分子生物学Chapter 3 DNA 复制PPT课件
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1938，Muller推测染色体末端存在一种特殊结构，对未出染色 体的稳定性由重要作用 – 即后来称为“端粒”的结构。
1984，Blackburn, E.研究组发现四膜虫rDNA末端在小核阶段 没有重复片段 ，但在发育成大核后rDNA末端出现了 370~520bp的（GGGGTT）n的重复序列。-- 推测在发育过程 中添加了此重复序列。该推测通过加尾实验验证。
.
3.2.3 D-环复制 （D-loop Model）
（线粒体DNA）
.
D-环复制的特征
环状DNA模板的两条单链的复制起点位置不同且相距 甚远。
复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、连 续合成前导链，并置换另一条模板单链。
当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的单向、 连续的合成。
colidna双向复制coli低剂量的tdttp的培养基数分钟高剂量的tdttp的培养基数分钟提叏ecolidnaecolidna放射自显影对丌同复制模式的预期结果实际观测结果ecolidna的复制是双向的复制起点的结构特征ecoli的复制起点oric不其它细菌的复制起点的序列比较以ecoli的复制起点ori13bpdrdirectionalrepeat
端粒酶（端粒末端转移酶 Telomere terminal transferase）: 真核生物特有的维持端粒完整性的酶，含有特定的小分子RNA 分子。
.
3’ 3’ 3’ 3’
.
当端粒酶催化合成足够长的G链后，G链回折形成Hoogsteen 结构，且末端和另一链的末端连接，形成封闭的染色体末端。
末端重复一致。
但是，四膜虫末端重复的互补序列在上述体系中不能加尾。
末端的延长是DNA合成过程， 原有的序列是合成的. 引物而不是模板。
通过端粒复制避免末端缩短
端粒和端粒酶：大多数真核生物
端粒（Telomere）： 真核生物中由染色体末端的短重复序列和相关蛋白质组成的特 殊结构，对维持染色体的稳定性起着重要作用。
G链
CCCAACCCCAACC………..GGGG… GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG…
G=G Hoogsteen结构
.
端粒长度与细胞“年龄”相关
.
3.4 真核生物和原核生物复制的特征 和复制调控
.
3.4.1 原核生物的复制特征
单复制子 营养充足时，可在一个复制子内起始多次复制。
引物前体 220~360nt: 反义RNA与引物前体互 补 引. 物前体 〉360nt: 起始复制
由G1期积累的执照因子参与的正调控
G1期
负调控：G2期积累增殖 蛋白，它能够阻止Mcm 因子装配到新合成的 DNA上而防止同一细胞 周期内的重复复制起始。
G2期 S期
.
真核生物复制只在S期进行
13bp DR(Directional Repeat: 同向/直接重复) 9bp IR (Inverted Repeat: 反向重复)
复制起点的这些特征有利于在该位点快速解链以发动复制和促进 DNA聚合酶的结合。
.
3.1.5 DNA复制的引物是RNA -- 证实实验之1
+链 M13噬菌体DNA
Chapter 3 DNA复制 （Replication）
3.1 DNA复制的起点和方向
.
3.1.1 DNA复制的方向
通过实验判断DNA复制的方向
E. coli
对不同复制模式的预期结果
低剂量的3T-dTTP的培养基 数分钟
高剂量的3T-dTTP的培养基 数分钟
提取E.coli DNA
E.coli DNA 放射自显影
+链
侵染大肠杆菌E.coli并利
-链
用其中的酶等进行复制
复制型（RF型）DNA
加入：利福平 E.coli: Rif s (利福平敏感)
培养 接种M13噬菌体
无 RF型
加入：利福平 E.coli: Rif r (利福平抗性)
培养 接种M13噬菌体
有 RF型
（以上实验证实M13DNA的复制需要RNA的合成）
用32P标记复制引物
复制，合成冈崎片段
DNase Ⅰ酶切
.
复制引物
前导链合成的引物：由RNA聚合酶引导合成的RNA （证据：实验之1）（见复制的转录激活）
后随链合成的引物（冈崎片段合成的引物）：由引物酶 催化合成的RNA。
引物酶不同于转录中的RNA聚合酶。 引物酶由dnaG基因编码。 引物在完成冈崎片段合成后被降解。冈崎片段之间的缺口
第一次复制的复制叉
第二次复制的复制叉
.
