PCR-LDR-核酸试纸条检测法在结核分枝杆菌katG基因315位密码子突变检测中的应用
聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究
sistant strains of M 31 strains had KatG gene mutations, and with 66.0%(31/47) of mutaTB,
tion rate. 1 of 30 drug susceptibility MTB strains had KatG' gene mutation. Conclusions PCR- DNA sequencing is a seneitive, accurate and specific method for rapid detection of KatG genes mutations of MTB, and then for detecting the INH- resistant MTB.
4 1 勺
改良 罗氏培养基及药敏培养基自 配。
增均 性和阴 设阳 性对照。 (4)扩增产物2%琼脂糖 凝
方法:(1) 痰标本处理， 罗氏培养， 改良 绝对浓 度药敏试验， 菌型鉴定操作方法参照《 结核病诊断细 菌学检验规程沪。药敏培养基内含INH 为:高浓度
核分枝杆菌分离株中， 有31株KatG基因 检出有突变， 突变检出率为66.0%(31/47);30 株结核分枝杆菌敏 感 株检出1株KatG基因突变。结论 PCR- DNA测序技术方法敏感、 特异， 准确、 可快速检测结核分枝 杆菌KatG 耐药基因突变， 有利于耐异烟脱结核分枝杆菌耐药性的快速检测。 [关键词】分枝杆菌， 结核;耐异烟麟;KatG基因;聚 合酶链反应一 DNA测序 Rapid detection of the genomic mutations of W11- resistant mycobacterium tuber-
culosis by polymeri se chain reaction- DNA sequencing YU Ji, XIONG Guoliang, ZHANG
结核分枝杆菌耐药性检测
二、常用的MTB DST检测方法
（二）探针熔解曲线法
采用多色探针熔解曲线法快速检测MTB对RFP、INH、Sm、EMB和FQs 常见耐药决定区域，简便、快速，闭管检测不会交叉污染或造成实验室 污染，只需1台通用的荧光定量PCR仪，无需繁琐的杂交、显色过程，整 个检测过程只需2～3 h，可较全面地了解耐药基因突变信息，辅助诊断 MDR-TB和pre-XDR-TB（指对FQs或至少1种二线注射类药物耐药）；其 缺点是不报告具体的突变类型。
二、常用的MTB DST检测方法
分子DST方法
该方法是基于MTB对抗结核药物耐药分子机制，采用分子生物学技术检 测MTB的耐药基因型。分子DST已成为DR-TB的确诊方法之一，其建立 在基因扩增基础上，快速（2～48 h）、敏感地从MTB分离株或预处理的 临床标本（包括涂阴、培阴的标本）中检出MTB耐药基因突变；分子 DST只在初始阶段需要有较高的生物安全条件，标本消化处理和DNA提 取后标本的传染风险降低。
绝大多数常用的表型DST需要MTB纯培养物，MTB生长慢的特性决定了 该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导 致结果的不确定性，但该方法可检测多种抗结核药物的耐药性。
二、常用的MTB DST检测方法
（一）传统的DST方法
1.绝对浓度法（absolute concentration method）：将1 mg/ml菌悬液用生理 盐水倍比稀释至10^-2 mg/ml，吸取0.1 ml菌液分别接种于含高、低浓度药 液培养基和对照培养基上，置37 ℃培养4周，按下列方式报告菌落生长情 况：分枝杆菌培养阴性（－）：斜面无菌落生长；分枝杆菌培养阳性 （+）：菌落生长占斜面面积的1/4；分枝杆菌培养阳性（++）：菌落生 长占斜面面积的1/2；分枝杆菌培养阳性（+++）：菌落生长占斜面面积 的3/4；分枝杆菌培养阳性（++++）：菌落生长布满整个斜面；培养基斜 面上菌落数少于20个时，报告菌落数。
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展摘要】本文就报道的结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA、efpA、ini (A,B,C)及其突变位点进行综述。
【关键词】结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的慢性传染病。
随着耐药结核病，尤其是耐多药和广泛耐药结核病的出现，给结核病的防控工作带来了严峻挑战。
异烟肼是治疗结核病主要药物之一，但MTB耐异烟肼率已达17.6%，其耐药机制尚不明确，大多认为与MTB相关基因突变有关[1]。
本文综述目前国内外报道的MTB耐异烟肼相关基因及其常见突变位点，以进一步了解MTB耐异烟肼的发生机制。
1 katG基因异烟肼经MTB katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶活化后产生杀菌作用，katG突变使过氧化氢-过氧化物酶失活，导致MTB对异烟肼耐药。
KatG最常见突变位点是Ser315Thr。
Khadka JB等研究尼泊尔地区107例耐异烟肼菌株中，Ser315Thr及Ser315Ile突变率分别为77.6%及17.1%。
陈玲等研究显示Ser315Thr突变频率为66.7%[2]。
315位点还有Ser→Asn、Ser→Thr、Ser→Arg和Ser→Gly突变形式。
此外，还存在Val230Met、Pro232Gln、Gly237Glu、Gly309Cys、Asp304Glu、Asp357His、Asp357Asn、Arg463Leu、His276Met、Gln295His、Glu454Arg等突变[2-5]。
2 inhA基因inhA基因编码NADH依赖的enoyl-Acp还原酶，该酶催化α-不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸，产生的长链脂肪酸是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分。
异烟肼与分枝菌酸合成途径中的NADH依赖的enoyl-Acp复合体结合，阻断90%以上长链脂肪酸合成，从而抑制MTB生长。
