GeneXpert MTBRIF联合线性探针检测技术在耐药结核病诊断中的应用研究

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%&'!()*+,-,"./'001*()))2--3(*3)3(*()*)33基金项目!上海市公共卫生体系建设三年行动计划%3)3),3)33年&重点学科建设%H D X 2()*(26`)+&'上海市卫生健康委员会科研课题%3)(,:a )(-,
&作者单位!3))++-上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室通信作者!江渊(;<='>!.'=1Z Y V =1!
0C %C /0?/C 1)短篇论著)
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$%&A K : B >X 联合线性探针检测技术在耐药结核病诊断中的应用研究
李静!郁晨蕾!张阳奕!王莉莉!沈旭辉!陈炜!江渊
摘要 选择上海市(,家结核病定点医院作为研究现场(对3)(7年(3月至3)(4年(3月初诊为可疑肺结核患者的痰样本%+,)+份&同时进行痰涂片0N R 9M ;98H #M,-)液体培养%简称#液体培养$&和H I 1I 6J I K L 8M N "O #P %简称H I 1I 6J I K L &检测(研究H I 1I 6J
I K L 检测结核分枝杆菌的效能'对同期收集到的7)7例临床诊断肺结核患者的分离菌株采用线性探针检测技术%>'1I J K &W I =00=Y (Q S R &进行利福平耐药性检测(将检测结果与H I 1I 6J I K L 检测结果不一致的痰样本(用培养阳性菌株采用最低抑菌浓度%<'1'<V 1'1?'W 'L &K Y C &1C I 1L K =L '&1(8#9&法和H I 1I 6J I K L 方法复测(比较同一例患者从痰样本中采用H I 1I 6J
I K L 检测利福平耐药情况与其培养阳性菌株采用Q S R 检测利福平耐药情况的一致性-结果显示(+,)+例痰标本同时进行痰涂片0液体培养和H I 1I 6J
I K L 检测(阳性检出率分别为(,*-+F %7--"+,)+&03G *,+F %()(3"+,)+&03G *(-F %,43"+,)+&-H I 1I 6J
I K L 阳性检出率高于痰涂片(差异有统计学意义%"3g +:*+,)(,$)*))(&'略低于液体培养(但差异无统计学意义%"3g )
*-()(,g )*:+-&-以液体培养%培养阳性鉴定为结核分枝杆菌&为标准(H I 1I 6J
I K L 检测的敏感度和特异度分别为4(*3+F %433"()(3&和,:*:7F %37+("34,(&(痰涂片检测的敏感度和特异度分别为-:*,3F %-G 7"()(3&和,-*3+F %3743"34,(&-对同一例患者的痰样本采用H I 1I 6J
I K L 检测利福平耐药性(与对其培养阳性菌株采用Q S R 检测利福平耐药性进行比较(两种分子检测技术符合率达,4*+)F %-,G "7)7&-H I 1I 6J
I K L 和Q S R 两种方法检测利福平耐药性符合率很高(但也可能存在漏检或过诊情况-对于检测结果不一致的情况(还需要引入其他检测方法(为精准诊断提供实验室依据-
关键词 !结核'!抗药性'!分子诊断技术'!分子探针技术'!利福平
8##13'0&3()(/L $)$W #$%&A K : B >X '(<23)$-53&,13)$0%#%(2$-$&$'&3()&$',)(1(7.3)&,$-307)(*3*(/-%+7
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.中国结核病预防控制工作技术规范%3)3)年版&/中对于肺结核患者耐药筛查要求为(对具备分子生物学核酸耐药检测技术的实验室(优先采用分子生物学耐药检测'对初治患者首次分子生物学检测为利福平耐药(需取另一份痰标本进行重复检测(若仍为利福平耐药(则判定为利福平耐药(否则按利福平敏感处理-对肺结核的治疗方式要求根据肺结核病情及利福平耐药与否制定不同的治疗方案(由此可见(应用分子生物学检测利福平的耐药性对于临床诊断和后续化疗方案的制定可以起到关键性的作用-
