大气压射流等离子体对癌细胞的作用及机制研究

大气压射流等离子体对癌细胞的作用及机制研究
华中科技大学
硕士学位论文
大气压射流等离子体对癌细胞的作用及机制研究
姓名:邹菲
申请学位级别:硕士
专业:脉冲功率与等离子体
指导教师:卢新培
2011-01-05
华中科技大学硕士学位论文
摘要
最近,等离子体在生物医学上的应用已成为国内外研究的热点,许多新型的等
离子体装置正用于从结构及功能上对细胞及人体组织器官进行改性,如在医疗器械
消毒中使用等离子体杀灭各种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)、在细胞工程中
使用等离子体处理细胞培养板以控制细胞的繁殖、在临床上使用等离子体促进伤口
血液的愈合。

这些研究的多是着重于研究新型的等离子体装置,处理对象多
是细菌、
化学材料等,迄今研究大气压等离子体对癌细胞的作用较少。

本文从生物化学角度,
对大气压射流等离子体杀死癌细胞的机理进行初步研究,希望能初步发现等离子体
中对癌细胞起主要作用的粒子成分,并同时对等离子体导致的细胞内理化参数的变
化情况进行检测。

本文首先研究等离子体射流装置的放电特性,并对等离子体进行光谱诊断。

然
后选取肝癌细胞(HepG2)、黑素瘤细胞(B16)、前列腺癌细胞(PC3)为生物模型,
研究大气压射流等离子体对它们作用后发生的生物化学效应,检测等离子体对癌细
胞的死亡诱导效应,进而获得对癌细胞处理的最佳等离子处理条件,即使用最少量
的等离子体杀死较多的癌细胞。

最后再选取肝癌细胞(HepG2)为研究对象,深入
研究大气压射流等离子体处理后该癌细胞所发生的多种生物化学变化情况,从线粒
体琥珀酸脱氢酶系的活性、细胞内 NOS和 ROS水平、DNA结构及基因变化情况等
方面分析大气压射流等离子体处理后的癌细胞死亡的原因。

得出等离子体对癌细胞
的作用机制,即等离子体中的活性粒子能诱使癌细胞内部的 NOS和 ROS水平增高,
癌细胞内部的自由基动态平衡遭到破坏,最终导致癌细胞大量死亡,等离子体在癌
症治疗中能发挥巨大的作用。

研究还发现等离子体能使 DNA构象能转变:从超螺旋
构象转变为线性和开环构象,这将有利于提高转基因育种时的成功率,等离子体在
转基因技术中的应用前景广阔。

关键词:大气压射流等离子体、癌细胞、细胞死亡、质粒DNA
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Abstract
Recently, biomedical applications of plasmas are becoming one of the hotspots in
the plasma application research area. More and more new types of plasma generation
devices are used to modify the structure and function of cells and human tissues, like
using plasma to kill various kinds of bacteria(escherichia coli, staphylococcus aureus, et
al) in the medical equipments’ sterilization process, treating cell culture plates with plasma
to control cell proliferation in cell engineering, using plasma to promote wound healing in
surgery. These studies are mostly focus on the design of new type plasma generation
devices. The objects they treated are mostly bacteria and chemical materials. However the
roles of atmospheric pressure plasma play to cancer cells are not well studied. In this
artical, we investigate from the biochemical angle, preliminary studied the mechanism of
cancer cells killed by atmospheric pressure plasma, and initially hope to find the plasma
particle compositions that play major role to cancer cells. Moreover, we have detected
some intracellular physical and chemical changes caused by plasma Firstly we studied the discharge characteristics of plasma jet decives and measured
the optical emission of the plasma plume. Then, human hepatocellular carcinoma cell
(HepG2)、 melanoma cel( l B16) and prostate cancer cell(PC3) were
chose as biological
model to investigate atmospheric pressure plasma’s biochemistry effects on them. We
detected that plasma induced cancer cells’ death, found that plasma could inhibit various
cancer cells’ proliferation. Furthermore we got the proper plasma treatment condition,
which could kill more cancer cells at the least plasma consumed. Finally human
hepatocellular carcinoma cells( HepG2)were treated by plasma and studied the
biochemical changes of cancer cells after plasma treatment. We detected the activity of
mitochondrial succinate dehydrogenase, cell morphology conditions’ changes, the
intracellular levels of NOS and ROS, DNA structure and gene’s changes et al. From these
r esults we analyzed the reason of cancer cells’ death after plasma treatment, derived the
mechanism of plasma induced cancer cells’ death. The activity particles of the plasma
could induce the intracellular levels of NOS and ROS rose, the
intracellular fr ee radicals’
balance would be broken down afterward, and finally a large number of cancer cells
would be lead to death. The study also found out that plasma could cause some changes to
the conformation of DNA: from the supercoiled structure into the linearized and open
circular structure, which would improve the success rate of transformation frequency. The
plasma has a great potential application in genetic engineering Key words: atmospheric pressure plasma, cancer cells, cells’ death, plasmid DNA
II
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作
及取得的研究成果。

尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文
不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研
究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识
到,本声明的法律结果由本人承担。

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学位论文作者签名:指导教师签名:
日期:年月日日期: 年月日
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1 引言
2010 年 8 月 15 日英国和印度研究人员发表报告称, 在印度等南亚国家出现的“超
级细菌”NDM-1 ,已经蔓延到英国、美国、加拿大、澳大利亚、荷兰等国家,全球
170 余人被感染, 其中在英国造成至少 5 人死亡。

近年来一系列新型病毒及致病细菌
不断出现,如 2003 年的“非典”、 2005 年禽流感的蔓延到 2008 年的手足口病以及
现今的甲型 H1N1 流感, 怪病如梦魇般缠绕在人类四周, 时不时地发动“突袭” ,严
重危害了人类的健康与生存。

多年来由于人类广泛使用和滥用抗生素,使得
致病微
生物的耐药适应性增强,病菌、病毒的基因突变加快,各种耐药致病微生物不断出
现。

目前人们使用的多数抗生素,已不能对人类和动物身上携带的致病微生物起有
效杀死作用,因此寻找新的杀灭方法已成为科学研究的重要课题。

等离子体因其能
安全操作、高效杀灭、无辐射及无污染物残留而被广泛研究应用,本章主要介绍大
气压非平衡等离子体、癌症、癌细胞及癌细胞死亡的途径,并总结低温等离子体杀
灭癌细胞的研究现状。

1.1 大气压非平衡等离子体的基本性质及其应用
等离子体是物质存在的第四态,它是由大量带电粒子组成的有宏观空间尺度和
时间尺度的体系, 电离的导电气体组成了等离子体, 它包括有六种典型的粒子组分,
即含有电子、正离子、负离子、基态的原子或分子、激发态的原子或分子以及光子
等。

事实上等离子体就是由上述大量正负带电粒子和中性粒子组成的,并表现出集
体行为的一种准中性气体, 也就是高度电离的气体, 无论是完全电离还是
部分电离,
其中的正电荷总数等于负电荷总数,所以被称为等离子体。

要产生等离子体就需要
大量能量来把原子中的电子和原子核分离,外部能量的形式可以有多种:热能、电
离能、或者光能(激光中的能量) 。

以水为例(如图 1.1) ,当温度低于 0℃时,水是
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以冰的形态出现的, 这是固态, 当温度逐步上升超过 0℃时, 冰融化成液态的水, 当
温度进一步升高并超过 100℃后, 水就会以沸腾成为水蒸汽-- 气态的形式存在于大自
然中,以上三种物质的存在形式在日常生活中都很常见,人们通常把这三种基本形
态称为物质的三态,要达到等离子体态,温度还需要大幅上升(约 10000℃) ,这样
大量的热能才能使水变为等离子体态。

