EGCG对顺铂损伤HEK293细胞及杀伤A549细胞的影响

EGCG对顺铂损伤HEK293细胞及杀伤A549细胞的影响连燕娜;郭淑琴;周绮云;高兆兰;王海;高丽萍
【摘要】目的:探讨表儿茶素没食子酸酯(EGCG)对顺铂(DDP)致人胚肾HEK293细胞损伤及对DDP杀伤人肺癌A549细胞的影响.方法:体外培养HEK293细胞和
A549细胞,分为对照组、DDP组和DDP+EGCG组,DDP组和DDP+EGCG组同时建立DDP损伤模型,MTT法检测EGCG和/或DDP对HEK293细胞和A549细胞存活率的影响.结果:EGCG对HEK293细胞的IC50值为61.6 mg/L.当EGCG浓度＜40 mg/L时,对DDP诱导的HEK293细胞损伤没有显著性影响,EGCG浓度≥40 mg/L时,可显著性增强DDP对HEK293细胞的损伤作用.EGCG对A549细胞的IC50值为33.6 mg/L.当EGCG浓度≥32 mg/L时,可显著增强DDP对A549细胞的杀伤作用.结论:EGCG对DDP所致HEK293细胞损伤无保护作用,但EGCG 对癌细胞毒性作用大于其对正常细胞的毒性,且当EGCG与DDP同时使用时可以加重A549细胞损伤.
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2016(028)001
【总页数】5页(P14-18)
【关键词】表儿茶素没食子酸酯;顺铂;肾毒性;抗肿瘤
【作者】连燕娜;郭淑琴;周绮云;高兆兰;王海;高丽萍
【作者单位】北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100083;北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100083;北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京
市重点实验室,北京 100083;北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100083;北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100083;北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100083
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.8
作者信息：连燕娜，E-mail：**********************。

*通信作者，高丽萍，E-mail：****************
【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the effects of epigallocatechin gallate (EGCG) on cisplatin (DDP)-induced cytotoxicity in human embryo kidney (HEK) 293 cells and A549 cells. METHODS：HEK293 cells and A549 cells were cultured in vitro，and effects of DDP and EGCG on HEK293 cells and A549 cells were observed by MTT. The cells were divided into control group，DDP group and DDP+EGCG group. Then，the rates of HEK293 and A549 cell death were investigated by MTT. RESULTS：The IC50of EGCG on HEK293 cells was 61.6 mg/L. At lower than 40 mg/L，EGCG had no significantly effects on DDP-induced HEK239 cell death. At higher than 40 mg/L，EGCG significantly enhanced DDP-induced HEK239 cell death. The IC50of EGCG on A549 cells was 33.6 mg/L. At higher than 40 mg/L，EGCG significantly enhanced DDP-induced A549 cell death. CONCLUSION：EGCG had no significant protective effects on DDP-induced HEK239 cell death，but EGCG induced more cytotoxicity on cancer cells than on normal cells. When co-treated with DDP，A549 cell s ustained m ore
damage than H EK239 c ells.
【KEY WORDS】epigallocatechin gallate；cisplatin；nephrotoxicity；anticancer
顺铂[cis-dichlorodiamineplatinum(II)，DDP]是一种广泛应用的抗癌药物，临床上应用于多种癌症的治疗，如肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胸腺癌等[1-4]。

DDP在体内主要经肾脏排泄，在肾脏内聚集浓度最高，肾毒性也是限制DDP临床大量应用的主要因素之一。

近年来，在DDP的结构基础上，合成了大量的DDP类似物，进行抗肿瘤活性筛选，最终有30个左右化合物进入了临床试验阶段，但在抗癌活性和副作用的综合评价上均未超过DDP，更不能取代[5]。

因此，增强DDP抗癌
效果，降低DDP毒副作用就成为目前药理学、毒理学和肿瘤临床治疗关注的热点。

儿茶素类物质又称茶单宁，是茶叶茶多酚中的重要活性成分之一，主要包括儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)等，其中EGCG是茶多酚中含量最高、活性最强的单体[6]。

