Rho相关激酶在高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老中的作用研究

Rho相关激酶在高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老中的作用研
究
徐昌武;邱立强;江洪
【摘要】目的:本研究旨在探讨 Rho 相关激酶在高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老中的作用.方法:采用22mm葡萄糖培养内皮细胞72h构建高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老模型.空白对照组使用正常葡萄糖浓度培养基,高糖组采用22mm葡萄糖培养内皮细胞,实验组在高糖组基础上添加Rho相关激酶抑制剂Y27632,甘露醇组添加甘露醇作为渗透压对照.采用衰老相关β半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老,流式细胞术分析细胞周期,免疫印迹法分析相关蛋白表达,采用试剂盒检测内皮细胞端粒酶活性和细胞培养基上清液一氧化氮水平.结果:与空白对照组相比,22mM 葡萄糖培养小鼠心脏内皮细胞72h能显著提高衰老相关β 半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比(44.00%±3.63% vs. 4.17%±0.70%,P<0. 01),同时显著增强Rho相关激酶活性,提高G0/G1期细胞比例及衰老相关蛋白 p21表达水平,抑制内皮细胞端粒酶活性,并降低细胞培养基中一氧化氮水平(P<0.05).10μM Y27632能显著抑制Rho 相关激酶活性,同时有效抑制高糖诱导内皮细胞衰老(29.17%±3.53% vs.
44.00%±3.63%,P<0.05),降低高糖环境下G0/G1期细胞比例及p21表达水平,同时逆转高糖环境下内皮细胞端粒酶活性和细胞培养基中一氧化氮含量下降
(P<0.05).结论:Rho 相关激酶激活参与高糖诱导内皮细胞衰老,抑制 Rho 相关激酶可降低高糖诱导内皮细胞衰老,为防治糖尿病血管病变提供新的方
向.%Objective:To investigate the role of Rho-associated kinase in the high glucose-induced mu-rine heart endothelial cells (MHECs) senescence. Methods: MHECs senescence was induced by culturing with 22 mM glucose for 72 h. MHECs in control group were treated with normal culture
media and the MHECs in High glucose (HG) group were treated with 22 mM glucose. MHECs in Y27632 group were pretreated with Rho-associated kinase inhibitor Y27632 before cultured in high glucose. In addition, mannitol was added to exclude the effect of osmotic pressure.The ratio of senescent cells was identified by senescence-associated β-galactosidase (SA-βG) staining and flow cy tometry was used to analyze the cell cycle. The expression of se-nescence associated protein p21, p-MBS(Thr853) and MBS was explored by Western blot. The telomerase activity in endothelial cells and the level of nitric oxide(NO) in culture medium assay kit were detected with respective kits.
Results:Compared to the control group,treatment of high glucose could significantly increase the ratio of SA-βG positive
cells(44.00%±3.63%vs.4.17%±0.70%,P<0.01),enhance ROCK activity,in-crease the ratio of cells in G0/G1 stage and the expression of p21,inhibit telomerase activity of the cells and NO level in culture medium (all P<0.05). However, treatment of ROCK inhibitor Y27632 could greatly in-hibit ROCK activity and effectively decrease the ratio of senescent cells (both P<0.05). Also, treatment of Y27632 could decrease the ratio of cells in G0/G1 stage and the expression of p21 and reverse the decrease of telomerase activity and NO level in cells cultured in high glucose medium(all P<0.05). Conclusion:Rho re-lated kinase activation is involved in high glucose induced endothelial cell senescence, and inhibition of Rho related kinase can reduce the senescence of endothelial cells induced by high
glucose,and provide a new di-rection for the prevention and treatment of diabetic angiopathy.
【期刊名称】《河北医学》
【年(卷),期】2018(024)002
【总页数】5页(P177-181)
【关键词】Rho相关激酶;细胞衰老;高糖;内皮细胞
【作者】徐昌武;邱立强;江洪
【作者单位】武汉大学人民医院心内科, 湖北武汉 430060;武汉大学人民医院心内科, 湖北武汉 430060;武汉大学人民医院心内科, 湖北武汉 430060
【正文语种】中文
糖尿病是全球最常见的代谢性疾病。

目前全球至少有3.82亿人患有糖尿病，并且
随着生活水平的提高和现代生活方式的改变，糖尿病患病人群在不断增加，预期到2030年将达到5.92亿[1]。

糖尿病大血管和微血管病变可引起血管稳态失衡、血
管细胞功能障碍，是糖尿病致死致残的主要原因[2]。

细胞衰老指细胞脱离细胞周
期并丧失增殖能力后进入一种相对稳定的状态。

自1961年首次在体外连续培养人类纤维原细胞发现衰老现象后，人们逐渐在多种哺乳动物的多种细胞发现衰老现象。

细胞衰老主要表现为细胞体积增大，细胞停止复制，细胞周期停滞在G0/G1期，细胞端粒酶活性下降，端粒缩短，衰老相关基因表达上升，并且特异性β-半乳糖
苷酶活性明显增强，同时伴有生物学功能失调[3]。

