茚三酮显色法测定氨基酸含量
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
❖（2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M 86ml 醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成。 用pH计较正（250ml/班）
❖（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和 15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解 （15ml/组）
❖ 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮， 用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将 0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅 拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中， 不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后 在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗 涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥 器中保存备用
• 样品同时做三份取平均数
四、结果与计算
• 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
——X为查标准曲线所获得每ml含量g数
• 自配样品
——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得 每ml含量g数）
——250为稀释的倍数
• 五、讨论与分析
• 六、思考题
茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的 定性鉴定？
实验三 茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、实验原理
• 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与 茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化 合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比， 可通过测定570nm处的光密度，测定氨基 酸的含量
二、试剂与材料
❖（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液 （本实验用赖氨酸）(已配)
•（4）60%乙醇（50ml/组 ） •（5）样品液：每ml含0.5-50ug氨基酸（已配） •（6）分光光度计 •（7）水浴锅
三、操作方法
1、标准曲线的制作
• 分别取0， 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的 标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加 入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充 分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min， 用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%乙醇稀释， 充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯 氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570 为纵坐标，氨酸酸样品的测定：
• 取样品液1ml，加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮 显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min，自 来水冷却。放置5min后，加3ml60%乙醇稀释，摇 匀后测定OD570（生成的颜色在60min内稳定）
• 将样品测定的OD570与标准曲线对照，可确定样品 中氨基酸的含量
❖（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和 15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解 （15ml/组）
❖ 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮， 用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将 0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅 拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中， 不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后 在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗 涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥 器中保存备用
• 样品同时做三份取平均数
四、结果与计算
• 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
——X为查标准曲线所获得每ml含量g数
• 自配样品
——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得 每ml含量g数）
——250为稀释的倍数
• 五、讨论与分析
• 六、思考题
茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的 定性鉴定？
实验三 茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、实验原理
• 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与 茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化 合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比， 可通过测定570nm处的光密度，测定氨基 酸的含量
二、试剂与材料
❖（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液 （本实验用赖氨酸）(已配)
•（4）60%乙醇（50ml/组 ） •（5）样品液：每ml含0.5-50ug氨基酸（已配） •（6）分光光度计 •（7）水浴锅
三、操作方法
1、标准曲线的制作
• 分别取0， 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的 标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加 入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充 分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min， 用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%乙醇稀释， 充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯 氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570 为纵坐标，氨酸酸样品的测定：
• 取样品液1ml，加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮 显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min，自 来水冷却。放置5min后，加3ml60%乙醇稀释，摇 匀后测定OD570（生成的颜色在60min内稳定）
• 将样品测定的OD570与标准曲线对照，可确定样品 中氨基酸的含量