3.4.2 真核生物复制的特征
多复制起点和多复制子 复制的不一致性
同一个细胞中不同复制子起始复制的早晚差异 不同组织细胞复制的早晚差异 复制子的数量和复制速度随着细胞、组织和发育时期不
同而有差异
只有当所有的复制子完成复制后，才能在起始点上起 始下一次的复制；而且，真核生物的复制严格控制在 S期，一次分裂复制一次。
实际观测结果
E.coli DNA 的复制是双向的
.
实验证实E. coli DNA双向复制
3.1.2 复制起点和方向的模式
.
复制起点的分离
.
3.1.4 复制起点的结构特征
E.coli 的复制起点Ori C与其它细. 菌的复制起点的序列比较
复制起点的结构特征
以E.coli 的复制起点Ori C为例 是染色体上位置固定的一段DNA 富含AT 含甲基化位点：GATC 重复序列
.
3.2.1 新起始复制方式 （de nova initiation）
θ复制/凯恩斯模型 （ θ model/Cairns model）
3H A
3H
3H
C
B
Cairns, J.P.: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 28:44, 1963.
共联体 RNaseⅢ错位切割
.
腺病毒-2：末端起始复制
SSB：单链结合蛋白 TP：末端结合蛋白
pTP：末端结合蛋白前体
.
腺病毒-2：单链置换式复制
红色 单链 的复 制起
始
蓝色单链复制起始
.
真核生物避免末端缩短的机制
.
端粒的发现和证实
现象：
1930s, 果蝇和玉米中，染色体末端缺失时，会出现两个姊妹染 色体在末端融合；而在正常染色体中不会发生末端的融合。
E.coli: Rif s (利福平敏感)
接种M13噬菌体 培养 加入：利福平
有 RF型
（该实验证实当复制已经启动后，RN.A分子合成与否不会影响复制的进行）
3.1.5 DNA复制的引物是RNA -- 证实实验之2
菌株
a, e; c, g b, f; d, h
RNaseH基因型
- 无RNaseH
+ 有RNaseH
两条链的复制完成有先后。
.
3种复制方式的主要差异
新起始方式 （从头合成方式，θ复制）
滚环复制
D-环复制
前导链 连续合成
连续合成，其模板保持环状； 连续合成
始终与后随链模板共价连接。
后随链 不连续合成
不连续合成，其模板游离形成 连续合成 线性分支。
复制起点 固定，同一个位点
固定，同一位点
固定，不同位点
E.coli DNA
.
引发前体 Preprimosome
.
复制体的形成和新链的延伸
.
复制的终止பைடு நூலகம்子代分子的分离
终止：Tus蛋白+终 止陷阱
子代分离：拓扑异构 酶IV；XerCD蛋白 （位点特异的重组酶）
.
3.2 复制的模式
.
θ复制 （ θ model） 滚环复制（Rolling-circle replication） D-环复制（Displacement-loop model）
引物
RNA分子
前导链：后随链模板的3’端； RNA
后随链：RNA
.
3.3 避免线性DNA复制时末端缩短的机制
.
环状DNA的复制不存在末端缩短的问题
.
线性DNA复制后出现5’末端缩短
5’
3’
缺口
3’
突出末端
缺口
.
T7噬菌体通过形成共联体避免5’末端缩短
RNaseⅢ切点
冗余末端
冗余末端
RNaseⅢ切点
.
加尾实验
1984，Shampay，J & Blackburn, E
自 主 复 制 序 列
结论：
四膜虫rDNA染色体末端
的确可以在发育中延长
.
加 尾 实 验（续）
结论：不管染色体末端的来源何在，其延长部分的序列由宿主细胞决 定。这暗示细胞内具有特殊的结构. 和机制来控制染色体末端的延长。
加尾实验（续）
Rop
-555 -445 反义RNA
反义RNA转录起点
基因表达 Rom
反义RNA的合成以及它与引物前 体的结合阻止了RNaseH的作用；
反义RNA的浓度决定了胞内有效 引物的浓度，从而影响复制的起始。
Rom：在反义RNA存在的前提下，负调控复制 起始
引物前体 100~220nt: 抑制其继续合成
通过在酵母中的加尾实验证明：染色体末端在复制过程中 可以被延长。延长的末端序列由宿主酵母决定，即细胞中 有特殊的结构或机制控制末端的延长。
进一步的加尾实验：
四膜虫末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验 酵母的末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验 两个实验的结果：均出现加尾，且延长的尾巴与四膜虫的染色体
GATC CTAG
CH3
全甲基化OriC
第一次复制
GATC CTAG
CH3
半甲基化OriC
起始第二次复制
.
