高效液相色谱分析技术—应用陈桂良

空白试验
• 空白试验是指在与供试品鉴别试 验完全相同的条件下，除不加供 试品外，其它试剂均同样加入而 进行的试验。
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对照试验 • 用已知含某类成分的中草药
或纯品做阳性对照 ，以排除 假阴性的出现
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杂质分析指导原则
• USP对法定标准中的杂质定义较 详细；
• BP对杂质的确定和测定方法说明 比较具体；
• 质量标准中杂质检查项目的确定主 要供新药的药学研究和质量标准建 立参考；
• 新药中发现的表观含量在0.1%及以 上的杂质和降解产物，以及毒性杂 质，应进行定性或确定结构，即至 少要确定化学类别。仿制药品和变 更工艺或原辅料产生的新杂质，也 应这样进行研究。
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检测对象
• 质量标准中的杂质不包括掺入的 或污染的外来物质，不包括变更 生产工艺或变更原辅料而产生的 新杂质。
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• 取本品与盐酸去甲万古霉素标准 品，分别加水制成每1ml中约含 5mg的溶液，照去甲万古霉素含 量项下的方法试验，供试品与标 准品主峰的保留时间应一致。 （盐酸去甲万古霉素）
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• 在含量测定项下记录的色谱 图中，供试品峰的保留时间 应与对照品峰的保留时间一 致。（醋酸氟氢可的松软膏）
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• ICH对新药和新制剂中的杂质也 有文本介绍。
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杂质定义
• 任何影响药品纯度的物质均称为杂质。 药品质量标准中的杂质系指在按照经 国家有关药品监督管理部门依法审查 批准的规定工艺和规定原辅料生产的 药品中，由其生产工艺或原辅料带入 的杂质，或经稳定性试验确证的在贮 存过程中产生的降解产物。
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制剂中的有ห้องสมุดไป่ตู้杂质
• 常用液相或气相色谱法，有的辅 料在色谱上会误为杂质，所以在 报告中应有用辅料的色谱图，加 主成分和不加主成分的，还有空 白溶液的色谱图。
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• 报告中应列出全部依据稳定性试 验认定的确实在货架效期会增多 的指定杂质，列出名称，相对保 留时间，相对响应因子，限度， 定量限，检测限。应提供系统适 用性，以保证色谱系统有效。
• 由于假劣药品的情况复杂，必要 时采用非法定方法予以检测。
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• 药品生产企业变更生产工艺或原辅 料，并因由此带进新的杂质对原质 量标准的修订，均应依法向有关药 品监督管理部门申报批准。
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杂质分类
• 由于杂质分类方法较多，难以统一 规定。如USP的 “普通杂质”，正 文和通法中均有“普通杂质”的规 定。
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• 在用现代色谱技术对杂质进行分离 分析的情况下，对已知杂质和毒性 杂质，应使用杂质对照品进行定位， 如无法获得该对照品时，可用相对 保留值进行定位。应使用多波长检 测器研究杂质在不同波长下的检测 情况，并求得在确定的一个波长下， 已知杂质，特别是毒性杂质对主成 分的相对响应因子。
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• 已知杂质或毒性杂质对主成分的 相对响应因子在0.9~1.1范围内 时，可以用主成分的自身对照法 计算含量，超出0.9~1.1范围时， 宜用对照品对照法计算含量。也 可用经验证的相对响应因子进行 校正后计算。
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1.δ－3-头孢克洛 2.头孢克洛
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含量测定
• 在原料药的含量测定中,高效液相色 谱法已大量用于化学合成药、多组 分的抗生素或生化药品；
• 方法中所用的对照品,必须具有纯度 高、易于制备和性质稳定等条件；
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应用实例：头孢克洛胶囊相关物质检查 色谱柱：Synergi Fusion-RP 250x4.6mm 方法：ChP2005
mAU
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• 未知杂质的定量可用主成分自身对 照法进行计算。杂质定量计算方法 应明确规定在质量标准中。质量标 准中还应有单个杂质限量和总杂质 限量的规定。
• 由于色谱法杂质限度检查受色谱参 数设置值的影响较大，有关操作注 意事项应在起草说明中写明，必要 时，可在质量标准中予以规定。