上海市(,家结核病定点医院实验室在3)(-年根据国家结核病分级诊疗和综合防治服务模式试点工作的要求逐步配备了H I1I6J I K L8M N"O#P%简称H I1I6J I K L&设备(并开展临床检测-本研究收集3)(7年(3月至3)(4年(3月上海市(,家结核病定点医院临床诊断为肺结核患者的培养阳性菌株(在上海市疾病预防控制中心结核病实验室采用线性探针检测技术%Q S R&进行利福平耐药性检测(评估从患者痰样本中采用H I1I6J I K L检测利福平耐药性与从患者痰标本中分离培养获得的阳性菌株采用Q S R检测利福平耐药结果的一致性(探讨分子生物学快速检测技术在临床工作中的实际应用价值-
材料和方法
一0标本来源和研究内容
选择上海市(,家结核病定点医院作为研究现场(纳入3)(7年(3月至3)(4年(3月初诊的可疑肺结核患者-肺结核可疑症状者的标准为咳嗽0咯痰时间超过3周(因呼吸道症状接受检查-(,家结核病定点医院实验室对初诊肺结核可疑症状者的同一份合格痰样本开展痰涂片0N R9M;9 8H#M,-)液体培养%简称#液体培养$&0H I1I6J I K L共+种方法检测(合格的痰样本为黏液样或干酪样性状的痰液(避免使用口水痰(痰量("+<>为宜-
上海市疾病预防控制中心结核病实验室对收集到的:437例患者的检测结果进行数据整理(去除4G4份重复样本03-份培养污染样本0:)份H I1I6J I K L检测失败样本(最终对+,)+份有效样本进行H I1I6J I K L检测-
上海市疾病预防控制中心结核病实验室对3)(7年(3月至3)(4年(3月(,家结核病定点医院临床诊断的773例%包含于在:437例患者中&肺结核患者的培养阳性菌株(采用(-"K O T R测序方法进行菌种鉴定(-G例%4*:3F&为非结核分枝杆菌(7)7例%,(*G4F&为结核分枝杆菌复合群(对7)7株结核分枝杆菌临床菌株采用Q S R进行利福平耐药性检测(对于Q S R法得到的利福平耐药性检测结果(与使用患者痰样本进行H I1I6J I K L检测结果不一致者(采用其培养阳性菌株进行H I1I6J I K L复测(并同时采用最低抑菌浓度法%<'1'<V<'1?'W'L&K Y C&1C I1L K=L'&1(8#9&进行复核(评估Q S R和H I1I6J I K L两种分子生物学检测技术检测利福平耐药性的情况-
二0检测方法
(/痰涂片检查!按照.痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册/*(+中的操作程序执行-
3/分离培养和鉴定!分离培养采用T2乙酰2Q2半胱氨酸2T=!E法进行标本处理(按照.结核病实验室检验规程/*3+进行操作-对于培养阳性菌株((,家结核病定点医院实验室采用免疫色谱法%胶体金法&进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定-上海市疾病预防控制中心结核病实验室采用(-"K O T R测序*M2())S9O仪%N'&2O=%公司&0 H I>$&C M86O c紫外凝胶成像仪%N'&2O=%公司&+方法进行菌种鉴定-
+/药物敏感性%简称#药敏$&试验!采用结核分枝杆菌最低抑菌浓度法(使用M O;`"I10'L'L K I8a9!M N#药敏板%美国赛默飞世尔科技公司&按照说明书进行操作-参考美国临床和实验室标准协会9Q"#83:2R3标准(利福平临界浓度为(*)(Z"<>(耐药判定标准!菌株的8#9值#临界浓度值(则为耐药'8#9值"临界浓度值(则为敏感-:/H I1I6J I K L检测!按照H I1I6J I K L8M N"O#P%美国9I J?I'%公司&操作说明书上的步骤进行(结果通过专用软件判读-
G/Q S R检测!采用H I1&M Y J I8M N$O J>V0耐药检测试剂盒%德国E='18M N$O J>V0公司&(按操作说明书进行操作-
三0质量控制
室内质控!8#9法采用标准菌株E+7O_%R M99373,:&作为质控菌株'Q S R采用标准菌株E+7O_%R M99373,:&作为结核分枝杆菌复合群和耐药基因位点的质控菌株(无菌蒸馏水为空白对照'室间质控!上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室通过国家结核病参比实验室组织的药敏熟练