内皮细胞衰老与心血管疾病关
系密切，近来研究显示内皮细胞衰老是年龄相关性血管疾病的重要病理因素之一，
参与了动脉粥样硬化、血管重塑和炎症、血栓栓塞等的形成和发展[4]。

研究显示，众多因素能加速内皮细胞衰老，如高血糖、过氧化氢(H2O2)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等。

血管内皮细胞衰老也是糖尿病相关的血管老化的重要原因。

因此研
究内皮细胞衰老的机制，对年龄相关性血管疾病以及糖尿病大血管病变的防治有重要的意义。

Rho相关激酶(ROCK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PKA/PKG/PKC 家族中的一员。

ROCK起初是作为GTP结合蛋白RhoA的下游底物被发现的，是RhoA/ROCK信号通路的重要部分。

Wolfrum等[5]发现抑制ROCK可以激活
PI3K/Akt信号通路，增加内皮细胞eNOS表达，提高一氧化氮(NO)释放水平，从而减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤。

同时，Rikitake等[6]报道抑制ROCK可以通过提高eNOS表达和活性以及内皮来源NO从而在脑缺血损伤中发挥神经保护作用。

然而，ROCK在高糖诱导内皮细胞衰老中的作用尚不清楚。

1 材料与方法
1.1 材料：实验用动物使用2～3周龄C57BL/6小鼠。

细胞培养基购自美国Gibco 公司；免疫磁珠(带山羊抗大鼠IgG抗体)购自美国Dynal生物科技公司；大鼠抗
小鼠CD31抗体和CD102抗体均购自美国BD科技公司；Y27632购自美国Tocris生物科学公司，用无菌去离子水溶解；抗p-MBS(Thr853)抗体和一氧化氮检测试剂盒购自英国Abcam公司；抗MBS抗体购自美国Covance公司；抗
p21抗体购自美国Santa Cruz生物科技公司；内参抗β-actin抗体购自美国Sigma-Aldrich公司；端粒酶活性检测试剂盒购自德国Roche Diagnostics公司。

1.2 方法
1.2.1 小鼠心脏内皮细胞分离与培养:本实验采用免疫磁珠法分离获得小鼠心脏内皮细胞[7]。

将小鼠处死后，迅速在无菌操作台中剪开胸腔，摘取心脏置于新的培养
基中，然后用眼科剪将心脏组织剪成约1mm×1mm×1mm大小组织碎块，放入
已预热的含10mL I型胶原酶的离心管内，轻轻摇晃后放入37℃水浴箱孵育
30min。

在无菌环境下，用注射器反复吹打组织混悬液并用70μm过滤网过滤，将所得混悬液在4℃ 1000rpm离心5min后，吸弃上清液，加入含抗CD31抗体包被的免疫磁珠液，在常温摇床下摇动25min，再经磁力分离器分离，弃去上清液后，重悬细胞和磁珠，并置于明胶铺被的培养基中培养。

待细胞融合后，用胰酶消化，离心获得细胞沉淀物，加入含抗CD102抗体包被的免疫磁珠液，在常温摇床下摇动10min，再经磁力分离器分离，弃去上清液后，重悬细胞和磁珠，并置于明胶铺被的培养基中培养，得到纯化后的小鼠心脏内皮细胞。

经形态观察和免疫荧光染色鉴定本研究分离和培养细胞为内皮细胞。

1.2.2 实验分组:实验时用含1%FBS的DMEM培养基培养12h，使细胞同步化。

随机分为以下四组：①空白对照组：不加任何处理，细胞完全培养基中葡萄糖终浓度为4.4mmoL/L培养72h；②高糖组：添加D-葡萄糖，使其终浓度为
22mmoL/L，作用72h；③Y2763两组：在高糖组基础上添加ROCK抑制剂
Y27632，使其工作浓度为10μmoL/L，作用72h；④甘露醇组：添加
17.6mmoL/L甘露醇，作用72h，作为渗透压对照。

1.2.3 衰老相关的β半乳糖苷酶(SA-βG)染色:各组培养72h后，吸弃六孔板内培养液，加入4%多聚甲醛常温固定10min。

吸弃PBS后，用吸水纸小心吸去多余液体，每孔加入新鲜配制的SA-βG染色液500ul。

用塑料薄膜密封六孔板，并将其放置在37℃孵箱避光孵育24h。

每孔随机选取5个视野，计数蓝染细胞数量并计算蓝染细胞占视野内总细胞百分比。

1.2.4 细胞周期检测:将培养基吸弃，用PBS洗2次后，常规加入胰蛋白酶消化细胞，加入含血清的培养基终止消化，并在4℃ 1000rpm离心5min，用PBS液重悬并检测细胞密度。

