HPLC梯度洗脱法测定注射用头孢地嗪钠的有关物质

HPLC梯度洗脱法测定注射用头孢地嗪钠的有关物质
钟莹;周卫军;杨放;王健松;朱少璇
【摘要】目的建立测定注射用头孢地嗪钠中有关物质的高效液相色谱梯度洗脱法.方法采用HPLC梯度洗脱法,色谱柱为Phenomenex Luna,C18柱(4.6mmx250 mm,5μmn);以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾0.87g与无水磷酸氢二钠0.22g,加水溶解并稀释至1000mL)为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱;检测波长为215nm;流速为1mL/min.结果与等度洗脱法比较,梯度洗脱法具有更强的分析杂质的能力,样品中各成分的分离度及检出灵敏度均满足有关物质限度的测定要求.头孢地嗪和2-巯基-4-甲基-5-噻唑乙酸的检测限分别为0.05μg/mL和0.03μg/mL,在0.5～10μg/mL的浓度范围内,头孢地嗪和2-巯基4甲基-5-噻唑乙酸的线性均良好,r分别为0.9996和0.9995.结论该方法反映药品质量,有助于发现产品中的质量问题,促使产品质量的提高.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2014(039)001
【总页数】5页(P40-44)
【关键词】头孢地嗪钠;有关物质;梯度洗脱
【作者】钟莹;周卫军;杨放;王健松;朱少璇
【作者单位】广州白云山制药股份有限公司广州白云山制药总厂,广州510515;广东省食品药品监督管理局审评认证中心,广州510080;广州白云山制药股份有限公司广州白云山制药总厂,广州510515;广州白云山制药股份有限公司广州白云山制
药总厂,广州510515;广州白云山制药股份有限公司广州白云山制药总厂,广州510515
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1+1
头孢地嗪是第三代头孢菌素，抗菌谱广，并具有免疫增强功能，在动物模型及人的体内外研究中显示该药可激活巨噬细胞，提高其吞噬活性及杀菌率。

在体内，头孢地嗪可延长感染动物或实验性免疫受损动物的存活率。

这与其含有2-巯基-4-甲基-5-噻唑乙酸(以下简称MMTA) 这一独特取代基有关[1-3]。

注射用头孢地嗪钠有关物质测定方法收载于2010年版中国药典，采用等度洗脱法，本文对药典方法进行了进一步研究和改进，建立了梯度洗脱法，可检测到更多杂质，有助于发现产品中的质量问题，促使产品质量的提高。

1260高效液相色谱仪(MWD检测器，Agilent公司)，2695高效液相色谱仪(DAD检测器，Waters公司)，CPA225D十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)。

注射用头孢地嗪钠(厂家A，规格0.5g，批号110501、110502、110503；厂家B，规格1.0g，批号1103041；厂家C，规格1.0g，批号1011223)，头孢地嗪对照品(中国药品生物制品检定所，130520-200902，89.0%)，杂质对照品：2-巯基-4-甲基-5-噻唑乙酸(Sigma，06318KEV，98%)；乙腈(色谱纯，美国Merk 公司)，其它试剂均为分析纯。

2.1 色谱条件与系统适用性试验
2.1.1 色谱条件
色谱柱Phenomenex Luna，C18柱(4.6mm ×250mm，5μm)；流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾0.87g与无水磷酸氢二钠0.22g，加水溶解并稀
释至1000mL，摇匀)，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～20min，A：95%→85%；20～40min， A：85%→80%；40～42min，A：80%→95%；42～50min，A
保持95%)；检测波长215nm；流速为1mL/min；进样量20μL。

2.1.2 系统适用性
取头孢地嗪对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1mL中约含头孢地嗪0.5mg 的溶液，取10mL加0.1mol/L盐酸溶液1mL，室温放置24h，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL，摇匀，取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

头孢地嗪峰理论塔板数为22898，与其相对保留时间0.8和1.1处杂质峰的分离度分别
为6.9和5.7。

2.1.3 测定法
取本品约25mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供
试品溶液(临用新制)；精密量取1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

分别取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法计算，见图2。

2.2 洗脱条件的选择
中国药典2010年版注射用头孢地嗪钠与日本药典(JP-16)头孢地嗪钠原料有关物
质检测均采用等度洗脱，流动相组成为磷酸盐缓冲液-乙腈，本法沿用此流动相组成，建立梯度洗脱法[4]。

此条件与等度洗脱法比较，分析时间更短，分离杂质的
能力更强，见下表1。

分别采用等度洗脱和梯度洗脱法对市售3个厂家的样品进行对比检测，结果在等度洗脱条件下，不同厂家产品的杂质个数及种类差别不大；在梯度洗脱条件下，不同厂家产品的杂质个数及种类差异较大，说明所建的梯度洗脱法更能有效地区别产品的质量(图3～4)。

2.3 杂质峰的归属MMTA为头孢地嗪钠一侧链，是头孢地嗪钠的合成中间体。

取MMTA对照品与供试品进样，在上述色谱条件下，供试品色谱图中5.5min处杂
质峰的保留时间、DAD紫外光谱图与MMTA(Rt 5.4min)均一致，推断该杂质峰
为MMTA[5]。