一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及
专利名称：一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及其试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：刘利成,王华贵,邹弈君,陈璐
申请号：CN201811064273.7
申请日：20180912
公开号：CN109112226A
公开日：
20190101
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及其试剂，所述方法基于ARMS荧光定量PCR方法，在相同的反应体系中，分别使用针对所述耐药基因突变位点的突变型模板的ARMS引物和针对野生型模板的ARMS引物及它们共用的上游或下游引物，用突变型反应管与野生型反应管共两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过各个点突变在两个反应管中的荧光PCR的Ct值和ΔCt值的大小判定样本的基因型。
本发明的方法操作简便，可在短时间内通过多重检测，检出结核一线药物的主要耐药位点。
申请人：江苏宏微特斯医药科技有限公司,北京宏微特斯生物科技有限公司
地址：226400 江苏省南通市如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)
国籍：CN
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基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性
３期戎奇吉等：基因芯片快速检测结核分枝杆菌ｋａｔＧ基因突变及其与异烟肼耐药相关性２３５Ｐｒｏｂｅ－ＡＰｒｏｂｅ—ＢＰｒｏｂｅ－ＣＰｒｏｂｅ－ＤＰｒｏｂｅ－ＥＰｒｏｂｅ－ＦＰｒｏｂｅ－ＧＳ３１５Ｎ（ＡＧＣ）Ｓ３１５Ｎ（ＡＧＣ—ＡＡＣ）Ｓ３１５Ｔ（ＡＧＣ—－ＡＣＣ）Ｓ３１５Ｉ（ＡＧＣ—，ＡＴＣ）Ｓ３ｌ５Ｔ（ＡＧＣ—，ＣＧＣ）Ｓ３１５Ｒ（ＡＧＣ—ＡＧＡ）Ｓ３１５Ｇ（ＡＧＣ—，ＧＧＣ）５’一Ｔｔｓ—ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡ（ｊＣＧ（；ＣＡＴＣＧＡＧ一３７５’一Ｔｌ５一ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡ（｝３’５’一Ｔ１５一ＧＣＧＡＴＣＡＣ【：ＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧ一３’５’一Ｔｌｓ—ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＡ（｝３’５’一Ｔ１５一ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧ一３’５’一Ｔ１５一ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＡＧ一３’５＇－Ｔｌｓ一（ｊＣＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣ（二Ａ（｝３７—０．２％ＳＤＳ）混合，１００℃水浴变性５ｍｉｎ后立即冰浴５ｍｉｎ。
取１０肚Ｌ加至芯片杂交区，４２℃水浴１ｈ，然后用１×ＳＳＣ一０．２％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ依次漂洗１ｒａｉｎ，室温中晾干。
用ＧｅｎｅｐｉｘＰｒｏ４００００Ｂ扫描仪扫描杂交后的芯片，检测波长为５３２ｎｍ（Ｃｙ３），分辨率为ｉ０＂ｍ，电压为５５０Ｖ，ＰＭＴ设为１０％。
扫描后的图象采用ＧｅｎｅＰｉｘＰｒ０４．０软件进行分析¨８｜。
野生型探针杂交荧光信号平均值／突变型探针杂交荧光信号平均值＞３结果判定为无突变的野生型，突变型探针杂交荧光信号平均值／野生型探针杂交荧光信号平均值＞３结果判定为突变型。
２结果２．１结核分枝杆菌对ＩＮＨ耐药率结核分枝杆菌Ｈ。
，Ｒｖ株对ＩＮＨ敏感，其ＭＩＣ值为０．０５ｍｇ／Ｌ。
１２３株结核分枝杆菌临床菌株中，３９．０％（４８／１２３）菌株对ＩＮＨ敏感，其ＭＩＣ值范围为０．０２５～０．１ｍｇ／Ｉ。
某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析
某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析杨辉;张国良;张明霞;陈心春;陈建波;吴爱武【摘要】目的了解深圳地区结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼的耐药相关基因的突变特点.方法 60株结核分枝杆菌临床分离株通过全自动快速分枝杆菌培养鉴定系统(BACTEC-MGIT960)进行鉴定和药敏分析.在这60株菌株中,针对包括利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因和异烟肼耐药相关位点katG315、inhA-15、kasA269、kasA312进行PCR扩增,并将扩增产物T-A克隆后进行测序.结果在60株结核分枝杆菌临床分离株中,检出利福平耐药株45株,敏感株15株;异烟肼耐药株41株,敏感株19株;利福平和异烟肼同时耐药的有14株.在45株利福平耐药株中,rpoB基因RRDR突变发生率为91.1%(41/45),共检测到12种突变形式,主要突变位点在531、526、516、533,以Ser531Leu突变最常见,占rpoB 发生基因突变株的51.2%(21/45).在41株异烟肼耐药株中,katG315位点有29株发生突变,包括28株katG315(AGC-ACC)和1株katG315(AGC-AAC)突变,突变发生率为70.7%(29/41);inhA-15位点有9株发生突变,均为(C-T)突变,突变发生率为21.95%(9/41).kasA基因未发现常见突变形式.结论深圳地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变位点与国内外研究基本一致,但各位点频率有所不同.