研究显示儿茶素类物质具有抗菌、抗炎、防癌抗癌、抗氧化、保肝等多种生物活性[7-9]，现已引起国内外研
究者的普遍重视。

但儿茶素类物质对DDP所致肾毒性是否有保护作用，对DDP
抗癌效果是否有影响均尚未见报道。

本研究采用体外细胞培养法探讨了EGCG对DDP致人胚肾HEK293细胞损伤的保护作用以及对DDP体外杀伤人肺癌A549
细胞的影响。

1.1 材料与试剂
人胚肾细胞(HEK293)和人肺腺癌细胞(A549)均购自中国医学科学院基础医学研究
所北京协和医学院基础学院细胞中心。

DDP(批号406022CF)，注射用冻干粉剂，购自齐鲁制药有限公司；EGCG，纯度大于98%(高效液相色谱法检测)，购自北京金宝在线科技有限公司；0.25%胰酶和DMEM培养基，购自美国Genview公司；胎牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；四甲基噻唑蓝(methyl thiazolyl
tetrazolium，MTT)，购自美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HEK293细胞和A549细胞，用含15%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、CO2体积分数为5%的孵育培养箱中培养，待细胞生长至汇合度为70%~80%时传代并接种于新培养瓶中，取处于指数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 MTT法检测DDP对HEK293和A549细胞的毒性作用将处于生长期的
细胞按1×105/mL接种到96孔板中，待细胞生长至汇合状态时，弃原培养液，
加入100 μL含不同终浓度DDP的无血清DMEM培养基，HEK293细胞DDP浓度分别为0、2、4、8、16、32、40、60 mg/mL，A549细胞DDP浓度分别为0、5、7.5、10、15、20、25、30 mg/mL，每组设6个复孔，在37℃、CO2
体积分数为5%的孵育培养箱中培养24 h后MTT法测定细胞抑制率。

1.2.3 MTT法检测EGCG对HEK293和A549细胞存活率的影响将处于生长期的细胞按1×105/mL接种到96孔板中，待细胞生长至汇合状态时，弃原培养液，加入100 μL含不同终质量浓度的EGCG(0、2、4、8、16、32、40、50、60
mg/mL)的无血清DMEM培养基，每组设6个复孔，在37 ℃、CO2体积分数为5%的孵育培养箱中培养24 h后MTT法测定细胞存活率。

1.2.4 MTT法检测EGCG对DDP致HEK293和A549细胞损伤的影响将处于
生长期的细胞按1×105/mL接种到96孔板中，待细胞生长至汇合状态时，加药
处理。

试验分3组：对照组，未加入DDP和EGCG；DDP组，HEK293细胞采
用浓度为20 mg/L的DDP处理24 h， A549细胞采用浓度为10 mg/L的DDP
处理24 h； DDP+EGCG组，在加DDP前4 h加入不同浓度EGCG孵育细胞，HEK293细胞EGCG浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 mg/mL，A549细胞EGCG浓度分别为2、4、8、16、32、40、50、60 mg/mL。

不加药的组在加药时加入相应量的溶剂作为对照。

每组设6个复孔，在37 ℃、含5%
CO2的孵育培养箱中培养24 h测定细胞存活率。

1.2.5 MTT法测定HEK293和A549细胞存活率细胞经药物处理24 h后，向培养基中加入 MTT，使终质量浓度为0.5 g/L，于37 ℃、CO2体积分数为5%的孵育培养箱中培养4 h，弃上清并加入DMSO(每孔100 μL)，混匀10 min，用酶标仪检测(测定波长570 nm，参比波长630 nm)吸光度值D(570)。

细胞存活率=试验组D(570)值/对照组D(570)值。

细胞抑制率=(1-细胞存活率)× 100%。

1.3 统计学方-法
结果以x±s标准差的形式表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，对照组、DDP组和DDP+EGCG组细胞存活率间差异的分析采用单因素方差分析和S-NK 法，以α=0.05为检验水准，用EXCEL软件作图。

2.1 EGCG对HEK293细胞的作用
2.1.1 DDP对HEK293细胞的毒性如图1所示，随着DDP浓度增高，对
HEK293细胞的抑制率逐渐升高。

当DDP浓度为60 mg/L，所测细胞抑制率达到最高，即抑制率为85%±3%。

通过SPSS软件得出DDP对HEK293细胞的IC50值为18.78 mg/L，选用整数20 mg/L作为建立HEK293细胞DDP损伤模型的浓度。

2.1.2 EGCG对HEK293细胞存活率的影响如图2所示，EGCG浓度低于40
mg/L时，对HEK293细胞存活率没有显著性影响，而随EGCG浓度的升高，细
胞存活率逐渐降低，当EGCG浓度高于50 mg/L时，细胞存活率显著低于空白对照组(P<0.05)。

通过SPSS软件得出EGCG对HEK293细胞的IC50值为61.6
mg/L。

2.1.3 EGCG对DDP致HEK293细胞损伤的影响如图3所示，当EGCG浓度较低，即低于20 mg/L时，EGCG对DDP所致的HEK293细胞损伤无明显的保护作用。

当EGCG浓度≥40 mg/L时，HEK293细胞存活率显著低于DDP损伤组(P<0.05)，
可能是因为EGCG高于一定浓度后，其本身就对细胞有一定的毒性，所以更加重了DDP对细胞的损伤。