在人们的日常生活中, 等离子体态并不常见,
等离子体态通常只存在于远离地球表面的电离层及其以上的空间中,以闪电、极光
等形式存在。

由地球表面向外,宇宙中的物质 99% 以上都是处于等离子体态,等离
子体是宇宙中几乎所有可见物质的存在形式, 日地空间中的太阳风、太阳日冕、太
阳内部、星际之间的空间、星云及星团,毫无例外的都是等离子体。

为了利用这一
重要的物质状态,人们也在不断努力想尽方法以人工产生等离子体,在十九世纪三
十年代时人们便已观察到放电管中的电离气体 ,从那时起科学家便开始建立起了等
离子体物理的基本理论框架,1906 年 H. A. Lorentz 提出了“电子”这个术语,WCrookes 又引入了“电离”这个术语, 用以描述中性原子被击碎而形成电子和正离子,
在二十世纪二十年代 I. Langmuir 正式提出了“鞘层”和“等离子体”这两个术语,
它们也一直被沿用至今。

到五十年代,等离子体已发展成为独立的分支学科,研究
领域也已扩展到受控核聚变、空间技术等领域 ,被用于轻核聚变反应中以解决能源
问题。

从八十年代起,高速发展的环境科学、能源与材料科学、微电子科学等,为
低温等离子体科学的发展带来了新的机遇与挑战。

目前人工产生等离子体的方法有:
热电离、光电离、气体放电、射线辐射等。

等离子体也已广泛应用于人们
的日常生
活及工业中, 在日常生活中的等离子体有: 电弧、等离子体显示器、臭氧发生器等,
在工业当中的等离子体应用有: 等离子体刻蚀、镀膜、材料表面改性、材料的烧结、
, ,
1 2 3
金属冶炼、有害物质的处理等。

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图 1.1 物质的四态
二十世纪以来,在新的科技革命及跨国公司迅速发展的带动下,低温等离子体
物理的应用已深入到各个工业领域,在发展高科技经济及改造传统工业工艺流程中
发挥着非常大的影响。

二十世纪九十年代中期美国尼尔森调查公司做的商业调查统
计显示:微电子工业在全球的销售额达到近一千五百亿美元,而其中等离子体技术
制造出来了其中三分之一的微电子器件设备; 以" 奔腾" 芯片为代表的半导体微处理器
的程序繁多的生产过程中, 等离子体相关制造工艺占到了三分之一, 如PECVD 技术
等。

有科学家曾作出过这样的预测:二十一世纪低温等离子体科学与技术将会产生
重大突破,人类的生活也将因此发生翻天覆地的变化。

据商业公司评估,在聚合物
薄膜材料制造、材料抗腐蚀改性、半导体工业、等离子体电子学、等离子体冶金工
业、等离子体煤化工工业、等离子体环保工业等领域中,低温等离子体技术的市场
份额每年将达上万亿元。

低温等离子体该如何定义,什么是低温等离子体?通过气
体放电或高温燃烧而产生的、温度低于几十万度的部分电离气体即为低温等离子体,
低温等离子体中一般是弱电离、多成分并和其它物质有强烈的相互作用。

在接近于
大气压的条件下进行气体放电, 气体中的电子、离子、中性粒子会发生激烈的碰撞,
粒子间充分交换动能,从而使达到热平衡状态。

取电子温度为 T ,离子温度为 T ,
e i
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中性粒子温度为 T ,则把 T ≈T ≈T 的热平衡等离子体称为热等离子体(thermal
n e i n
plasma ) ;另一方面,数百帕以下的低气压等离子体中的电子在与离子或中性粒子的
碰撞过程中几乎不发生能量的损耗,处于非热平衡状态,所以粒子的温度关系为:
T T ,T T ,满足这一关系的等离子体就被称做低温等离子体(cold plasma ) ,
e i e n
不过即使是气压改变为高气压,仍可通过不产生热效应的短脉冲放电模式获得低温
等离子体, 如: 介质阻挡放电 (Dielectric Barrier Discharge ,DBD ) 、电晕放电 (corona
discharge )或是滑动电弧放电(Glide Arc Discharge or Plasma Arc )来生成。