%Objective To investigate the characterization of gene mutation in Rifampin and Isoniazid resistant Mycobacterium tu berculosis isolated from Shenzhen. Methods 60 Mycobacterium tuberculosis clinical strains were identified and their drug resistance in phenotype were tested by BACTEC MGIT960 ,rpoB,katG315 ,inhA 15,kasA269 and kasA312 genes were amplified by PCR and the fragments were cloned into T vector andsequenced. Results Among the 60 Mycobacteria tuberculosis clinical strains,45 rifam picin resistant strains and 15 rifampicin susceptible strains;41 isoniazid resistant strains and 19 isoniazid susceptible strains;14 mul tiple drug resistance strains were detected. About 91. l%(41/45) of Mycobacterium tuberculosis isolates in 45 rifampicin drug re sistant strains has mutations in rpoB and there were 12 different mutations,gene locus 531,526,516,53s mutation had a higher fre quency especially gene locus 531 which had 51. 2 % (21/41) of mutational rate in 41 strains with rpoB gnen mutation. Point muta tions at gene locus katG315 includingkatG315(AGC ACC)in 28 isoniazid resistance strains and katG315(AGC AAC) in 1 isoniazid resistance strain,were found in 70. 7%(29/41) of isoniazid resistant strains. 21. 95%(9/41) of Mycobacterium tuberculosis isonia zid resistant strains had inhA 15(C T) mutations, no mutation in kasA was found in the study. Conclusion Ompared with other studies,the mutational gene site of Mycobacterium tuberculosis isolates with drug esistance of rifampicin and isoniazid in Shenzhen were consistant,but the gene mutation frequency in common gene locus of drug esistance were different.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2012(041)034【总页数】3页(P3591-3593)【关键词】分枝杆菌,结核;药物耐受性;突变【作者】杨辉;张国良;张明霞;陈心春;陈建波;吴爱武【作者单位】广州医学院医学检验系,510182;广东省深圳市第三人民医院肝病研究所,518112;广东省深圳市第三人民医院肝病研究所,518112;广东省深圳市第三人民医院肝病研究所,518112;广东省深圳市第三人民医院肝病研究所,518112;广东省深圳市第三人民医院肝病研究所,518112;广州医学院第一附属医院检验科,510120【正文语种】中文结核病是严重危害人们身体健康的重大公共卫生问题，根据世界卫生组织（WHO）报告，全球将近1／3的人口曾经或正在感染结核分枝杆菌，每年约900万人发展为活动性结核病，近300万人会发展成为耐多药结核病，并有180万人死于该病。
荧光聚合酶链反应熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌及异烟肼耐药突变的临床应用价值
荧光聚合酶链反应熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌及异烟肼耐药突变的临床应用价值阳央;冯智;侯欢;李芳芹【摘要】目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌复合群(MTBC)及异烟肼耐药突变的临床价值.方法对延安市传染病医院2018年4-12月住院的370例肺结核患者痰标本采用MGIT320进行MTBC培养及药敏试验,同时应用荧光PCR熔解曲线法进行MTBC和异烟肼耐药突变检测,对检出MTBC 的差异进行分析,以培养法药敏为金标准,评估熔解曲线法耐药突变检测的灵敏度、特异度、一致性等.结果 370例患者培养法检出MTBC 175株,阳性率47.3％,熔解曲线法检出157株,阳性率42.4％,两种方法检测的结果差异无统计学意义(P=0.073),一致性中等(Kappa=0.510);同时与有异烟肼药敏结果的115株进行比较,熔解曲线法灵敏度95.0％,特异度93.7％,与培养法结果比较差异无统计学意义(P=0.125),具有高度一致性(Kappa=0.807).结论熔解曲线法试剂盒可用于结核菌快速筛查及耐药突变检测,对异烟肼耐药突变检测具有高灵敏度和特异度,有助于缩短耐药结核病诊断时间.【期刊名称】《中国感染与化疗杂志》【年(卷),期】2019(019)004【总页数】5页(P405-409)【关键词】结核分枝杆菌;熔解曲线法;快速检测;异烟肼耐药突变【作者】阳央;冯智;侯欢;李芳芹【作者单位】延安大学医学院研究生系,陕西延安716000;延安市传染病医院检验科;延安市传染病医院检验科;延安大学附属医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R378.911;R978.3结核病是危害人类健康的古老疾病，至今仍是全球十大死亡原因之一。