+
)
(
(
3)3(():+()!9?'1UR1L'L V W I K C!C L&W I K3)3(X&>*:+T&/()
度测试'上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室及各结核病定点医院均通过国家结核病参比实验室组织的分子生物学质控(结核病定点医院结核病实验室液体培养污染率均小于4F -四0统计学处理
采用"S ""(7*)统计软件进行统计学分析-三种不同
检测方法阳性检出率的比较采用配对"3检验(检验显著性
水平定为)*)G '以液体培养法为标准(计算痰涂片和H I 1I 6J I K L 检测结果的敏感度0特异度0阳性预测值0阴性预测值0符合
率和一致性%]1))1检验&(符合率,G F 8/值的计算采用D '>0&1估计法'Q S R 和H I 1I 6J I K L 两种分子检测技术检测利福平耐药性的一致性采用]1))1检验(]1))1&)*7G 说明一致性较好(]1))1$)*:说明一致性较差()*7G #]1))
1&)*:说明一致性一般-结!!果
一0H I 1I 6J
I K L 检测结核分枝杆菌的效能+,)+例痰标本同时进行痰涂片0液体培养%培养阳性菌种鉴定为结核分枝杆菌&和H I 1I 6J
I K L 检测(阳性检出率分别为(,*-+F %7--"+,)+&03G *,+F %()(3"+,)+&03G *(-F %,43"+,)+&-H I 1I 6J
I K L 阳性检出率高于痰涂片(差异有统计学意义%"3g +:*+,)(,$)*))(&'略低于液体培养(差异无统计学意义%"3g )
*-()(,g )*:+-&-以液体培养%培养阳性鉴定为结核分枝杆菌&为标准(H I 1I 6J I K L 检测的敏感度0特异度0阳性预测值0阴性预测值分别为4(*3+F
%433"()(3&0,:*:7F %37+("34,(&04+*7(F %433",43&0,+*G )F %37+("3,3(&(两种方法检测结果符合率为,(*)+F (]1))1值为)*7-:(两者一致性较好'痰涂片检测的敏感度0特异度0阳性预测值0阴性预测值分别为-:*,3F 0,-*3+F 04G *77F 044*-4F (
两种方法检测结果符合率为44*((F (]1))1值为)*--:(两者一致性一般-见表(
-二0Q S R 和H I 1I 6J
I K L 检测利福平耐药性的效能分析%一&两种方法检测利福平耐药情况和一致性分析7)7株结核分枝杆菌中(采用Q S R 检测利福平耐药有
+,例%G *G 3F &(采用H I 1I 6J
I K L 检测痰样本的利福平耐药有:(例%G *4)F &(差异无统计学意义%"3g)
*)G )(,g )*4(4&-两种方法从同一例患者初诊痰样本与初诊痰培养阳性菌株中检测利福平结果符合率为,4*+)F %-,G "7)7&(,G F 8/值为,7*)-F ",,*)+F ']1))
1%,G F 8/&值为)*4:(%)*7G +")*,3,&(说明两种方法检测利福平耐药性的一致性很好-
%二&检测结果不一致复核情况
两种方法检测不一致共计(3例-其中(G 例Q S R 检测为利福平耐药但H I 1I 6J
I K L 检测为利福平敏感(7例Q S R 检测为利福平敏感但H I 1I 6J
I K L 检测为利福平耐药-见表3-(/H I 1I 6J I K L 复测情况!(3例采用菌株复测(G 例利福平前后结果一致(均为耐药%:(*-7F &'7例利福平耐药性前后结果不一致-
3/复核情况!(例患者的菌株为混合生长无法进行药敏检测(((例患者的菌株采用8#9法进行利福平耐药性复核-
Q S R 08#9和H I 1I 6J I K L +种方法检测利福平的耐药性(7例结果均一致%-+*-:F &(:例结果不一致-不一致结果中(3例Q S R 和8#9法检测为利福平敏感而H I 1I 6J I K L 检测为利福平耐药(3例Q S R 检测为利福平敏感而H I 1I 6J
I K L 和8#9法检测为利福平耐药-