按照物
理性质可以将低温等离子体分为三种:①热等离子体(近局域热力学平衡态等离子
3 5
体) :稠密高压,电子温度温度范围在 10 ~10 K 之间,如电弧、高频等离子体;②
3 4
冷等离子体(非平衡等离子体) :电子温度较高,范围在 10 ~10 K 之间,但是气体
温度低, 如 DBD 介质阻挡放电等离子体、电晕放电等离子体、稀薄低压
辉光放电等
离子体等;③燃烧等离子体:各种民用及工业锅炉中的燃烧火焰、发动机与燃气机
轮中的火焰等都是燃烧等离子体。

热等离子体 (或近局域热力学平衡等离子体)主
要由高强度直流电弧放电与高频(几兆至几十兆赫兹)电源信号感应耦合放电后产
生,热等离子体的特点是放电所需电场强度较低(约 10V/cm ) ,并且它和气体压强
的比值较小,因此热电离是热等离子体主要的电离机制,重粒子(原子、离子)的
温度和电子的温度非常相近。

人们多使用辉光放电、微波放电等放电方法产生冷等
离子体,放电时的电场强度和工作室气压两者间的比值较高。

通常情况下,微波放
-6 -3
电及辉光放电中的气压远低于大气压 (约 10 ~10 标准大气压) , 这样等离子体中的
气体粒子数密度值很低,各种粒子之间发生相互碰撞耦合的能力极弱,电子在外电
场中不断加速,获取得到的能量不能够顺利通过碰撞传递给重粒子(原子、离子、
自由基、分子等) 。

最终重粒子温度大大低于电子温度, 电子温度可达到好几十万度,
4
而重粒子温度则仅仅接近或略高于室温。

根据所依赖的低温等离子体的主要性质,低温等离子体的各种应用可以大致分
成以下五类:
(1)等离子体表面处理和等离子体相下的化工生产
它们主要利用冷等离子体中电子、离子、自由原子和自由基的能量或活性诱发
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化学反应或物理过程,或者利用热等离子体的高温、高熵来促进吸热反应。

等离子
体表面处理有:刻蚀、等离子体聚合与聚合物的沉积、化学材料表面改性等;等离
子体相下的化工生产工艺有:等离子体合成聚合分子、热等离子体化工冶金、超细
与超纯材料粉的制备等。

(2)等离子体加热、热处理和热加工
它们主要利用热等离子体的高温,其具体应用有:热等离子体喷涂工艺、等离
子体冶金、等离子体焊接- 切割- 喷焊、等离子体球化、等离子体烧结等。

(3)气体放电光源
它们利用低气压或高气压气体放电时发出的各种可见电磁辐射,这些应用包括
高、低压气体放电灯、大屏幕等离子体显示器及光谱仪的光源等。

(4)磁流体发电
这主要是利用等离子体的导电特性,添加钠、钾等易电离物质到气体中,这样
便能使燃烧等离子体中的气体导电率升高,用于磁流体发电装置。

早年磁流体发电
装置多用于军事项目,能够提供短时间、大功率的电源,在常规发电装置前加装磁
流体发电前置级,可提高工作物质的初始温度 ,从而使发电厂的效率由百分之三十
几提高到百分之五十几,这对充分利用燃料资源有着重要意义。

(5)在国防中的应用
二十世纪六七十年代,由于导弹和飞船再次进入大气层时形成等离子鞘致使通
信中断、核爆炸电离区对无线电波传播特性的影响等原因,国内外就开始进行了等
离子体与电磁波的相互作用及影响的研究,超视距雷达就是利用地球外层空间的电
离层来反射电磁波,对于不同高度反射情况不同,而且反射性能受电离层状
况影响
极大,人们不得不配备了电离层实时估测设备 ,根据电离层反射区的情况对雷达实
施频率管理,这才能保证雷达波束覆盖预定监视区域,在研究航天飞行器重返大气
层时,常常遇到通信中断,人们得知航天器周围的等离子体云对机体起到了屏蔽作
用。