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• 有机杂质的检查方法,应包括全部分析参 数,如分析柱,流动相流速,流动相梯度或 温度梯度,检测器类型和相关设定(如波长, 阴极和阳极电压等),进样体积,样品浓度, 样品和对照品的制备,并应符合方法验证 的要求。在报告中应附标准溶液和供试溶 液的色谱图(通常3批),用加入法或原料确 定产品中的起始原料,副产物和中间体,用 强降解(forced degradation)溶液确定潜 在的降解产物(potential degradants)。
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• 新药研制部门对在合成、纯 化和贮存中实际存在的杂质 和潜在的杂质，应采用有效 的分离分析方法进行检测。
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• 新药质量标准中的杂质检查 项目应包括经研究和稳定性 考察检出的，并在批量生产 中出现的杂质和降解产物， 并包括相应的限度。
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• 除降解产物和毒性杂质外，在原 料中已控制的杂质，在制剂中一 般不再控制。
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• 流动相首选甲醇-水系统，如经试用不 适合时，再选用其他溶剂。为保护仪 器，应尽可能少用含有缓冲液的流动 相。
• 内标物质应选择易得并不对测定方法 产生干扰的物质，原料药的含量测定 避免使用内标法。
• 检测器首选UV检测器。 • 用于药品的杂质检查时，应避免采用
峰面积归一化法。
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枸橼酸氯米芬
用于原料药的含量测定主要用于多组分或含有几种杂质或因杂质干扰常规方法又难以分离或分离手段繁杂的品用于制剂及复方制剂的含量测定主要用于所含杂质或赋形剂干扰含量测定需先经繁杂分离后才能测定或各成分间相互干扰的品种
高效液相色谱分析技术—
上海市食品药品检验所
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高效液相色谱法应用指导原则
• 用于药品的杂质检查，主要检查原料及 制剂中引入的杂质或降解产物，尤其是 难于用TLC分离的性质相似的有关物质。
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Minutes
1.（1-唑基-1-）醋酸 2.头孢唑林烷酸水解物 3. 5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-巯基(MMTD)
4. 溶剂峰
7.未知杂质
8.头孢唑林 9.头孢唑林烷酸
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应用实例：注射用阿莫西林克拉维酸钾相关物质检查 色谱柱：Synergi Fusion-RP 250x4.6mm 方法：ChP2005
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共存物质
• 共存的异构体和抗生素多组分一般 不作为杂质检查项目，作为共存物 质，必要时，在质量标准中规定其 比例，以保证生产用的原料药与申 报注册时的一致性。但当共存物质 为毒性杂质时，该物质就不再认为 是共存物质。
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杂质检查分析方法和杂质的限度
• 杂质检查分析方法应专属、灵敏。 杂质检查应尽量采用现代分离分析 手段，主成分与杂质和降解产物均 能分开，其检测限应满足限度检查 的要求，对于需作定量检查的杂质， 方法的定量限应满足相应的要求。
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• 杂质检查分析方法的建立应按本药 典的要求作方法验证。在研究时， 应采用几种不同的分离分析方法或 不同测试条件 以便比对结果，选择 较佳的方法作为质量标准的检查方 法。杂质检查分析方法的建立，应 考虑普遍适用性，所用的仪器和试 材应容易获得。对于特殊试材，应 在质量标准中写明。
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• 新药研究中的杂质和降解产物， 或在非新药中发现的新杂质和新 降解产物，应进行分离纯化制备， 或合成制备，以供进行安全性和 质量研究。对确实无法获得的杂 质和降解产物，研制部门应在申 报资料和质量标准起草说明中写 明理由。
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应用实例：注射用氨苄西林钠相关物质检查 色谱柱：Gemini C18 5u 250x4.6mm 方法：ChP2005
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应用实例：注射用头孢唑林钠 色谱柱：Gemini C18 5u 250x4.6mm 方法：ChP2005
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• 测定法 取本品适量，精密称定，加 流动相溶解并定量稀释制成每1ml中 约含0.1mg的溶液，精密量取10µl注 入液相色谱仪，记录色谱图；另取 曾测定干燥失重的甲氨蝶呤对照品， 同法测定。按外标法以峰面积计算， 即得。