2.2 EGCG对A549细胞的作用
2.2.1 DDP对A549细胞的杀伤作用如图4所示，随着DDP浓度增高，对
A549细胞的抑制率逐渐升高。

当DDP浓度为30 mg/L，所测细胞抑制率达到最高，即抑制率为85%±4%。

DDP对A549细胞的IC50值为10.68 mg/L，因此选用10 mg/L作为建立A549细胞DDP损伤模型的浓度。

2.2.2 EGCG对A549细胞存活率的影响如图5所示，EGCG可以显著抑制
A549细胞的增殖(P<0.05)，且随着EGCG浓度的增大，A549细胞存活率逐渐降低。

说明细胞增殖抑制率与EGCG的浓度存在浓度效应关系。

EGCG对A549细胞的IC50值为33.65 mg/L，提示EGCG可能具有很好的抗癌效果。

2.2.3 EGCG对DDP杀伤A549细胞的影响如图6所示，用终浓度为10 mg/L 的DDP建立A549细胞损伤模型，当EGCG浓度为2~16 mg/L时，与DDP处理组比较，A549细胞存活率无明显差异(P>0.05)，当EGCG浓度≥32 mg/L时，A549细胞存活率显著低于DDP损伤组(P<0.05)，且随EGCG浓度的增大，细胞存活率逐渐降低，说明EGCG高于一定浓度后可以加重DDP对A549细胞的杀伤作用。

DDP是临床上广泛应用的一种抗肿瘤药物，由于DDP进入机体后主要通过肾脏排泄，所以其肾毒性最为明显。

DDP在肾脏组织中高浓度分布和长时间蓄积是其肾毒性的作用基础。

DDP中的重金属离子Pt2+，易于和蛋白质、酶等生物分子中的巯基(-SH)结合，从而使蛋白质和酶失活，使人体组织或细胞受到损伤[10]。

另外DDP进入细胞后，氯离子会很快被水分子取代，DDP被水化后形成亲电子的活化形式，可以产生大量自由基和活性氧簇(ROS)，从而诱发机体产生氧化应激反应，损伤线粒体。

前期研究表明，氧化应激和线粒体损伤是DDP所致肾损伤的主
要因素之一[11]。

并且细胞中大量的自由基和ROS可以激活内源性细胞凋亡信号
通路，最终导致细胞凋亡[12]。

由此可见，DDP在肾组织中引起的损伤可能是多
靶位，多方向的。

EGCG是绿茶中茶多酚的主要活性物质，大量的实验研究表明，EGCG具有很强的抗氧化和抗炎症作用[13]，并且EGCG通过其抗炎、抗氧化的效应对改善肾脏炎症、组织损伤和肾功能方面有着一定的作用[14]。

本研究结果显示EGCG对DDP
所致HEK293细胞损伤没有显著性的保护作用，可能是因为DDP引起的细胞损伤是多靶位的，而EGCG的抗氧化作用不足以保护DDP诱导的细胞损伤。

近年来，随着研究的深入，DDP抗肿瘤作用的机制越来越清楚。

持续性分裂是癌
细胞的主要特征之一。

DDP进入细胞后，氯离子会很快被水分子取代，DDP被水化后形成亲电子的活化形式。

活化的DDP可与核酸分子上的巯基或嘌呤碱基的
N7供氮活性中心反应，形成链内或链间加合产物，从而造成癌细胞的DNA损伤，阻止细胞分裂，最终导致癌细胞凋亡[15]。

另外，DDP可以改变癌细胞内多种
信号通路，如MAPK信号通路、AKT信号通路、JNK信号通路以及Caspase信
号通路等，这些信号通路的改变都将最终导致细胞凋亡[16]。

研究证实，EGCG对肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤均有抗肿瘤作用
[17]。

EGCG可以通过提高凋亡相关蛋白的活性抑制癌细胞增殖，促进细胞凋亡
[18]。

本研究结果表明，EGCG有一定的细胞毒性作用，因此，EGCG的抗肿瘤作用可作进一步研究，尤其是与化疗药物的协同作用。

另外，一定浓度的EGCG与DDP共同作用可以增强A549细胞的损伤，此结果与Zhang等[19]的研究结果是一致的，其结果显示EGCG可以通过改变基因的甲基化状态来增强癌细胞对DDP的敏感性。

也有研究表明，EGCG与其他抗癌药物联合使用可以增强MAPK 信号通路介导的细胞凋亡相关基因的表达[10]。

因此，EGCG增强DDP抗癌效果
的确切机制还有待于进一步研究。

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