以上都是等离子体反射、干扰、吸收电磁波的例子,因此利用等离子体来对抗
雷达电磁波的思想二十世纪七十年代就应运而生。

当电磁波进入等离子体时,其电场使电子发生振荡,电子通过与等离子体中的
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背景粒子碰撞, 将动能传递给背景粒子, 这样就造成了入射电磁波自身能量的衰减。

另外,受一系列物理作用的影响,电磁波可能绕过等离子体,改变其传播方向,当
存在磁场时,在等离子体中沿磁场方向传播的电磁波的极化方向会产生所谓法拉第
旋转,从而使雷达接收的回波的极化方向与发射时的不一致,造成极化失真。

等离
子体的这三个性质, 在国防中有着重要的应用, 如飞行器和导弹的隐身、
导弹诱饵、
5
等离子体电磁干扰等。

1.2 癌症及其治疗、细胞坏死及细胞凋亡
癌症(肿瘤)现已成为常见病、多发病,是造成人类疾病死亡的第二疾病,全球每年死于癌症的患者约为六百万,病死率仅次于心血管疾病,它严重地威胁着人
类的生命健康及社会秩序。

因此,世界卫生组织(WHO )与各国政府卫生部门都已
把攻克癌症列为首要任务。

近年来随着科学技术的进步及医疗水平的发展,人们已
经研究出多种治疗癌症的方法,除了传统的癌症治疗方法放疗、化疗及手术切除以
外,人们还正在从基因水平及寻求新的物理方法(如毫米波)对癌症进行治疗。

放疗发展至今已有八十余年, 临床中多通过中子加速器或 Co60 产生放射线等产
生 X 射线、γ射线等照射到癌组织上,由于癌细胞比正常细胞对放射性更为敏感,
放疗能在对癌组织产生较大的杀伤的同时降低对周围正常细胞的损伤;化疗是采用
化学药物对癌细胞进行杀死、促进癌细胞分化的一种治疗方法, 目前已有
约 50 余种
药物被用于临床;但是放、化疗的副作用也是非常明显的,患者在接受放疗以后会
产生放射性皮炎、放射性食管炎以及食欲下降、恶心、呕吐、腹痛、腹泻或便秘等
诸多毒副反应,而化疗则会引起患者身体虚弱、免疫功能下降,对人体神经系统、
心脏产生毒性等危害。

如果采用手术治疗,则在手术切除肿瘤后,人体内发生癌细
胞转移或复发的机率甚高, 而不能开刀的病人对化学药物及放射线治疗大多不敏感。

因此,寻找新的癌症治疗方法引起了人们极大的关注,一些新的方法也已逐步被推
6-12
向临床应用。

细胞死亡的一般定义是细胞或生命现象不可逆的停止,细胞死亡有两种形式:
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坏死性死亡和程序性死亡。

坏死性死亡(necrosis)是外部的化学、物理或生物因素
的侵袭而导致的细胞裂解崩溃;细胞的程序性死亡(programmed cell death ,PCD )
或是细胞凋亡 (apoptosis ) 是多细胞有机体维护内环境稳定、保持细胞数目平衡、防
御病原体入侵等,由基因调控的细胞主动死亡的过程,它能保证有机体的正常生长
发育。

自从上世纪七十年代 Kerr 等提出了细胞凋亡这一概念,人们深入研究了其内
在机理,人们不但深刻地理解了细胞凋亡的机理,而且也不断地采用多种方法研究
细胞凋亡与疾病的关系,细胞凋亡的规律一旦失常,生物个体就不能正常发育,甚
至有可能会发生畸形,许多严重的疾病就是因为这样而产生的:老年性痴呆、帕金
森症、肌萎缩侧索硬化症、心肌缺血/ 再灌注损伤等有关疾病是因为细胞凋亡异常增
加,不该死的细胞死了;各种癌症和自身免疫性疾病的重要发病机制则是由于正常
的细胞凋亡被抑制, 该“死”的细胞不死。

