脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化

脂肪来源干细胞
脂肪来源干细胞
脂肪来源干细胞的命名
脂肪来源血管基质成分
(Stromal Vascular Fraction,SVF) 富含大量的CD34+细胞, 从脂肪组织直接获得
脂肪来源干细胞
(Adipose Derived Stem Cell, ADSC)
富含一定量的CD34+细 胞,SVF培养P0-P2
脂肪来源间充质 干细胞(ADSC) 血液来源间充质 干细胞(PBMSC)
自体应用无免疫排斥反应
采集安全, 对病人造成痛苦少， 来源广泛（血液干细胞库）
脂肪酸转运蛋白(FA)、类胰岛素生长因子-1（IGF-1)及其受体在此阶 段也有表达。
脂肪干细胞成脂分化
脂肪细胞分化过程中，其细胞形态、膜表面蛋白、胞质内容物和基因表达均发 生了极大的改变。可以根据这些变化来判定脂肪细胞的分化状态。
(1)细胞形态。脂肪细胞贴壁后最初为小圆形，核／浆比例增大，4d后即可观察到细胞渐成梭 形，7d后梭形细胞扩大增殖，开始积聚脂肪颗粒，9d时可观察到细胞由梭形渐变成椭圆形， 积聚有脂肪颗粒的细胞增多。到2周时分化成多脂滴或单脂滴的细胞。 (2)脂肪细胞内的脂肪含量。对前脂肪细胞分化结果的定性研究一般采用油红 O或甲烯兰染色， 一般来说，前脂肪细胞在培养的前3d即开始有脂肪的积聚，1周后积聚量明显增高，2周后达 到高峰。 (3)脂肪细胞分化不同时期的标志物。细胞开始分化后，随时间的推移出现PobmRNA 以及 LPLmRNA这两种转化早期的标志物，其中前者是体内及体外脂肪状态的独特标志物，此时 如果外界条件改变，解除了这种生长停顿，则前脂肪细胞的早期标志物消失，重新出现生长 和增殖，DNA合成增加。否则，将出现磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物，并最终 变成脂肪细胞。除了上述分化标志外，脂肪细胞在分化过程中还表达其他的标志物，如早期 标志物FA transport，中期标志物FAS、HSL、ACC、aP2、GPAT、GDPH，晚期标志物 ACBP、Leptin。可以用PCR技术检测这些物质的mRNA来判断脂肪细胞的分化阶段。
不同的试验结果结果有不同，但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正 化方法不同，以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的 来说，PAL细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。
脂肪干细胞的体外培养
脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进 行体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾 去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除 去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物 。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代 后的细胞称为脂肪干细胞。平均每300mL脂肪组织可获得2×108～ 6×108 个这样的细胞。 体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来 源和质量有严格要求，DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培 养基。一般只添加体积分数为10％的胎牛血清，并且血清无生产批号 限制。在传代培养中，平均倍增时间为60h。并表现低水平衰老，1代 时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5％细胞出现衰老，15代时衰 老细胞比例仍低于15％，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培 养易于获得大量有分化能力的细胞。
脂肪来源间充质干细胞 (Adipose Derived Msenchymal Stem Cell, AD-MSC(ASC))
不富含CD34+细 胞,SVF培养P2之后
脂肪干细胞的鉴定
在缺少分化刺激因子的条件下，ASC表面标志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、 CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、 CD166； 经过14d的诱导培养后, ASC虽然发生了形态变化，表现出成脂细胞、成软骨细 胞、成骨细胞等分化的特征，但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致，这些 表面蛋白与BMSC的表面蛋白很相似。 ASC和BMSC均表达CD13、CD29、CD44、CD105，均不表达CD31、CD34、 CD45、HLA-DR。虽然从分子标识上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子 和受体分子，但两者仍有区别。ASC表达CD49d，而不表达CD106，BMSC则 相反，造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。 间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检 测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。
脂肪干细胞生物学特性
2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细 胞，因其与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞 （ASC）。 脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等 多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。因脂肪干细胞具有 分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点，目前 脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。 Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维 细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自 间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中 的含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步确认和识别真正 的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
