聚合酶链反应酶显色用于结核分支杆菌的检测

容易形成胆固醇性结石也与其胆汁酸图谱的变化有关
[7]。

在胆结石、阻塞性黄疸、脂肪肝患者血清中,
结合型胆汁酸均有不同程度的增高,并且随着治疗
的进展,血清中的结合型胆汁酸的浓度会逐渐下降,各成份的比例也会发生变化。

因此,测定血清中的各结合型胆汁酸浓度对于肝病患者的早期诊断、治疗以及鉴别诊断都有重要意义。

作者简介:李贵星,男,36岁,医学硕士,讲师。

研究方向为肝病的实验室检查。

参考文献:
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中的结合型胆汁酸[J ].预防医学情报杂志,1999,15(3-A ):92.[4]冯埃生,邹汉法,李瑞江,等.高效液相色谱 光散射检测器测定肝
病患者血清中的胆汁酸[J ].分析化学,1997,25(3):258.[5]刘树业,崔　岚.血清七种结合胆汁酸测定对肝脏疾病的诊断价
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(收稿日期:2003-01-07)
文章编号:1007-4287(2004)02-0150-03
聚合酶链反应-探针杂交-酶显色用于结核分支杆菌的检测
熊国亮,雷建平,张慧慧,刘珍琼,周萍珍
(江西省肺科医院检验科,江西南昌330006)
摘要:目的　评价聚合酶链反应-探针杂交-酶显色方法,检测结核分支杆菌。

方法　收集131例活动性肺结核患者和30例非结核呼吸系疾病患者的痰标本以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查,结核菌培养、PCR -探针杂交-酶显色法、PCR -琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。

结果　涂片法、培养法、PCR -探针杂交-酶显色法的敏感性分别为26.72%、41.22%、70.23%,PCR -探针杂交-酶显色法的敏感性显著高于培养法和涂片法(P <0.01)。

PCR -探针杂交-酶显色法和PCR 琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为70.23%、70.99%,特异性分别为96.67%、86.67%,前者特异性比后者高,且PCR -探针杂交-酶显色法只检出结核分支杆菌和牛型分支杆菌。

结论　PCR -探针杂交-酶显色技术检测结核分支杆菌灵敏度高,特异性好,简便快速,同时能筛检非结核分支杆菌。

因此,该技术具有很强的临床应用价值。

关键词:分支杆菌;结核;聚合酶链反应;探针杂交;酶显色中图分类号:R37　R543.5
文献标识码:A
Detection of mycobacterium tuberculosis with PC R -Probe Hybridization -ELISA XIONG Gu o -liang ,LEI Jian -ping ,ZhA NG Hui -hui ,et al .(Department of Clinical Labo ratory ,Pulmonar y Hos pital of JiangXi Pr ovince ,Nanchang 330006,China )
Abstract :Objective To evaluate the value of PCR -probe hybridization -ELISA for detection of my cobacterium tuberculosis (M .tuberculosis ).Methods The sputu m specimens taken from 131patients with active pulmonary tuberculos is and 30patients with res -piratory system diseases other than tuberculosis ,were detected double -blindl y with thick smears acid -fast stainin g ,culture ,PCR -probe hybridization -ELISA ,PCR -agar gel electrophoresis (PCR -AGE )technique ,And the results were compared .Results The sensi -tivities of s mears ,cultures and PCR -probe hybridization -ELISA were 26.72%,41.22%,70.23%,respectively .The sensitivity of PCR -probe hybridization -ELISA was obviously higher than that of the other two methods (P <0.01).The sensitivity was 70.23%by PCR -probe hybridization -ELISA and 70.99%by PCR -AGE .The specificity was 96.67%b y PCR -probe hybridization -ELISA and 86.67%by PCR -AGE ,The specificity of the former was higher than that of the latter ,PCR -probe hybridization -ELISA can onl y de -tect M .tuberculosis and M .bovis .Conclusion PCR -probe hybridization -ELISA is a more sensitive ,more specific ,simpler ,more rapidly method for detection of M .Tuberculosis and can identifymycobacterium tuberculosis with non -mycobacterium tuberculosis .PCR -probe hybridization -ELISA is one of the effective methods in clinical application .
Key words :Mycobacterium ;tuberculos is ;PCR ;Probe Hybridization ELISA
(Chin J La b Diagn ,2004,8:150)
基金项目:江西省卫生厅资助项目(编号:20001103)。

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150—Chin J Lab Diagn ,April ,2004,Vol 8,No .2
自1989年聚合酶链反应(PCR)用于结核分支杆菌检测以来,该技术为结核病的诊断提供了简便、快速的方法。