取1×106细胞至12mm×75mm圆底聚苯乙烯试管内，每管加入1mL PBS，再次4℃ 1000rpm离心5min。

加入0.3mL PBS液重悬。

每管小心滴加0.7mL冷70%乙醇，并轻轻旋转混匀，置于冰上固定1h，再4℃
1000rpm离心5min。

用0.25mL PBS液重悬细胞，并每管加入5μL 10mg/mL Rnase A，并于37℃孵育1h，去除RNA。

加入10μL 1mg/mL PI染液(终浓度
10μg/mL)，避光保存在4℃冰箱。

检测前用流式管过滤细胞后，用流式细胞仪在488nm处激发荧光并读数。

使用CellQuest软件分析和计算G0/G1期细胞的百
分比。

1.2.5 端粒酶活性检测:采用Roche公司的Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS试剂盒检测，按照说明书进行操作。

1.2.6 Western blot分析蛋白质表达变化:提取细胞后用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂
的细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

用SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，然后电转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭PVDF膜后，将其浸入相应的一抗液内低温摇床过夜，用PBST三次后，将PVDF膜置于相应二抗液内常温孵育
1h，PBST洗三次后，用ECL液发光显影。

1.2.7 细胞上清液NO检测:本研究采用硝酸盐还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后通过Griess试剂将亚硝酸盐转化成深紫色含氮混合物，在酶标仪读数，硝酸盐
和亚硝酸盐含量，最后推算出总NO含量。

首先按照试剂盒说明书制作标准曲线，然后加入相应试剂后用酶标仪在540nm处读数，最后根据标准曲线计算样本中NO数值。

1.3 统计分析:数据采用SPSS18.0软件进行统计处理，各项指标以均数±标准差表示。

组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 高糖培养对小鼠心脏内皮细胞ROCK活性的影响:肌球蛋白结合亚单位(MBS)
蛋白是ROCK的下游底物，其Thr 853位点为ROCK特异性磷酸位点，因此可通过检测该位点的磷酸化水平检测ROCK活性。

与空白对照组相比，22mM葡萄糖
培养小鼠心脏内皮细胞72h后对内皮细胞ROCK活性显著增高(P<0.05)。

ROCK 抑制剂Y27632可显著抑制高糖引起的ROCK活性增高(P<0.01)，并且显著低于对照组ROCK活性(P<0.01)。

甘露醇对内皮细胞ROCK蛋白表达水平和活性均无显著影响(P>0.05)(见图1)
2.2 ROCK抑制剂对高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老的影响:与空白对照组相比，高糖组内皮细胞体积变大，形状不规则，SA-βG染色阳性细胞比例显著上升(44.00±
3.63% vs.
4.17±0.70%，P<0.01)。

而Y2763两组SA-βG染色阳性细胞比例较高糖组显著下降(29.17±3.53% vs. 44.00±3.63%，P<0.05)。

甘露醇组SA-βG染色阳性细胞比例与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。

2.3 ROCK抑制剂对高糖培养小鼠心脏内皮细胞细胞周期和p21表达水平的影响:细胞周期停滞在G0/G1期是衰老细胞的特征之一。

与空白对照组相比，高糖组内皮细胞G0/G1期细胞比例显著上升(78.87±3.00% vs. 58.62±2.73%，P<0.05)。

而Y2763两组处于G0/G1期细胞比例较高糖组显著下降(69.35±2.84% vs. 78.87±3.00%，P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.05)。

甘露醇组处于G0/G1期细胞比例与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

同时，与空白对照组相比，高糖组内皮细胞p21蛋白表达水平显著上升(P<0.05)(见图3)。

而ROCK抑制剂
Y2763两组p21蛋白水平较高糖组显著下降(P<0.05)，且与对照组无显著差异(P=0.11)。

2.4 ROCK抑制剂增强高糖培养内皮细胞的端粒酶活性:与空白对照组相比，
22mM葡萄糖培养72h后内皮细胞端粒酶相对活性显著降低(44.22±3.20 vs. 68.13±3.27，P<0.05)。

而10μM Y27632干预组内皮细胞端粒酶活性较高糖组显著升高(62.65±2.92 vs. 44.22±3.20，P<0.05)，与对照组相比差异无统计学意义。

甘露醇对内皮细胞端粒酶活性无显著影响(64.28±3.26 vs. 68.13±3.27，P>0.05)。

2.5 ROCK抑制剂对高糖培养小鼠心脏内皮细胞上清液NO的影响:与空白对照组相比，高糖处理组细胞培养基NO含量显著降低(15.52±1.57 μmoL/L vs.
33.78±3.65μmoL/L，P<0.01)。

而与高糖组相比，Y2763两组显著增高高糖环境下内皮细胞培养基NO含量(30.88±3.61μmoL/L vs. 15.52±1.57μmoL/L，
P<0.01)。