Dam甲基化酶
CH3
GATC CTAG
CH3
全甲基化OriC
质粒ColEⅠ：反义RNA对复制的调控
引物前体转录起点
RNaseH: 降解引物前体RNA使之3’-OH暴露。
引物前体500nt
复制起点
3H
A 3H
B
注：C红色线条表示反射性同位素标记的新链， .
经过放射自显影后可在感光胶片上显示出来。
新起始方式的主要特征
每次复制均从一个固定的复制起点起始 前导链连续合成，后随链由冈崎片段连
接而成 SV40的复 制
真核生物DNA的复 制
.
3.2.2 滚环复制 Rolling-circle Model
.
前导链
滞后链
.
.
滚环复制的特征
复制起始时，复制起点的一条单链断裂，而释放出5’ 端和3’端。
3’端作为前导链合成的引物，前导链连续合成。5’端游 离出来，作为后随链合成的模板。
在旺盛合成时期，前导链不断合成，且连在一起形成 多联体分支，并作为新的后随链合成的模板。
前导链的合成不需要另外合成的RNA引物。
有DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶通过缺口平移的方式填补。
.
引物的去除和冈崎片段的连接
3’
5’
OH OH
.
复制的转录激活
.
3.1.6 复制的过程
起始：引发体的形成 延伸：复制体形成以及单脱氧核糖核苷酸的添加
导致新链的延长 终止：子代双链分子的分离
.
起始：引发体的形成
引发体：在复制起点由多种不同的相关蛋白组合成引发前体后结合 引发酶而形成的复合物。
端粒酶 ： 避免染色体末端缩短的机制
.
3.4.3 复制的调控
主要是对复制起始的控制
原核生物：
甲基化对复制的调控： Col E1质粒：反义RNA对复制的负调控
真核生物：
正调控 负调控
.
甲基化对复制的控制：
Dam甲基化酶—对GATC位点的甲基化 DnaA蛋白--识别全甲基化的复制起点
CH3
1984，Blackburn, E.研究组发现四膜虫rDNA末端在小核阶段 没有重复片段 ，但在发育成大核后rDNA末端出现了 370~520bp的（GGGGTT）n的重复序列。-- 推测在发育过程 中添加了此重复序列。该推测通过加尾实验验证。
.
3.2.3 D-环复制 （D-loop Model）
（线粒体DNA）
.
D-环复制的特征
环状DNA模板的两条单链的复制起点位置不同且相距 甚远。
复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、连 续合成前导链，并置换另一条模板单链。
当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的单向、 连续的合成。
colidna双向复制coli低剂量的tdttp的培养基数分钟高剂量的tdttp的培养基数分钟提叏ecolidnaecolidna放射自显影对丌同复制模式的预期结果实际观测结果ecolidna的复制是双向的复制起点的结构特征ecoli的复制起点oric不其它细菌的复制起点的序列比较以ecoli的复制起点ori13bpdrdirectionalrepeat
端粒酶（端粒末端转移酶 Telomere terminal transferase）: 真核生物特有的维持端粒完整性的酶，含有特定的小分子RNA 分子。
.
3’ 3’ 3’ 3’
.
当端粒酶催化合成足够长的G链后，G链回折形成Hoogsteen 结构，且末端和另一链的末端连接，形成封闭的染色体末端。
末端重复一致。
但是，四膜虫末端重复的互补序列在上述体系中不能加尾。
末端的延长是DNA合成过程， 原有的序列是合成的. 引物而不是模板。
通过端粒复制避免末端缩短
端粒和端粒酶：大多数真核生物
端粒（Telomere）： 真核生物中由染色体末端的短重复序列和相关蛋白质组成的特 殊结构，对维持染色体的稳定性起着重要作用。
G链
CCCAACCCCAACC………..GGGG… GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG…
G=G Hoogsteen结构
.
端粒长度与细胞“年龄”相关
.
3.4 真核生物和原核生物复制的特征 和复制调控
.
