG F -β
)备受关注。

TG F -β是一类具有多种生物活性的细胞因子,体外实验已证明:它作为一种自动分泌的负性信号,具有抑制多种白细胞介素(I L )和其他细胞因子产生的正性信号而抑制淋巴细胞增殖功能。

1　材料与方法111　材料
11111　实验动物:健康近交系S D 大鼠为供体,健康近交系Wistar 大鼠为受体,哈医大一院实验动物中心提供。

11112　试剂:TG F -β1滴眼剂TG
F -β12μg 加入灭菌的0101m ol/L ,pH714P BS 2ml ,临用前配制。

C D +8、C D +41抗:兔抗
大鼠。

2抗:羊抗兔。

11113　器材:YGI 手术显微镜(苏州惠康医疗器械厂),流式细
胞仪及分析软件(FACS Calibur ,美国BD 公司)
112　方法
11211　手术方法:用1%的异戊巴比妥麻醉大鼠,术前充分散
瞳。

消毒术野,以直径3125mm 环钻钻取供体全层角膜;以直径3mm 环钻钻取受体全层角膜,将植片以10-0尼龙线在4个象限各缝1针,然后在每一象限加缝1针。

术毕给予015%红霉素及1%阿托品眼膏涂眼。

11212　实验动物分组及处理方法:阴性对照组:大鼠不作任
何处置;阳性对照组:做同种异体角膜移植后,不做任何处置;自体对照组:自体角膜作穿通伤模型;地塞米松组:同种异体角膜移植术后每日腹腔内注射地塞米松011mg 及局部点
011%地塞米松滴眼剂,3次/d ;TG F -β1组:同种异体角膜移植术后每日腹腔注射50ng TG F -β1及局部点TG
F -β1滴眼剂,3次/d 。

11213　流式细胞仪分析:角膜移植术后7、14、28d 尾静脉取外
周血样。

在外周血样中加细胞裂解液1ml ,5～12min ,离心,
1500r/min ,5min ,弃上清液,加2ml P BS 液。

取细胞悬液分别
装入3支试管,作标记,分别为试验管和阴性对照管;各管分别加入兔抗鼠C D 8及C D 4单克隆抗体,室温孵育20min ,加入
2ml P BS 液,洗匀,1500r/min 离心,10min ,弃上清液;各管加入FIT C 标记的羊抗兔荧光抗体,室温,避光孵育20min ,加入2ml P BS 液,洗匀,1500r/min 离心,10min ,弃上清液;加入鞘液015ml ,上机。

样本在FACS Calibur 流式细胞仪上进行检测,全
部数据采用cell quest 软件进行分析。

11214　统计学处理:所有结果以均数±标准差( x ±s )表示,
多个样本均数之间方差分析。

2　结果
211　TG F -β1组角膜移植术后7、
14、28d ,C D +4活化率明显低于阳性对照组、自体对照组及地塞米松组(P <0101);C D +4/
C D +8明显低于其它各组(P <0101)。

212　同种异体角膜移植组7、14、28d ,C D +4,C D +8活化率明显
高于其它各组(P <0101)。

213　角膜移植术后28d 地塞米松组与TG F -β1组C D +
8活化
率无明显差别(P >0105)。

表1　角膜移植术后7d C D+4,C D+8,C D+4/C D+8值对比
组别CD+4(%)CD+8(%)CD+4/CD+8阳性对照组80187±313775182±41391107±0104
自体对照组66135±116648137±11651138±0107
地塞米松组52156±118148136±11051109±0104
TG F-β1组26168±115738139±61450172±0115
阴性对照组18153±113014126±11061130±0111
表2　角膜移植术后14d C D+4,C D+8,C D+4/C D+8值对比
组别CD+4(%)CD+8(%)CD+4/CD+8阳性对照组67184±311159197±31131113±0169
自体对照组53119±311539153±31251135±0114
地塞米松组38194±112429135±11041133±0106
TG F-β1组22113±111938119±31880158±0104
阴性对照组18153±113014126±11061130±0111
表3　角膜移植术后28d C D+4,C D+8,C D+4/C D+8值对比
组别CD+4(%)CD+8(%)CD+4/CD+8阳性对照组57114±110747130±21141121±0106
自体对照组41161±112631155±01861132±0106
地塞米松组30144±119225150±21211119±0105
TG F-β1组20150±114123130±31230189±0106
阴性对照组18153±113014126±11061130±0111
3　讨论
C D4和C D8是成熟T细胞中的2大亚群,在免疫应答中起着重要作用。

C D+4T细胞的分子表型是C D+2,C D+3,C D+4, C D-8。

C D+4T细胞也不是均一的细胞群,按其功能可包括TH 和T DTH,前者为调节性T细胞,后者为效应性T细胞。

C D4T 细胞能促进B细胞、T细胞和其他免疫细胞的增殖分化,协同免疫细胞间的相互作用。

C D+8细胞:包括抑制性T细胞(TS)和杀伤性T细胞(T C),前者为调节性T细胞,后者为效应性T 细胞。

T C细胞其分子表型是C D+2,C D+3,C D-4,C D+8。

T C效应细胞与抗原病毒免疫、抗肿瘤免疫及移植排异反应有关。

TS 细胞其分子表型与T C相同,其功能是抑制免疫功能的活化期〔4〕。

角膜移植后,认为角膜移植片的存活与淋巴毒抗体及C D+4细胞升高有密切关系〔5〕。

TG F-β1与移植免疫的关系:Wallick首先报道同种异体心脏移植腹腔内每天注射重组人TG F-β1可明显延长移植物存活时间〔6〕,该现象被Waltenberger在大鼠异体心脏移植模型中得到证实〔7〕,在大鼠肝脏移植免疫过程中可观察到包括TG F-β1在内的多种细胞因子表达增强〔8〕。

TG F-β1可抑制MHC-Ⅱ类抗原表达。

TG F-β1基因缺陷型小鼠体内免疫细胞表面MHC-Ⅱ类抗原表达显著增强,并发生了多器官多灶性炎症反应和各类自身免疫性疾病,然而在TG F-β1和MHC -Ⅱ双缺陷型小鼠体内并无上述症状的出现,提示TG F-β1可下调MHC-Ⅱ类抗原的表达并由此介导各种免疫抑制作用〔9〕。

实验发现,TG F-β1可迅速下调细胞表面C-kit的表达,也可下调细胞表面I L-1、CSF及C-kit受体的表达。

TG F
-β1通过下调生长因子受体在域值水平以下以维持造血干/祖细胞处于无反应或低反应状态,从而使机体的非特异性免疫作用下降〔10〕。

在本实验中,同种异体角膜移植组C D+4, C D+8活化率明显高于其它各组,移植术后排异反应重。

TG F -β1组在C D+4水平明显低于其它外伤组,C D+4/C D+8亦低于其它组。

说明TG F-β1组有明显的免疫抑制,从而验证了TG F-β1在早期抑制角膜移植的排异反应,减少了排异反应的发生,增加角膜移植的成功率。

但是,本实验中14、28d C D+8水平与地塞米松组无明显差别,这有待于进一步扩大样本,验证此结论。

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(编辑:谢忠艳)
(收稿日期:2003-02-20)。