讨!!论
DE !于3)()年推荐H I 1I 6J
I K L 检测技术用于肺结核的诊断*
++(该项技术已在多个国家和地区进行了验证评估(显示其高敏感度和高特异度*:27+-本研究结果显示(
以液体培养结果为标准(H I 1I 6J
I K L 检测的敏感度和一致性均高于痰涂片(特异度低于痰涂片(与国内报道略有不同*
724+-同时比较从患者痰样本中采用H I 1I 6J
I K L 与从患者痰标本中分表C !以液体培养为标准比较痰涂片和H I 1I 6J
I K L 检测痰样本的效能%+,)+份&检测方法
结果液体培养%份&阳性=
阴性
敏感度
*F %,G F 8/&+特异度
*F %,G F 8/&+符合率
*F %,G F 8/&+阳性预测值
*F %,G F 8/&+阴性预测值
*F %,G F 8/&+]1))
1值%,G F 8/
&痰涂片-:*,3%-(*44"-7*4G &,-*3+%,G *:G ",-*44&44*((%47*)-"4,*),&4G *77%4+*)G "44*(+&44*-4%47*G ("4,*7-&)*--:
%)*-+-"
)*-,3&!阳性-G 7(),!阴性+G G
3743
H I 1I 6J I K L 4(*3+%74*-G "4+*G -&,:*:7%,+*G G ",G *3-&,(*)+%,)*()",(*4,&4+*7(%4(*3("4G *,+&,+*G )%,3*G 3",:*+G &)*7-:%)*7:("
)*744&!阳性433(-)!阴性
(,)
37+(
注=!液体培养阳性为鉴定为结核分枝杆菌的份数
:)((3)3(():+()!9?'1UR 1L 'L V W I K C !C L &W I K 3)3(X &>*:+T &/()
表D !(3株Q S R 和H I 1I 6J
I K L 检测利福平耐药性不一致结核分枝杆菌的结果及复核结果菌株编号Q S R
=
H I 1I 6J I K L =
%痰样本检测结果&
H I 1I 6J
I K L =
%培养阳性菌株检测结果&
8#9W %(
Z "<>&)+-4敏感耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+敏感%(*)&):G 3敏感耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药%:*)&)G 37敏感
耐药*J K &W IR %G )7"G ((&+敏感
敏感%)*3G &)-((耐药*"-),8]M+%"G +(Q &+敏感
耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药%(-*)&)-:4敏感
耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药%3*)&)43(耐药*"-),8]M+%"G +(Q &+敏感
耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药%(-*)&)4-7敏感耐药*J K &W IR %G )7"G ((&+敏感
敏感%)*(3&)44G 敏感
耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+敏感%(*)&),,4耐药*"-),8]M+%"G +(Q &+敏感耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药%(-*)&():+耐药*"-),8]M+%"G +(Q &+敏感
耐药*J K &W I;%G 3,"G ++&+耐药%4*)&(::(敏感
耐药*J K &W I N %G (3"G (4&+耐药*J K &W I N %G (3"G (4&+混合生长(:G 4
耐药*"-)
,8]M+%"G +(Q &+敏感
耐药*J K &W I;%G 3,"
G ++&+耐药%(-*)
&注=!括号中表示检测为耐药的菌株利福平耐药基因突变位点'W !括号中表示利福平耐药水平(利福平临界耐药水平为#(*)(Z