据世界卫生组织2018年全球结核病控制报告，2017年中国新发结核病患者占世界的9%，平均感染人数63/100 000，位居全球第二，也是耐药结核病发生最多的三大国家之一；耐多药/利福平（RIF）耐药结核病平均发生数5.2/100 000 [1]，一例未治疗的耐药结核菌感染患者每年可以传染10～15个人，耐药结核病已成为全球结核病死灰复燃的重要原因，严重威胁公共卫生健康 [2]。
扬州市结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变分析
扬州市结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变分析摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG和inhA的突变特征。
方法：利用基因芯片检测505例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株异烟肼耐药基因，分析本地区katG和inhA基因突变特征。
结果：katG基因315位点突变频率为79%（83/105），inhA -15位点突变频率为22.9（24/105），其中katG基因315位点联合inhA -15位点突变频率为2%（2/105）。
结论：本地区MTB对异烟肼耐药基因突变中katG 315（AGC→ACC）为最主要突变类型，inhA-15（C→T）次之。
【关键词】结核分枝杆菌；异烟肼；基因突变【中图分类号】R378.911 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）30-0313-02异烟肼（INH）对结核分枝杆菌（MTB）具有较强的杀菌作用，是治疗结核病重要的一线药物。
近些年，INH的耐药率逐渐上升，全国抽样调查显示我国INH耐药率已达17.6%，属高耐药国家。
INH的耐药主要是由于基因突变造成，主要跟下列基因改变有关：过氧化氢一过氧化物酶基因katG、烯酸基载体蛋自还原酶基因inhA、NADH脱氢酶基因ndh、酮酸基酸基转移蛋自酶基因kasA、烷基过氧化氢酶基因ah-pC等[1]。
本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。
1.资料与方法1.1 一般资料收集我院2017年经传统固体培养，并经鉴定为结核分枝杆菌的菌株共505例。
1.2 仪器与试剂仪器：基因芯片检测配套仪器由北京博奥生物有限公司提供。
试剂：传统培养和鉴定试剂由珠海贝索生物有限公司提供，基因芯片试剂由北京博奥生物有限公司提供。
基因芯片检测katG基因315（AGC→ACC、AGC→AAC）和inhA -15（C→T） 3个突变位点。
1.3 方法1.3.1痰液化处理将痰标本用4%的氢氧化钠（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接种固体培养基和核酸提取。
结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因及分子检测方法研究进展
结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因及分子检测方法研究进展李芊璘;冯福民;戴二黑【摘要】结核病是一种慢性感染性疾病.我国作为结核病的高负担国家,其高发率已成为严峻的公共卫生问题.异烟肼作为治疗结核病的重要一线药物之一,由于其治疗管理不规范等原因导致临床患者耐药日益严重.目前已知异烟肼最主要的耐药机制是基因突变,如何准确有效地检出耐药基因,是控制结核病的关键.本文从分子角度分别阐述了异烟肼常见耐药基因katG、inhA、ndh、ahpC、oxyR,以及罕见突变基因kasA、sigI、furA、mabA、iniABC、efpA,并针对其检测方法作了概述.%Tuberculosis is a chronic infection caused by Mycobacterium tuberculosis. The high financial burden and high incidence rate of tuberculosis have become a critical public health problem in China. Isoniazid, as one of the important first-line drugs in the treatment of clinical patients, drug resistance is becoming increasingly serious because of the lack of standard treatment. At present, the main mechanism of isoniazid resistance is known as gene mutation. How to detect drug resistance gene effectively and accurately is the key to control tuberculosis. In this article, we analyzed the frequent genes (katG, inhA, ndh, ahpC and oxyR) and novel genes (kasA, sigI, furA, mabA, iniABC and efpA) from the perspective of molecular biology, and summarized their diagnostic methods.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2017(045)012【总页数】4页(P1341-1344)【关键词】分枝杆菌,结核;异烟肼;耐药基因;分子检测;综述【作者】李芊璘;冯福民;戴二黑【作者单位】华北理工大学公共卫生学院 063210;华北理工大学公共卫生学院063210;华北理工大学附属石家庄市第五医院【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一种具有潜在致命性的慢性传染病，其中以肺结核最为常见。