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泼尼松龙含量测定
• 照高效液相色谱法（附录××）测定。 • 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基
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HPLC在药品质量控制中的应用
• 鉴别 • 杂质分析 • 复方制剂分析 • 含量测定 • 对照品标定
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鉴别
• 采用与对照品在相同条件下进行色 谱分离并进行比较，要求其保留行 为和检测结果都相互一致作为鉴别 药品真伪的验证，是一个较好的方 法；选用色谱法进行鉴别试验时， 必须要求该色谱条件能保证其与同 类药品有良好的分离，也就是主要 有适应性试验的内容。
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• 按结构关系，杂质又可分为：其他 甾体、其他生物碱、几何异构体、 光学异构体等。按其毒性，杂质又 可分为毒性杂质和普通杂质等。普 通杂质即为在存在量下无显著性不 良生物作用的杂质，而毒性杂质为 具强烈不良生物作用的杂质。
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质量标准中杂质检查项目的确定
• 新原料药和新制剂中的杂质，应按 国家有关新药申报要求进行研究， 也可参考ICH（人用药品注册技术要 求国际协调会）的文本Q3A（新原料 药中的杂质）和Q3B（新制剂中的杂 质）进行研究，并对杂质和降解产 物进行安全性评价。
• ICH的分类：有机杂质和无机杂质； 有机杂质又分特定杂质、有关物质 和残留溶剂等。；
• 对映体有时也作为杂质。
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• 按化学类别和特性，杂质可分为： 有机杂质、无机杂质、有机挥发 性杂质。按其来源，杂质可分为： 有关物质（包括化学反应的前体、 中间体、副产物、降解产物等）、 其他杂质和外来物质等。
硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水 （65:35）为流动相，检测波长为240nm。 理论板数按泼尼松龙峰峰计算应不低于 1000，泼尼松龙峰和内标物质峰的分离 度应大于3.5。
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• 内标溶液的制备 取块诺酮，加甲醇制 成每1ml中含1.5mg的溶液,摇匀,即得。
• 测定法 取泼尼松龙对照品适量,精密 称定,加甲醇溶解并定量稀释制成每 1ml中约含1mg的溶液，作为对照品溶 液;精密量取该溶液与内标溶液各5ml， 置50ml量瓶中，用甲醇稀释成50ml， 摇匀,取10µl注入液相色谱仪,记录色 谱图；另取本品适量,同法测定,按内 标法以峰面积计算，即得。
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甲氨蝶呤含量测定
• 照高效液相色谱法（附录××）测定。 • 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基
硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-7.0%枸橼 酸溶液-2.0%无水磷酸氢二钠溶液 （10:10:80）为流动相，检测波长为 302nm。理论板数按甲氨喋呤峰计算并不 低于1000，甲氨蝶呤峰与叶酸峰的分离 度应不小于8.0。
• 用于原料药的含量测定，主要用于多组 分或含有几种杂质，或因杂质干扰，常 规方法又难以分离或分离手段繁杂的品 种。
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• 用于制剂及复方制剂的含量测定，主 要用于所含杂质或赋形剂干扰含量测 定、需先经繁杂分离后才能测定、或 各成分间相互干扰的品种。
• 首选填料为十八烷基硅烷键合硅胶、 硅胶及辛烷基硅胶。如经试用不适合 时，再选用其他填料。首选国产分离 柱，并应比较不同分离柱的理论板数。 应选择适宜的通用性较强的分离往。
• 异构体 照高效液相色谱法，用硅胶为填 充剂，正已烷-氯仿-三乙胺（80:20:0.1） 为流动相检测波长为302nm；理论板数按 顺式异构体峰计算应不低于3000，顺、 反式异构体峰的分离度应大于1.3。取本 品加流动相制成每1ml中含0.10mg的溶液， 取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图， 其保留时间依次为顺式异构体（E）与反 式异构体（Z），按峰面积归一法计算， 供试品中含反式异构体应为30-50%。
• 原料药和制剂中的无机杂质，应 根据其生产工艺、起始原料情况 确定检查项目，但对于毒性无机 杂质，应在质量标准中规定其检 查项。
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• 在仿制药品的研制和生产中，如 发现其杂质模式与其原始开发药 品的不同，或与已有法定质量标 准规定不同，需增加新的杂质检 查项目的，应按上述方法进行研 究，申报新的质量标准或对原质 量标准进行修订，并报有关药品 监督管理部门审批。