甘露醇对内皮细胞培养基NO含量无显著影响(31.00±2.71μmoL/L vs.
33.78±3.65μmoL/L，P>0.05)。

图1 高糖培养对小鼠心脏内皮细胞ROCK活性的影响
*与空白对照组相比，P<0.05；#与空白对照组相比，P>0.05
图2 ROCK抑制剂对高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老的影响
A、空白对照组；
B、高糖组；
C、Y2763两组；
D、甘露醇组
*与空白对照组相比，P<0.05；**与高糖组、空白对照组相比，P<0.05；#与空白对照组相比，P>0.05
图3 ROCK抑制剂对高糖培养小鼠心脏内皮细胞p21表达水平的影响
*与空白对照组相比，P<0.05；**与高糖组相比，P<0.05；#与空白对照组相比，P>0.05
图4 ROCK在高糖诱导内皮细胞衰老中的作用机制图
高糖刺激通过增强ROCK活性，从而介导细胞端粒酶活性下降、一氧化氮(NO)合成能力下降，以及细胞衰老蛋白p21表达增强、G0/G1细胞比例上升，从而导致内皮细胞衰老
3 讨论
动脉粥样硬化是糖尿病大血管病变的主要病理基础，而血管内皮细胞功能障碍是动
脉粥样硬化的始动环节。

高糖、晚期糖化终产物、过氧化氢、ox-LDL等可以诱导细胞提前衰老。

提前衰老的内皮细胞所分泌的各种生物活性因子也会发生变化，如一氧化氮合成和分泌减少、炎性因子表达增加、粘附因子分泌增多等，将导致血管内皮细胞功能障碍，最终可能导致动脉粥样硬化的发生与发展[8,9]
内皮细胞衰老与动脉粥样硬化密切相关。

研究显示，细胞周期停止、NO合成能力下降以及细胞端粒酶活性下降、端粒缩短等是内皮细胞衰老的重要表现和机制[10]。

SA-βG染色是目前普遍公认的衰老细胞鉴定方法，具有较高特异性。

本实验显示
高糖培养的细胞其SA-βG染色阳性细胞比例显著增加。

同时，流式细胞术分析显示高糖组内皮细胞G0/G1期细胞比例显著上升。

本实验还检测衰老相关蛋白p21表达，高糖组p21表达与空白组相比显著上升。

为了进一步证实高糖诱导内皮细
胞衰老，本实验同时检测了端粒酶活性，结果显示与对照组相比，高糖组内皮细胞端粒酶活性显著下降。

同时，间接检测细胞培养基NO含量显示高糖亦减少内皮
细胞合成NO能力。

本研究发现，高糖组内皮细胞ROCK的活性较空白组相比显著上升。

Rikitake等[11]使用不同浓度葡萄糖(12.5mmoL/L～25mmoL/L)在体外干预人大隐静脉内皮细胞24h亦发现高糖可增加ROCK活性，可能与高糖调节ROS和PKC信号通路
有关。

Y27632是ROCK的特异性高效抑制剂，通过作用于ROCK的ATP依赖的激酶结构域从而抑制其活性[12]。

本研究使用10μM Y27632可以有效抑制小鼠心脏内皮细胞ROCK活性。

结果显示，Y27632可以显著降低高糖诱导的小鼠心脏
内皮细胞衰老，降低高糖环境下G0/G1期细胞比例和p21表达水平，并且能显著提高高糖培养内皮细胞端粒酶活性和NO生成能力，从而表明抑制ROCK具有减
轻高糖诱导的内皮细胞衰老的作用。

内皮细胞衰老后其NO生成能力显著下降。

既往研究显示，抑制ROCK能提高eNOS mRNA稳定性并增强其活性，从而促进内皮细胞合成和释放NO[6]。

同时研究显示，内皮细胞NO水平与其衰老有密切
关系，增加内皮细胞NO水平具有抗衰老作用，而使用eNOS抑制剂非对称二甲
基L-精氨酸和L-NAME具有促进内皮细胞衰老[13]。

本研究中，高糖诱导内皮细胞衰老时伴有显著的细胞培养基NO水平下降，而使用Y27632可以显著提高高
糖培养小鼠心脏内皮细胞培养基内NO浓度，这可能是ROCK抑制剂抗高糖诱导
的内皮细胞衰老的机制所在(见图4)。

总之，本实验研究显示ROCK激活参与高糖诱导小鼠心脏内皮细胞衰老，抑制ROCK活性可降低高糖诱导内皮细胞衰老，为防治糖尿病血管病变提供新的方向。

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