"<>离培养获得的阳性菌株(采用Q S R 检测利福平的耐药性(结果显示两种检测技术对同一例患者初诊痰样本与初诊痰培养阳性菌株中检测利福平结果符合率达,4*+)F -对(3例两种方法检测结果不一致者使用阳性菌株分别采用H I 1I 6J I K L 和8#9法检测(结果显示+种方法检测利福平耐药性7例结果%-+*-:F &一致'H I 1I 6J I K L 复测G 例%:(*-7F &前后结果一致-本研究采用不同方法检测结核分枝杆菌(H I 1I 6J
I K L 阳性检出率%3G *(-F &高于痰涂片法%(,*-+F &(略低于液体培养法%3G *,+F &-相比液体培养(H I 1I 6J I K L 除标本前处理外检测均在封闭的反应盒内自动完成(具有操作简单0快速0交叉污染低0安全等特点-H I 1I 6J
I K L 从检测到报告仅需3*G ?(比液体培养%阳性时间(("33%
&*,+大大缩短了检测时间-H I 1I 6J I K L 检测结核分枝杆菌的效能显示其检测敏感度0阴性预测值为4(*3+F 和,+*G )F (
高于痰涂片法%-:*,3F 和44*-4F &(其特异度和阳性预测值%,:*:7F 和4+*7(F &略低于痰涂片法%,-*3+F 和4G *77F &
-此结果与陈蕾和吴桂辉*4+研究得出的H I 1I 6J
I K L 检测特异度和敏感度结果略有不同(
分析一种原因可能是由于不同的检测方法使用前处理方法各不相同(
因此虽然使用同一份痰样本(但是由于痰样本性状黏稠(不能保证样本能平均分配(特别是对于低阳性级别的痰样本'还有一种原因可能是不同检测方法检出限的不同而影响其检测效能-多项研究显示(当结核
分枝杆菌含量达到G e ()+"G e (
):9P ]"<>时痰涂片法才能得到阳性结果(液体培养法检测限为()"
())9P ]"<>(而H I 1I 6J
I K L 技术最低检出限为(+(9P ]"<>*4(()2(3+-本研究也显示(H I 1I 6J I K L 与液体培养法两种方法检测结果符合率高(一致性较好-本研究采用Q S R 检测7)7株结核分枝杆菌菌株(
利福平耐药有+,株%G *G 3F &-采用H I 1I 6J I K L 检测痰样本结果显示(利福平耐药有:(株%G *4)F &-Q S R 和H I 1I 6J I K L 两种方法从同一例患者初诊痰样本与初诊痰培养阳性菌株中检测利福平耐药性结果符合率为,4*+)F (]1))
1值为)*4:((说明两种方法检测利福平耐药一致性较好-对于(3例Q S R 检测利福平与H I 1I 6J I K L 检测痰样本不一致的结果(本研究对其培养阳性菌株采用H I 1I 6J I K L 进行复测(除(株为混合生长(其余((株进行8#9法药敏检测-结果显示(利福平检测结果+种方法一致7株(:株不一致结果中(Q S R 检测结果利福平均为敏感'H I 1I 6J
I K L 检测结果为利福平耐药(均表现为J K &W I ;%G 3,"G ++&探针突变'8#9法3例表现为利福平敏感((例为低水平耐药((例为高水平耐药-3例Q S R 和8#9检测为利福平敏感而H I 1I 6J I K L 结果为耐药(可能是在")-,基因上发生了沉默突变而出现假阳性结果-有研究报道(在")
-,基因上发生沉默基因突变(这类基因不表达或低表达*(++(与利福平耐药无关-3例Q S R
检测利福平敏感而H I 1I 6J I K L 和8#9结果为耐药(是否为Q S R 检测利福平耐药性敏感度不高(将在今后的工作中进一步扩大样本量进行研究-对于复测的(3例H I 1I 6J I K L 出现7例前后结果不一致的结果(笔者认为有可能是由于两类样本的优势菌群不同而产生利福平耐药性检测结果的差异-赵冰等*(:+研究表明(标本中的结核分枝杆菌含量会影响
H I 1I 6J
I K L 检测利福平耐药的准确性-本研究结果显示(G 例G )((3)3(():+()!9?'1UR 1L 'L V W I K C !C L &W I K 3)3(X &>*:+T &/()