因此，脂肪干细胞具有用于脂肪组织工程所需细胞的理想特 性。以脂肪干细胞作为种子细胞的脂肪组织工程有望在乳房 再造术、除皱术及凹陷畸形矫正术中发挥作用。
几种间充质干细胞的比较
不同部位成体 干细胞来源
骨髓来源间充质 干细胞(BMSC)
优点 自体应用无免疫排斥反应
缺点
获取细胞对病人造成的痛 苦大, 来源于自体（来源受 限）, 被感染等不安全因素； 细胞相对扩增能力与患者 的年龄有关，越小越好； 获取细胞对病人造成的痛 苦大, 来源于自体（来源受 限）, 被感染等不安全因素； 含量少，临床应用受限； 细胞扩增能力较差；
脂肪干细胞成脂分化
ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞，长期培养仍可维持此种分化能力。 脂肪细胞分化过程大致如下： （1）脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化，形成脂肪母细胞（一种尚未出现脂滴的 梭形细胞）；（2）脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖，形成前体脂肪细胞 （此时细胞刚开始出现脂滴）；（3）前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖 和一系列基因表达的变化，形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞（内含大量小脂 滴）；（4）多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积，小脂滴逐渐汇集成一个大 脂滴充满脂肪细胞的大部分，形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞，成为成熟的脂 肪细胞。
脂肪干细胞临床应用优越性
ASC与其它来源干细胞相比有显著的优越性： • 脂肪是人体来源最丰富的组织。相对于人体其它组织，脂肪干细胞更 易于通过脂肪抽吸术等方式大量获得，患者的痛苦小，不会对人体产 生明显的生物学和解剖学不良后果。研究发现250～500mL脂肪抽吸组 织可产生超过108个细胞。 • 来自自体，具备免疫相容性，不会产生排斥反应和伦理学问题。 • 与骨髓干细胞不同, 脂肪干细胞的生长和增殖不需要特殊血清，并且在 体外增殖速度快，不必进行永生化处理就能获得足够的细胞用于移植， 这为临床移植提供了充足的细胞来源。
脂肪干细胞成脂分化
目前已鉴定出的对前脂肪细胞增殖和分化有直接影响的转录因子 主要有： 过氧化物酶增殖体（PPARs）——在前脂肪细胞的成脂分化中起主要 调控作用；CCAT增强子结合蛋白（C／EBP）与ADD-1——可启动和 维持前脂肪细胞向脂肪方向分化，PPARs与配体结合激活脂肪发育过 程中关键基因的转录；
脂肪干细胞的应用
目前，将脂肪干细胞应用于脂肪组织工程的研究刚刚兴起，研究还都处于细胞 和实验动物阶段，还没有体外构建的脂肪组织在体内稳定长期存在的报道。 当前，脂肪干细胞应用于脂肪组织工程主要有两种方式：⑴用脂肪干细胞体外 扩增一定量的细胞数后结合适当的支架材料和一定的生物活性物质应用于患者；⑵ 用脂肪干细胞体外构建脂肪组织后移植。有研究者利用脂肪生成所需的环境和细胞 因子吸引、招募和趋化周围的脂肪干细胞，在原位诱导分化成脂肪组织。 举例： Kimura等将Matrigel凝胶和FGF-2细胞生长因子一起注射到大鼠的皮下组织， 以吸引邻近的结缔组织中脂肪干细胞迁移过来形成新的脂肪组织，但仅有微小的脂 肪组织生成。 Cho等将改进性能的PLGA支架材料做成中空的圆顶状，移植入裸鼠的皮下，随 后将包被有脂肪干细胞的纤维蛋白凝胶注射于其中，6周后发现有脂肪组织形成， 而且支架结构完好稳定。但目前尚未发现脂肪组织存活更长时间的实验报道。究其 原因，可能是脂肪干细胞的数量、支持材料的生物相容性和促进脂肪细胞生成的微 环境影响了工程化脂肪组织的长期稳定存在。——种子细胞数量不足！
பைடு நூலகம்
脂肪来源干细胞临床实验
脂肪干细胞研究存在问题及展望
(1)脂肪干细胞虽然可以在诱导下向脂肪组织分化，但目前诱导分化的机 制尚不清楚。 (2)研究发现，来自于不同个体、不同部位的脂肪干细胞的分化能力有明 显差别，其具体原因尚不清楚，但却为进一步探寻脂肪干细胞在体外诱 导分化的条件和最佳供体、供区提供了新的课题。 (3)体外培养的脂肪干细胞最终要移入体内进行研究，然而用人体来做实 验是不可能的，所以必须建立动物模型。 (4)种子细胞最后移入体内还需要有合适的载体（即生物材料），目前关 于生物材料的研究较少，所以特异性组织生物材料也将是一个重要而广 阔的研究领域。
目前普遍认为脂肪母细胞是脂肪干细胞接受相关刺激，如寒冷、激素、生物 活性因子、体外实验性诱导剂刺激后，由多能变为单能定向分化的起始阶段。
前脂肪细胞的增殖与分化的关系为：生长停顿—生长再续—细胞分化。其中 生长停顿是必要的第一步，由单层细胞形成产生的接触抑制或是药物的作用、 营养因子缺乏引起。
脂肪干细胞基础与临床
干细胞生物学特性
干细胞（Stem cell，SC）：
− 干细胞（Stem cell，SC）是有自我复制、高度增殖和多向化潜能的细胞群 体，这些细胞以通过细胞分裂维持自身细胞的大小，同时又可以进一步分 成为各种不同的组织细胞，从构成机体各种复杂的组织器官。 干细胞技术: − 又称为再生医疗技术，是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、 甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、 组织或器官，并最终通过细胞、组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。 干细胞是整个人体生长发育的基础“材料”。
脂肪干细胞的表面标记
a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d)；细胞间粘附分子1(ICAM 1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin，CD62)； b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体； c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin 、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)； d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45； f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白； g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不表达类蛋白HLA-DR。