但在实际应用过程中,也遇到了一些问题,如传统的PCR电泳法只能主观的判断产物的大小,造成一定的假阳性及假阴性存在[1];PCR荧光探针法虽然可以提高PCR的敏感性和特异性,但需要价格昂贵的荧光检测仪。

我们采用一种全新的PCR分子杂交模式,即PCR扩增、特异性结核菌探针杂交、酶显色检测一体化的PCR检测标本中的结核分支杆菌,同时筛检非结核分支杆菌,并将其与涂片抗酸染色、培养法、PCR琼脂糖电泳法比较对照,评价其检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。

1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　病例选择及标本来源　共选择我院住院活动性肺结核病患者131例,非结核呼吸系疾病患30例(其中肺癌12例、肺炎7例、支扩4例、COPD4例、肺心3例),留取晨痰标本3～5ml。

1.1.2　菌株　结核分支杆菌标准株(H37RV)购自中国药品生物检定所;分支杆菌属内不同种菌株(10株):田鼠分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、无色分支杆菌、瘰疠分支杆菌、戈登分支杆菌、蟾分支杆菌、猿分支杆菌、次要分支杆菌由江西医学院附属一医院廖晚珍主任惠赠;其他普通细菌菌株(10株):大肠杆菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌、阴沟肠杆菌、产碱杆菌、A链球菌、白色念珠菌由江西省临床检验中心惠赠。

此20株细菌与结核分支杆菌缘距较近。

1.1.3 主要试剂与仪器　(1)PCR试剂及探针杂交试剂(批号010630)均由上海复星实业股份有限公司提供。

上游引物序列为:5'—CGTGA GGGC A TC-GAG GTGGC—3',下游引物序列:5'—GCGTA GGCGT CGGTG ACAAA—3',扩增一245bp的DNA 片段;结核菌特异性探针;5'—T GCTA CCCAC AGC-C G GTTAGG—3'。

(2)改良罗氏培养基参见《结核病诊断细菌学检验规程》[2]自配。

(3)DNA扩增仪为美国M-J公司生产的PTC—100型。

1.2　方法
1.2.1　(1)临床痰标本的处理及靶DNA的制备见参考文献[3]。

(2)PCR扩增反应:扩增前在37℃反应10min,然后94℃保温5min,再按93℃45、60℃45 s、72℃60s循环35次,然后72℃延伸5min。

每次同时扩增两份备用。

1.2.2　直接取PCR产物10μl于1.5%琼脂糖凝胶电泳紫外透射仪上观察结果,并与DNA分子量标准比较。

1.2.3　探针杂交及酶显色　(1)取30μl DNA变性液于扩增后的反应管中,振荡,放置3min。

(2)分别取40μl杂交缓冲液(含生物素),10μl已变性DNA 于微板反应孔内,然后插入含结核菌特异性探针的杂交膜条,37℃反应5～10min。

(3)将杂交后的膜条用洗膜液37℃,5～10min洗涤一次。

(4)取1滴碱性磷酸酶标链霉亲和素于另一微板孔内与洗涤后的杂交膜条上的生物素结合,洗膜后,加显色底物显色约10min,加终止液50μl,25℃5min。

(5)结果判定:在杂交膜上如出现二条明显的蓝紫色线(其中一条为对照线)为对应标本中结合菌DNA阳性结果;如只出现一条对照蓝紫色线为对应标本中结核菌DNA阴性结果。

每次试验均设置阴性、阳性质控对照。

1.2.4　灵敏度试验　将结核分支杆菌标准株用吐温-80无菌生理盐水制成1mg ml,并梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12mg ml的不同浓度管,各取1ml分别进行同条件的PCR扩增,凝胶电泳,探针杂交,酶显色。

1.2.5　将与结核分支杆菌缘距较近的细菌(共20株)与结核分支杆菌进行同样PCR扩增,凝胶电泳,探针杂交,酶显色。

1.2.6　涂片抗酸染色,分支杆菌罗氏培养,分支杆菌菌种初步鉴定严格按照《结核病诊断细菌学检验规程》[2]操作。

2　结果
2.1　临床标本　在131例肺结核患者痰标本中, PCR探针杂交法和PCR琼脂糖电泳法的敏感性分别为70.23%(92131)和70.99%(93131)。