H I1I6J I K L检测痰标本中利福平敏感者菌株复测G例均为耐药(这G例患者中+例患者痰涂片结果仅为("3条-本研究未对全部入选的患者菌株进行复测(现有的数据还不足以证明以上结论(我们将在今后的工作中进行进一步探讨-综上所述(H I1I6J I K L和Q S R两种分子检测方法检测利福平耐药性总体符合率较高(但也可能存在漏检或过诊情况-因此(有条件的实验室可考虑引入其他分子检测方法以弥补上述方法的不足(为临床精准诊断和治疗提供准确可靠的实验室依据-
志谢!感谢上海市疾病预防控制中心郭俊涛副主任医师对本文统计学方法和结果的指导和审核-
参!考!文!献
*(+赵雁林(姜广路/痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册/北京!中国协和医科大学出版社(3)),!72((/
*3+赵雁林(逄宇/结核病实验室检验规程/北京!人民卫生出版社(3)(G!+,2::/
*++D&K>%E I=>L?!K Z=1'^=L'&1/DE!I1%&K0I01I BK=J'%L V W I K2
C V>&0'0L I0L/H I1I_=!D&K>%E I=>L?!K Z=1'^=L'&1(3)()/ *:+M?I K&1H(5'.I1=?Q(9?=1%=$(I L=>/P I=0'W'>'L Y(=C C V K=C Y( =1%C>'1'C=>I@@I C L&@J&'1L2&@2C=K I6J I K L8M N"O#P L I0L'1Z@&K L V W I K C V>&0'0'1J K'<=K Y2C=K I0I L L'1Z0'1R@K'C=!=<V>L'C I1L K I( K=1%&<'0I%(C&1L K&>>I%L K'=>/Q=1C I L(3)(:(+4+%,,(G&!:3:2 :+G/%&'!()/()(-"")(:)2-7+-%(+&-3)7+2G/
*G+彭英(苏欣(江琦(等/新型分子检测技术在基层实验室诊断肺结核的效能分析/中国防痨杂志(3)(,(:(%3&!(:G2(:4/
%&'!()/+,-,"./'001/()))2--3(/3)(,/)3/))G/
*-+王启明(朱帆(李青峰(等/6S I K L8M N"O#P与8H#M对结核菌检测及药敏的比较研究/临床肺科杂志(3)(,(3:%(3&!
33(42333(/%&'!()/+,-,"./'001/()),2---+/3)(,/(3/)(,/
*7+刘荣梅(马丽萍(高孟秋(等/6J I K L8M N"O#P与E='18M N2 $O J>V0检测技术快速诊断肺结核及其耐药性的临床应用价
值/中国医刊(3)(4(G+%G&!G G+2G G-/%&'!()/+,-,"./'001/ ())42()7)/3)(4/)G/)3:/
*4+陈蕾(吴桂辉/6J I K L8M N"O#P技术在诊断肺结核及利福平耐药的临床价值/临床肺科杂志(3)(,(3:%3&!3):23)7/%&'!
()/+,-,"./'001/()),2---+/3)(,/)3/))+/
*,+李静(桂晓红(孙丕(等/8H#M液体培养基检测分枝杆菌效果的评价/中华检验医学杂志(3)(((+:%3&!(((2((:/%&'!
()/+7-)"C<=/./'001/()),2,(G4/3)((/)3/)):/
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+442+,)/%&'!()/(+4,4"./C1A'/'001/()))233))/3)3)/)+/)34/ *(3+周秋菊(王冬莲(杨阳(等/四种检测方法在结核病诊断中的比较/中国现代医生(3)3)(G4%(-&!42(3((-/
*(++梁佳元(杨立军(刘敏(等/E='1和6J I K L8M N"O#P技术对结核分枝杆菌药物敏感性的检测/中国热带医学(3)(7((7 %+&!3-+23-G/%&'!()/(+-):"./C1A'/:-2()-:"K/3)(7/)+/(+/ *(:+赵冰(欧喜超(夏辉(等/6J I K L8L W"O#P检测技术在结核病诊断中的应用评价/中国防痨杂志(3)(:(+-%-&!:-32:--/ %&'!()/+,-,"./'001/()))2--3(/3)(:/)-/)((/
%收稿日期!3)3(2):23,&
%本文编辑!郭萌&
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