3.4.1 原核生物的复制特征
单复制子 营养充足时，可在一个复制子内起始多次复制。
引物前体 220~360nt: 反义RNA与引物前体互 补 引. 物前体 〉360nt: 起始复制
由G1期积累的执照因子参与的正调控
G1期
负调控：G2期积累增殖 蛋白，它能够阻止Mcm 因子装配到新合成的 DNA上而防止同一细胞 周期内的重复复制起始。
G2期 S期
.
真核生物复制只在S期进行
13bp DR(Directional Repeat: 同向/直接重复) 9bp IR (Inverted Repeat: 反向重复)
复制起点的这些特征有利于在该位点快速解链以发动复制和促进 DNA聚合酶的结合。
.
3.1.5 DNA复制的引物是RNA -- 证实实验之1
+链 M13噬菌体DNA
Chapter 3 DNA复制 （Replication）
3.1 DNA复制的起点和方向
.
3.1.1 DNA复制的方向
通过实验判断DNA复制的方向
E. coli
对不同复制模式的预期结果
低剂量的3T-dTTP的培养基 数分钟
高剂量的3T-dTTP的培养基 数分钟
提取E.coli DNA
E.coli DNA 放射自显影
+链
侵染大肠杆菌E.coli并利
-链
用其中的酶等进行复制
复制型（RF型）DNA
加入：利福平 E.coli: Rif s (利福平敏感)
培养 接种M13噬菌体
无 RF型
加入：利福平 E.coli: Rif r (利福平抗性)
培养 接种M13噬菌体
有 RF型
（以上实验证实M13DNA的复制需要RNA的合成）
用32P标记复制引物
复制，合成冈崎片段
DNase Ⅰ酶切
.
复制引物
前导链合成的引物：由RNA聚合酶引导合成的RNA （证据：实验之1）（见复制的转录激活）
后随链合成的引物（冈崎片段合成的引物）：由引物酶 催化合成的RNA。
引物酶不同于转录中的RNA聚合酶。 引物酶由dnaG基因编码。 引物在完成冈崎片段合成后被降解。冈崎片段之间的缺口
第一次复制的复制叉
第二次复制的复制叉
.
3.4.2 真核生物复制的特征
多复制起点和多复制子 复制的不一致性
同一个细胞中不同复制子起始复制的早晚差异 不同组织细胞复制的早晚差异 复制子的数量和复制速度随着细胞、组织和发育时期不
同而有差异
只有当所有的复制子完成复制后，才能在起始点上起 始下一次的复制；而且，真核生物的复制严格控制在 S期，一次分裂复制一次。
实际观测结果
E.coli DNA 的复制是双向的
.
实验证实E. coli DNA双向复制
3.1.2 复制起点和方向的模式
.
复制起点的分离
.
3.1.4 复制起点的结构特征
E.coli 的复制起点Ori C与其它细. 菌的复制起点的序列比较
复制起点的结构特征
以E.coli 的复制起点Ori C为例 是染色体上位置固定的一段DNA 富含AT 含甲基化位点：GATC 重复序列
.
3.2.1 新起始复制方式 （de nova initiation）
θ复制/凯恩斯模型 （ θ model/Cairns model）
3H A
3H
3H
C
B
Cairns, J.P.: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 28:44, 1963.
共联体 RNaseⅢ错位切割
.
腺病毒-2：末端起始复制
SSB：单链结合蛋白 TP：末端结合蛋白
pTP：末端结合蛋白前体
.
腺病毒-2：单链置换式复制
红色 单链 的复 制起
始
蓝色单链复制起始
.
真核生物避免末端缩短的机制
.
端粒的发现和证实
现象：
1930s, 果蝇和玉米中，染色体末端缺失时，会出现两个姊妹染 色体在末端融合；而在正常染色体中不会发生末端的融合。
E.coli: Rif s (利福平敏感)
接种M13噬菌体 培养 加入：利福平
有 RF型
（该实验证实当复制已经启动后，RN.A分子合成与否不会影响复制的进行）
3.1.5 DNA复制的引物是RNA -- 证实实验之2
菌株
a, e; c, g b, f; d, h
RNaseH基因型
- 无RNaseH
+ 有RNaseH
两条链的复制完成有先后。
.