涂片抗酸染色,培养法敏感性分别为26.72%(35131)和41.22(54131),与PCR探针杂交和PCR琼脂糖电泳法相比差异有显著性意义(P<0.01)。

在30例非结核呼吸系疾病患者痰标本中,涂片、培养法均为阴性结果,而PCR探针杂交检出阳性1例,特异性为96.67%;PCR琼脂糖电泳法检出阳性4例,特异性为86.67%。

前者特异性比后者高。

详见表1。

2.2　在57例菌阳(涂阳+培阳)标本中　结核分支杆菌48例,牛型分支杆菌6例,非结核分支杆菌3例,应用PCR探针杂交技术只检出54例结核分支杆菌和牛型分支杆菌,而PCR琼脂糖电泳技术57
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中国实验诊断学　2004年4月　第8卷　第2期
例标本全检出阳性。

2.3　在对20株与结核分支杆菌缘距较近的细菌进行PCR探针杂交和PCR琼脂糖电泳法检测中,结果PCR探针杂交法全为阴性结果,而PCR琼脂糖电泳法检出田鼠分支杆菌,胞内分支杆菌,偶发分支杆菌,绿假单胞菌阳性结果。

2.4　灵敏度的检测结果　PCR探针杂交法能检出10-10mg(100fg)的结核分支杆菌DNA,而PCR琼脂糖电泳法只能检出10-9mg(1pg)的结核分支杆菌DNA,详见表2。

表1　PCR探针杂交和PCR琼脂糖电泳法
检测临床痰标本结果
组 别例数
PCR探针杂交法
阳性例数阳性率(%)
P CR琼脂糖电泳法
阳性例数阳性(%)结核组 1319270.239370.99
涂阳培阳　323093.7532100
涂阳培阴　331003100
涂阴培阳　222195.4522100
涂阴培阴　743851.353648.65
菌阳总例数575494.7457100
非结核呼吸
系疾病
3013.33413.33
表2　两种方法检测H
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RV结果比较(加入菌量10-X mg管湿重)
10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-1010-1110-12 PCR探针杂交法++++++++++--PCR电泳法 ++++++++±--- 注:+表示阳性结果,±表示弱阳性结果,-表示阴性结果。

3　讨论
3.1　PCR探针杂交酶显色技术属目前国内新的基因诊断技术[4],它的原理是在PCR扩增产物变性后用生物素[Biotin]标记,与固定在膜纸条上的特异结核菌探针进行反相杂交,探针捕获的生物素[Biotin]和标记碱性磷酸酶[AP]的链霉亲和素[SA]特异结合后,酶催化底物显色,在膜纸条上显出蓝紫色条。

该技术的主要特点是将特异性探针先交联在固相载体膜上,在液体环境中与PCR产物即流动相中的靶序列特异结合,再经过酶显色而完成检测。

整个杂交过程可以从经典的2～4小时缩短到几十min以内,而且还保持很高的杂交特异性和杂交效率。

3.2　在30例非结核呼吸系疾病患者痰标本中,PCR 探针杂交假阳性率为3.33%(130),PCR琼脂糖电泳法假阳性率为13.3%(430)。

后者假阳性率高的原因是:第一,引物扩增的特异性不是很高;第二,琼脂糖电泳的方法只能判断产物的大小,并不能鉴别产物的特异性,因此不可避免地会出现一些难以判别产物的非特异产物,给结果观察和判断带来一定困难,造成一定的假阳性存在。

实验中的一例PCR 探针杂交假阳性是一位曾患过肺结核已治愈,此次以肺癌来就诊的病人,该患者PCR电泳法也为阳性结果,皆被列为假阳性。

3.3　本实验对不同浓度的结核分支杆菌的检测,显示PCR探针杂交灵敏度高出PCR电泳法10倍,且PCR探针杂交法只与结核分支杆菌和牛型分支杆菌杂交外未发现与其他相关菌有非特异交叉阳性。

3.4　实验所用PCR的引物可对分支杆菌属中的绝大部分人类致病菌特异扩增,而探针则仅对结核分支杆菌、牛型分支杆菌特异互补。

我们的实验结果在57例菌阳病例中,PCR琼脂糖凝胶电泳检测全为阳性,而PCR探针杂交只检出54例结核分支杆菌和牛型分支杆菌阳性,3例非结核分支杆菌均为阴性结果。

根据以上实验结果,作者认为应用PCR扩增技术和结核菌特异性探针,酶显色联合检测结核菌,提高了检测的特异性、灵敏度和可信性,同时也筛检了非结核分支杆菌,该技术真正能为临床提供可靠的诊断依据。

作者简介:熊国亮,男,38岁,大学,副主任技师,科主任。

从事临床检验工作。

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(收稿日期:2003-01-04)
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