PCR 直接测序法分析结核分枝杆菌katG 基因突变Ξ
文章编号:10012764X(2000)0120009203PCR直接测序法分析结核分枝杆菌kat G基因突变Ξ吴雪琼1,钟敏1,张俊仙1,俞伟2,张军芝3,庄玉辉1,贾树林3(11解放军三○九医院结核病研究室,北京100091;21山西省长治医学院附属医院传染科;31解放军三○九医院放射科)摘要:为了了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼(I NH)分离株katG基因突变情况,研究其临床意义。
本研究通过聚合酶链反应(PCR)、PCR2单链构象多态性(SSCP)和PCR直接测序法(direct sequencing,DS)分析92株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。
以H37Rv标准株为对照,23株药物敏感株中,21株katG基因SSCP分析正常,2株异常。
36株耐非I NH药物的分离株中,20株katG基因SSCP正常,16株异常。
33株耐I NH分离株中,高度耐I NH的17株,其中4株为katG基因缺失, 5株katG SSCP异常,8株正常;低度耐I NH的16株,其中13株K atG基因SSCP异常,3株正常。
上述所有katG SSCP异常的分离株DS分析均为315位密码子突变,除1株为AG C→AAC突变外,其余均为AG C→ACC突变。
结果表明katG基因突变是结核分枝杆菌耐I NH产生的主要分子机制,其最常见的315位密码子突变可引起结核分枝杆菌轻度或中度耐I NH。
关键词:结核分枝杆菌;药物耐受性;聚合酶链反应;DNA序列分析中图分类号:R3781911;Q781; 文献标识码:A 异烟肼(I NH)是防治结核病的一线药物,最近的研究[1,2]表明过氧化氢酶2过氧化物酶编码基因(katG)改变是结核分枝杆菌耐I NH的主要分子机制。
过氧化氢酶2过氧化物酶可能在细胞内将I NH 氧化成异烟酸,成为尼克酸的类似物,参与辅酶I (NAD)的合成,使其不能起同功酶的作用,而抑制细胞壁分枝菌酸的生物合成,使分枝杆菌抵抗氧化和侵袭的屏障受到损害。
核酸试纸条法检测结核分枝杆菌的初步研究
46
中国口岸科学技术
表 1 实验用样本来源和用途 Table 1 Source and use o f samples for testing
序号 材料编号
菌株类型
来源
用途
质粒合成信息见表2。
表2 试验构建的质粒信息 Table 2 Plasmid information o f experimental construction
13 结核1号
结核分枝杆菌
临床试验
14 结核2号
特异性试验
6 ATCC22019 近平滑念珠菌
特异性试验
7
160735
堪萨斯分枝杆菌
特异性试验
8
160432
鸟胞内分枝杆菌
特异性试验
9
160741
脓肿分枝杆菌
特异性试验
10
160373
龟分枝杆菌
特异性试验
11
草1
12
160918
草分支杆菌 瘰疬分枝杆菌
杭州市疾控预 特异性试验 防控制中心 特异性试验
层 析 试 纸 条 用 于 检 测 核 酸 ，在 检 测 细 菌 病 毒 领 域 也 有 了 探 索 和 发 展 。2 0 1 9 年 ， Claudia Kolm等学者 开发了一种用于检测拟杆菌门粪便反刍动物相关遗传 标 记 （16S rRNA ) 的 HDA-strip检测方法。该方法不 需 要 高 端 的 PCR/qPCR仪 器 ，解决了 PCR技术的一 些 局 限 性 问 题 [101。同年，Zhao-HuaWang等建立了用 横 向 流 动 试 纸 快 速 检 测 猫 细 小 病 毒 （FPV) 的重组酶 聚合酶扩增方法。重 组 酶 聚 合 酶 扩 增 （ RPA ) 作为一
结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变位点的检测及诊断抗原的筛选
结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变位点的检测及诊断抗原的筛选结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，而在近年来的临床实践中，出现了越来越多的耐药株，给防治工作带来了严峻的挑战。
因此，对结核分枝杆菌耐药基因突变位点的检测以及诊断抗原的筛选显得尤为重要。
结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制是由其内部存在的不同基因突变引起的。
研究人员通过对大量耐药结核株的基因组测序，发现了一系列与耐药性相关的突变位点。
这些位点的突变可以导致结核分枝杆菌对一线抗结核药物如利福平、异烟肼等的耐药性增加。
因此，通过检测这些位点的突变情况，可以有效地判断结核分枝杆菌株的耐药性，为个体化治疗方案的选择提供依据。
目前，结核分枝杆菌耐药基因突变位点的检测主要依赖于分子生物学技术，例如PCR（聚合酶链式反应）和测序技术等。
通过PCR扩增耐药基因突变位点的特定区域，并经过测序分析，可以确定结核分枝杆菌株的耐药性状况。
这种技术具有快速、准确、灵敏的特点，在临床应用中取得了较好的效果。
另一方面，诊断抗原的筛选也是研究的热点之一。
目前，结核分枝杆菌的诊断主要依赖于病原体的培养和检测。
然而，传统的培养方法需要较长的时间，且操作繁琐，不能满足临床对快速准确诊断的需求。
因此，寻找新的诊断抗原成为了研究的重点。
通过对结核分枝杆菌全基因组的筛选，研究人员发现了一些与结核分枝杆菌感染相关的蛋白质，它们被认为可以作为结核分枝杆菌的特异性抗原。
这些抗原可以通过免疫学方法进行检测，具有快速、准确的优势。
目前，结核分枝杆菌促进因子A（Ag85A）和结核分枝杆菌促进因子ESAT-6等抗原已经被广泛应用于结核病的诊断，取得了较好的效果。
然而，仍然存在一些挑战，例如耐药基因突变位点的多样性以及抗原的敏感性和特异性等问题。
因此，研究人员需要继续深入研究，不断探索新的检测方法和筛选出更加敏感、特异的诊断抗原。
综上所述，结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变位点的检测以及诊断抗原的筛选是结核病防治工作中的重要部分。
分析基因芯片法检测耐多药结核分离株的临床意义