2.4 专属性(强制破坏性试验)
取注射用头孢地嗪钠分别用0.1mol/L盐酸溶液、0.1mol/L 氢氧化钠溶液、3%过氧化氢和高温80℃、光照等苛刻条件进行破坏试验后[6]，按上述色谱条件进行检测。

结果表明在各种破坏条件下所得的降解产物峰与主成分峰分离良好，降解产物峰之间也具有良好的分离度，空白溶剂对测定无干扰，DAD分析结果显示主成分峰中
均未发现杂质，方法具有专属性。

头孢地嗪钠在酸、碱、高温、光及氧化条件下均会发生不同程度的降解；酸、碱、高温破坏能使MMTA峰明显增大，该杂质在光照和氧化条件下易降解；杂质A(RT 13.5min)在各条件下均较稳定；杂质B(RT 32.4min)在光照条件下增大，在酸、碱、高温条件下减小，在氧化条件下变化不
明显，在稳定性加速及长期试验考察过程中均未有明显变化。

2.5 线性关系考察
精密称取头孢地嗪对照品、MMTA对照品适量，加磷酸盐缓冲液稀释成对照品溶
液(0.5mg/mL)，然后分别稀释成浓度相当于上述对照品溶液浓度2%、1.5%、1%、0.8%、0.2%、0.1%的系列浓度，按上述色谱条件进样检测，以峰面积Y对
溶液浓度X(mg/mL)作回归直线，得回归方程：头孢地嗪：Y=38800X+3.0451，r=0.9996；MMTA：Y=37712X+3.6463，r=0.9995。

MMTA的校正因子为1.0，故该杂质的计算可采用主成分自身对照法。

2.6 检测限和定量限试验
精密称取头孢地嗪对照品、MMTA对照品适量，分别逐级稀释，按上述色谱条件
进样检测，以信噪比3：1对应的浓度为检测限，10：1对应的浓度为定量限。

头孢地嗪的检测限为0.05μg/mL，定量限为0.17μg/mL；MMTA的检测限为
0.03μg/mL，定量限为0.09μg/mL。

2.7 重复性试验
取注射用头孢地嗪钠适量，按2.1项下方法制得5份供试品溶液，进样检测，结果MMTA平均含量为0.10%，RSD为4.3%；总杂质含量平均为0.55%，RSD为3.1%，表明本法的重复性良好，适合测定杂质含量。

2.8 稳定性试验
取重复性试验项下1份供试品溶液在低温4℃，于12h内连续进针，考察溶液的
稳定性，结果供试品溶液主峰面积随着时间增加而减小，7h后MMTA峰面积呈
增加的趋势，供试品溶液宜现配现用。

2.9 样品测定
取市售3个厂家的注射用头孢地嗪钠样品5批，按2.1项下方法制备供试品溶液，测定有关物质，结果见表2。

(1) 有关物质方法的关注点在于方法的专属性与灵敏度，即杂质被有效地检出。

中国药典注射用头孢地嗪钠有关物质检测方法采用等度洗脱，本文对方法进行了改进。

运用本色谱条件不但主峰及杂质峰出峰时间适宜，并能有效地分离各个杂质峰。

经破坏后的分解产物在此条件下也能有效地与主峰完全分离，具良好的专属性。

本法简单、灵敏，适用于注射用头孢地嗪钠有关物质的检测。

(2)关于检测波长，中国药典2010年版注射用头孢地嗪钠标准和JP-16头孢地嗪
钠标准的检测波长分别采用215nm和254nm。

比较两个波长，各杂质在215nm 响应值较高，故最终选择215nm为检测波长；在215nm下，MMTA的校正因
子为1.0，该杂质的定量可采用主成分的自身对照法。

(3)在上述色谱条件下，通过保留时间与DAD紫外光谱图进行判断，供试品色谱图中5.5min处杂质峰为MMTA。

MMTA为头孢地嗪钠一侧链，是头孢地嗪钠的合成中间体和主要降解产物[2]。

该杂质在5批样品中含量在0.09%～0.13%，故设
定限度为0.5%。

杂质A(RT 13.5min)和杂质B(RT 32.4min)在长期和加速稳定性试验中均未有明显变化，有待进一步研究。

【相关文献】
[1] Matsuima E, Minam I Y, Azuma R,et al. Alkaline and neutral degradation of cefodizime (THR2221) and structural elucidation of the products[J].Chem Pharm Bull, 1989, 37(2): 513-515.
[2] Scheunemann K H, Duerckheimer W, Blumbach J,et al. Thiazolyl or triazolyl sulf des and their use as imunostimulants and cytostatics: DE,3508655[P]. 1986-09-18.
[3] Scheunemann K H, Duerckheimer W, Blumbach J,et al. 1, 3-Thiazoles and their use as immunomodulators: 4762848[P]. 1988-08-09.
[4] 田洁, 仲宣惟, 胡昌勤. 改换HPLC色谱柱后梯度洗脱程序调整规律的探讨[J]. 药物分析杂志, 2006, 26(9): 1233-1237. [5] 秦青, 李爱军. 头孢地秦钠中有关物质测定的研究[J]. 中国药学杂志, 2003, 38(2): 130-133.
[6] 付继莹, 李宁. 注射用头孢地嗪钠有关物质方法学研究[J]. 黑龙江医药, 2010, 23(5): 724-726.。