3种复制方式的主要差异
新起始方式 （从头合成方式，θ复制）
滚环复制
D-环复制
前导链 连续合成
连续合成，其模板保持环状； 连续合成
始终与后随链模板共价连接。
后随链 不连续合成
不连续合成，其模板游离形成 连续合成 线性分支。
复制起点 固定，同一个位点
固定，同一位点
固定，不同位点
E.coli DNA
.
引发前体 Preprimosome
.
复制体的形成和新链的延伸
.
复制的终止பைடு நூலகம்子代分子的分离
终止：Tus蛋白+终 止陷阱
子代分离：拓扑异构 酶IV；XerCD蛋白 （位点特异的重组酶）
.
3.2 复制的模式
.
θ复制 （ θ model） 滚环复制（Rolling-circle replication） D-环复制（Displacement-loop model）
引物
RNA分子
前导链：后随链模板的3’端； RNA
后随链：RNA
.
3.3 避免线性DNA复制时末端缩短的机制
.
环状DNA的复制不存在末端缩短的问题
.
线性DNA复制后出现5’末端缩短
5’
3’
缺口
3’
突出末端
缺口
.
T7噬菌体通过形成共联体避免5’末端缩短
RNaseⅢ切点
冗余末端
冗余末端
RNaseⅢ切点
.
加尾实验
1984，Shampay，J & Blackburn, E
自 主 复 制 序 列
结论：
四膜虫rDNA染色体末端
的确可以在发育中延长
.
加 尾 实 验（续）
结论：不管染色体末端的来源何在，其延长部分的序列由宿主细胞决 定。这暗示细胞内具有特殊的结构. 和机制来控制染色体末端的延长。
加尾实验（续）
Rop
-555 -445 反义RNA
反义RNA转录起点
基因表达 Rom
反义RNA的合成以及它与引物前 体的结合阻止了RNaseH的作用；
反义RNA的浓度决定了胞内有效 引物的浓度，从而影响复制的起始。
Rom：在反义RNA存在的前提下，负调控复制 起始
引物前体 100~220nt: 抑制其继续合成
通过在酵母中的加尾实验证明：染色体末端在复制过程中 可以被延长。延长的末端序列由宿主酵母决定，即细胞中 有特殊的结构或机制控制末端的延长。
进一步的加尾实验：
四膜虫末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验 酵母的末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验 两个实验的结果：均出现加尾，且延长的尾巴与四膜虫的染色体
GATC CTAG
CH3
全甲基化OriC
第一次复制
GATC CTAG
CH3
半甲基化OriC
起始第二次复制
.
Dam甲基化酶
CH3
GATC CTAG
CH3
全甲基化OriC
质粒ColEⅠ：反义RNA对复制的调控
引物前体转录起点
RNaseH: 降解引物前体RNA使之3’-OH暴露。
引物前体500nt
复制起点
3H
A 3H
B
注：C红色线条表示反射性同位素标记的新链， .
经过放射自显影后可在感光胶片上显示出来。
新起始方式的主要特征
每次复制均从一个固定的复制起点起始 前导链连续合成，后随链由冈崎片段连
接而成 SV40的复 制
真核生物DNA的复 制
.
3.2.2 滚环复制 Rolling-circle Model
.
前导链
滞后链
.
.
滚环复制的特征
复制起始时，复制起点的一条单链断裂，而释放出5’ 端和3’端。
3’端作为前导链合成的引物，前导链连续合成。5’端游 离出来，作为后随链合成的模板。
在旺盛合成时期，前导链不断合成，且连在一起形成 多联体分支，并作为新的后随链合成的模板。
前导链的合成不需要另外合成的RNA引物。
有DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶通过缺口平移的方式填补。
.
引物的去除和冈崎片段的连接
3’
5’
OH OH
.
复制的转录激活
.
3.1.6 复制的过程
起始：引发体的形成 延伸：复制体形成以及单脱氧核糖核苷酸的添加
导致新链的延长 终止：子代双链分子的分离
.
起始：引发体的形成
引发体：在复制起点由多种不同的相关蛋白组合成引发前体后结合 引发酶而形成的复合物。
端粒酶 ： 避免染色体末端缩短的机制
.
3.4.3 复制的调控
主要是对复制起始的控制
原核生物：
甲基化对复制的调控： Col E1质粒：反义RNA对复制的负调控
真核生物：
正调控 负调控
.
甲基化对复制的控制：
Dam甲基化酶—对GATC位点的甲基化 DnaA蛋白--识别全甲基化的复制起点
CH3