为疾病的早期诊断 (特别是肿瘤) 、药物
开发乃至最终的治疗提供理论依据都需要深入研究细胞凋亡的机制。

和细胞坏死的过程有差别, 细胞凋亡是一个相对较为复杂过程, 在这个过程中,
细胞主动自杀是由基因编码调控的,这样才能保证机体的正常生长、分化、
通过细胞凋亡,机体将那些衰老、畸变及可能会导致疾病的细胞杀灭以维持正常状
态。

在细胞凋亡过程中会发生一些独特的形态学及生化特征变化, 这些变化主要有:
细胞胞质发生皱缩、染色体产生凝集、细胞质被边缘化、出现凋亡小体以及核小体
间的 DNA 被切割成 180 到 200 bp 及整数倍的片断,研究人员对细胞凋亡进行观察
也多是对上述一些特征的检测来完成的。

近十年来,人们逐渐认识到细胞凋亡非常
重要,同时分子生物学技术也取得了日新月异的发展,对细胞凋亡的调控机理以及
相关凋亡基因、凋亡信号的传导、凋亡蛋白因子等取得了许多新的认识。

细胞凋亡
过程有许多基因调控着, 这些基因又分为促癌基因和抑癌基因 (例如 P53 , Rb 和 Bcl-2
家族等) , 此外还有一些重要的蛋白酶和激酶也起了调控作用,caspase 家族控制了哺
乳动物细胞的凋亡, 活化的 caspase 蛋白会引起酶级联效应, 最终能导致染色体 DNA
片段化及细胞的解体。

在人类细胞中,caspase 又被称为死亡蛋白酶,它能与
众多蛋白质因子互相反应,调节细胞凋亡的过程。

目前研究人员还不是非常透彻地
了解哺乳动物的细胞凋亡机制,认为可能有两种途径,即外部途径(death receptor
7华中科技大学硕士学位论文
pathway )和内部途径(mitochondiral pathway ) 。

其中外部路径也称 fas 途径,靶细
胞表面的死亡受体(death receptor )与配体(ligand )相互结合,导致死亡结构域与
连接蛋白 FADD C 末端的 DD 进一步结合, 从而激活 caspase-8 , 以及下游的 caspase-3
等, 引起细胞的凋亡。

细胞外信号或细胞内刺激事件 (如微管或 DNA 损伤、化学药
品的处理、生长条件的消失等凋亡刺激)通常会引起内部途径,这一途径主要是由
线粒体及 Bcl-2 (B cell lymphoma leukemia-2 )家族蛋白所调控,释放线粒体细胞色
素 c 到细胞质中, 细胞色素 c 和细胞凋亡级连的重要成分凋亡蛋白酶激活因子 Apaf-1
又进一步结合在一起, 最终激活 caspase-3 产生凋亡信号。

外部途径与内部途径是相
13-25
互关联的,例如,这两个途径最后都能激活 caspase-3 的活性。

1.3 国内外研究现状
最早使用等离子体于生物医学领域的是 Siemens , 他在十九世纪五十年代后期使
用介质阻挡放电装置来产生臭氧用于处理污水中的细菌,然而直到 130 年以后人们
才对等离子体对生物细胞的作用有相对清晰的了解,同时等离子体开始广泛应用于
生物消毒领域,等离子体在生物方面的应用也逐渐成为研究的热点。

M. G. Kong 等
认为等离子体在如下领域中将应用广泛:1、医院及社区卫生消毒, 等离子体能对公
共设施表面存留的一些顽固性细菌 (如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌) 快速有效杀灭;
2、牙科护理, 等离子体能渗入牙齿和牙龈间的微孔, 能处理到这些微孔中的残留病
菌, 这在预防牙周感染中是非常理想的处理手段, 同时等离子体能有助于漂白牙齿;
3、皮肤病防治, 许多皮肤病 (如痤疮发疹及皮炎等) 都与细菌或真菌感染有关, 等
离子体能有助于降低这些疾病的并发症;4、慢性伤口的愈合, 等离子体在。