分析基因芯片法检测耐多药结核分离株的临床意义发表时间：2017-04-19T14:00:55.853Z 来源：《健康世界》2017年第4期作者：程峰[导读] 分析基因芯片法检测耐多药结核分离株的临床意义。
黑龙江省绥化市人民医院黑龙江绥化 152062摘要：目的：分析基因芯片法检测耐多药结核分离株的临床意义。
方法：采用分层抽样检测方法从上海同济大学附属上海市肺科医院、北京胸科医院、广州市胸科医院的临床菌株库中的敏感组和耐药组，随机抽取耐药株利福平400株，异烟肼363株．耐多342株，利福平／异烟胼双敏感180株。
用基因芯片法检测基因的511、513、516、526、531、533位点、katG的315位点以及inhA的-15位点的耐药突变。
计算出基因中的芯片法的特异度、敏感度以及符合率。
还要对核酸扩增产物进行测序，通过验证基因芯片对核酸序列检测的准确性。
结果：在利福平基因芯片检测中，突变频率最高的位点是531，突变率为63.4％。
在katG／inhA突变菌株中，基因芯片检测为ktG 315单突变的为76．3％。
与测序结果基本一致，有4例菌株中不相符。
结论：基因芯片法能够检测结核临床分离株利福平和异烟肼的耐药性．可以在临床诊断中应用。
关键词：结核抗药性细菌基因芯片检测Clinical significance of detection of multi drug resistant Mycobacterium tuberculosis by cDNA microarray Cheng Feng（Suihua People's Hospital，Heilongjiang，Suihua，152062）【Objective】 to analyze the clinical significance of the detection of multi drug resistant Mycobacterium tuberculosis by gene chip method. Methods：using stratified sampling method to detect sensitive group and resistant group from Tongji University affiliated Shanghai Shanghai Pulmonary Hospital，Beijing Thoracic Hospital，Guangzhou chest hospital clinical strains in the library were randomly selected from 400 strains of isoniazid rifampicin resistant strains，363 strains of resistant strains. 342，Lee Fu Ping / isonicotinic double sensitive strain 180. Gene chip method was used to detect 511，513，516，526，533，，katG，and -15 sites of inhA gene. The specificity，sensitivity and coincidence rate of the microarray method were calculated. Nucleic acid amplification products were also sequenced to verify the accuracy of nucleic acid sequence detection. Results：in the RFP gene chip detection，mutation is the highest frequency of 531，the mutation rate was 63.4%. In the katG / inhA mutant strains，the gene chip was detected as ktG 315 single mutation of 76.3%. The results were consistent with the sequencing results，and there were no match for 4 strains. Conclusion：the detection of Mycobacterium tuberculosis resistance in clinical isolates of rifampicin and isoniazid to gene chip can be applied in clinical diagnosis.[Key words] tuberculosis；resistant；bacteria；gene chip detection结核病是能够威胁公共安全的传染病之一。
等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因
等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因彭婉婵;刘文恩;谭耀驹;胡可;蔡杏珊;胡族琼;李艳冰【摘要】目的建立一套同步检测结核分枝杆菌(MTB)常见耐药突变基因的等位基因特异性PCR (AS-PCR)检测体系,以间接判断对利福平(RFP)与异烟肼(INH)的耐药性.方法用AS-PCR技术同步检测58株MTB临床分离株rpoB基因516位、526位和531位,katG基因315位及inhA基因-15位密码子突变,并与DNA测序结果进行比对.结果 AS-PCR法对RFP耐药株检出率为95.1％ (39/41),其中rpoB 基因531位、526位、516位点突变分别检出28株、10株、2株,包括531位与526位联合点突变1株；未检出突变的2株RFP耐药株经测序验证1株未发生突变、1株发生533位点突变；RFP敏感株均未检测到突变.AS-PCR法对INH耐药株检出率为86.5％(45/52),其中katG基因315位点突变43株、inhA基因-15位点突变2株,未检出突变的7株INH耐药株经测序验证未见突变；INH敏感株均未检测到突变.结论等位基因特异性PCR能够快速检测MTB常见突变基因,具有较高的敏感性与特异性,快速经济、操作简便.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(031)004【总页数】4页(P249-252)【关键词】结核分枝杆菌;rpoB基因;katG基因;inhA基因;等位基因特异性扩增【作者】彭婉婵;刘文恩;谭耀驹;胡可;蔡杏珊;胡族琼;李艳冰【作者单位】中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;广州市胸科医院检验科,广州510095;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;广州市胸科医院检验科,广州510095;广州市胸科医院检验科,广州510095;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1;Q503传统药敏试验(绝对浓度法和比例法)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)耐药性检测的金标准，方法成熟可靠，但繁琐、耗时，难以满足临床对耐药结核病诊治的需求。
聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究
聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究予季;熊国亮;张慧慧;刘珍琼【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2007(025)006【摘要】目的应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值.方法 47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变.结果 47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变.结论 PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测.【总页数】3页(P549-550,568)【作者】予季;熊国亮;张慧慧;刘珍琼【作者单位】330006,南昌,江西省胸科医院;330006,南昌,江西省胸科医院;330006,南昌,江西省胸科医院;330006,南昌,江西省胸科医院【正文语种】中文【中图分类】R446.5;Q754;R378.91【相关文献】1.武汉地区耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株katG基因突变的分子特征分析 [J], 马峻;陈高瞻;董洁莉;袁红梅;芦莲;朱才会;余晓丽2.基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性 [J], 戎奇吉;吕火祥;孙爱华3.耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的研究 [J], 陈杨;陈玲;张泓;王建华;李娜娜;李开伦;甘辛;张建勇4.耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究 [J], 霍亚楠;葛超荣5.结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测 [J], 程晓东;别良峰;苏明权;段艳;岳乔红;杨柳;张建芳;刘家云;郝晓柯;于文彬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用PCR-RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变
应用PCR -RFLP 分析结核分枝杆菌rpsL 基因突变吴雪琼3 张俊仙3 庄玉辉3摘要 目的 了解结核分枝杆菌链霉素(SM )耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。
方法 通过PCR -RFL P 分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL 基因突变的部位和性质。
结果 以H 37R V 标准株为对照,13株敏感株的rpsL 基因有Mbo Ⅱ酶切位点;37株耐SM 分离株中,31株(8318%)无Mbo Ⅱ酶切位点;12株耐其它抗结核药物株中,也有2株无Mbo Ⅱ酶切位点。
结论 大多数结核分枝杆菌SM 耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL )第43位密码子有点突变。
PCR -RFL P 可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法。
关键词 分枝杆菌,结核 药物耐受性 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性Analyzing the mutations of rpsL gene in Mycob acterium tuberculosis clinical isolates b y PCR -RF LPW U X ueqiong ,ZHA N G J unxian ,ZHUA N G Y uhui.Tuberculosis Research L aboratory ,The 309th Hospital ,Beijing 100091.Abstract Objective To observe the mutations of rpsL gene in M.tuberculosis stre ptomycin -resistant iso 2lates ,and to develop a new method for detecting drug resistance.Method Analyzing the mutations of rpsL gene codon 43in M.tuberculosis clinical isolates with PCR -RFL P.R esults M.tuberculosis strain H 37R V was used as a control.The rpsL gene fragments from 13drug -sensitive strains could be digested by restriction endonuclease Mbo Ⅱ.31(83.8%)of 37streptomycin resistant strains were not restricted by Mbo Ⅱ.2of 12non -streptomycin -resistant strains hadn ’t also sites of Mbo Ⅱ.Conclusions Most M.tuberculosis streptomycin -resistant strains could be observed the mutations situated at codon 43of genes encoding the ribosomal S12protein (rpsL ).PCR -RFL P might become a simple ,rapid and reliable means of detecting drug resistance in clinical isolates.K ey w ords M.tuberculosis Drug resistance polymerase chain reaction Restriction fragment length polymorphism3 解放军309医院结核病研究室,北京 100091 近年来,随着分子生物学技术的发展和结核分枝杆菌基础研究的深入,抗结核药物耐药的分子机制研究也取得了一定的进展,应用分子生物学技术检测结核分枝杆菌耐药基因,很可能成为一种新的结核分枝杆菌耐药性测定方法,它只需2～3天时间,与经典的方法相比大大缩短了时间,从而能够为临床治疗的用药选择提供依据,有利于开展更有效的化疗。
结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测
结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测宋阳;韩中波;于宏波【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2006(010)011【摘要】近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。
作为一线抗结核药物，INH 和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。
但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。
有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。
我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。
因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。
再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。
我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下：【总页数】2页(P1352-1353)【作者】宋阳;韩中波;于宏波【作者单位】吉林省中医院,检验科,吉林,长春130000;吉林市结核病防治研究所,检验科,吉林,吉林132011;吉林省中医院,检验科,吉林,长春130000【正文语种】中文【中图分类】R4【相关文献】1.中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测 [J], 包洪;于庭;印璞;刘爱忠;张吉平2.基因芯片方法快速检测MDR-TB及利福平和异烟肼耐药基因的研究 [J], 张海英;高会霞;许怡3.结核分支杆菌利福平和链霉素耐药基因的快速检测 [J], 张小刚;何秀云;陈红兵;李书琳;张永胜;张晓娟4.不同引物标记物在显色法芯片检测结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因中应用比较 [J], 郭乃洲;王万相;严爱华;马达;周步全;景奉香5.应用等位基因特异性扩增法快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性 [J], 范小勇;徐帆洪;胡忠义;赵春女;李忠明;郭盛淇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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测。方法 设 计与合成用于检测 ｋｔ 因 ３ ５ ａ Ｇ基 １ 位密码子单碱基突变 的引物和探 针 ， 通过 Ｌ Ｒ反 应 ， Ｄ 使用 核酸检测试 纸条检 测 结果 ， 并与 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ — Ｆ Ｐ法及直接测序法相 比较。结果
果呈高度一致性 ， 符合率分别为 ９ ． ％ 和 １０ 。结论 ７５ ０％ 分子诊断方法 。
成功区分各突变类 型及野生 型 ， Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ 法及 直接测序 法的检测 结 与 Ｃ —Ｆ Ｐ
将为 ｋｔ ａ Ｇ基因 ３５位密码子单 碱基 突变 的检测 提供一种 快速廉价 的 １
【 关键词】 结核 ；ａ ３ ５；Ｌ Ａ； ｋｔ １ Ｐ Ｎ 异烟肼 ； Ｇ 耐药性
临床肺科杂志 ２ １ 年 １ 月 第 １ 卷第 １ 期 ０１ １ ６ １
１２ ７１
Ｐ Ｒ－ ＤＲ－ 酸试 纸 条 检 测 法在 结核 分 枝杆 菌 Ｃ Ｌ 核
ｋｔ ａＧ基 因 ３ ５位 密 码 子 突变 检 测 中的应 用 １
贾子冬 徐 高连 钟华 燕 王宏 莹 尤其敏 石 坚 马 玉霞 胡林 朱金玲
【 ｅ ｏｄ Ｔ ； ａ ３ ５ Ｐ Ｎ Ｉ Ｈ； ｒ —ｅｉａｔ Ｋ ｙ ｒ 】 Ｂ ｋｔ １ ； Ｌ Ａ； Ｎ Ｄｕ Ｒ ｓ ｔ ｗ Ｇ ｇ ｓｎ
异 烟肼 （Ｎ 作为一 线抗 结核 药物被 广泛 的应 用 ， 长 Ｉ Ｈ） 但 期 的使 用也导致 了耐药性 的产生 ＿ 。Ｔ ３ Ｂ对 Ｉ Ｈ的耐 药性 主 Ｊ Ｎ 要 与 ｋｔ 基 因 的 突 变 有 关 ， 其 是 ３ ５位 密 码 子 的 突 ａ Ｇ 尤 １ 变 。其 中 ， 为常见 的突变类型为 Ａ Ｃ－Ａ Ｃ ６ ． ％ ） 最 Ｇ －￣Ｃ （ ２ ０ －
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