SD大鼠光老化模型中氧化性损伤及灯盏花素的保护作用

SD 大鼠光老化模型中氧化性损伤及灯盏花素的保护作用
杨汝斌
1
万屏刘玲何黎（昆明医学院第一附属医院皮肤科，云南昆明650032）
〔摘
要〕目的探讨灯盏花素抗光老化的作用机制，为防治光老化性疾病提供实验依据。

方法
SD 大鼠随机分成6组，模拟日光中UV
（UVA +UVB ）长期照射，造成皮肤光老化模型。

观察皮肤的组织结构和胶原纤维改变；测定各组SD 大鼠皮肤中的超氧化物歧化酶（SOD ）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-Px ）、丙二醛（MDA ）、羟脯氨酸（HYP ）含量。

结果
灯盏花素中、高剂量组大鼠皮肤红斑、脱屑、皱纹等光老化改变明显比模型组轻。

灯
盏花素低、中、高剂量组皮肤光老化病理改变逐渐减轻。

模型对照组SD 大鼠皮肤组织中SOD 、GSH-Px 活性明显降低，HYP 含量显著减少，MDA 含量明显增加（P ＜0.01）；灯盏花素中、高剂量组的皮肤组织中SOD 、GSH-Px 活性和HYP 含量明显增高而MDA 降低（P ＜0.01）。

结论灯盏花素可通
过抑制氧自由基的生成，降低SOD 及GSH-Px 消耗，提高SOD 及GSH-Px 活力，抑制MDA 的合成和含量升高，从而减少紫外线引起的氧化损伤，发挥
其抗光老化作用。

〔关键词〕灯盏花素；光老化；羟脯氨酸；超氧化物歧化酶；过氧化物酶；丙二醛〔中图分类号〕R285
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）06-1180-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.06.031
Effect of breviscapin inhibiting oxidative stress in the skin of SD rat photoaging model
YANG Ru-Bin ，WAN Ping ，LIU Ling ，et al .
The First People's Hospital of Kunming ，Kunming 650010，Yunnan ，China
【Abstract 】Objective To investigate the mechanisms of breviscapin against skin photoaging and provide laboratory data for treat-ment of photoaging diseases.Methods Healthy SD rats were divided into 6groups randomly and gavaged respectively.SD rats were irradia-ted to simulate skin photoageing by ultraviolet irradiation （UVA and UVB ）.Changes of the organization structure and collagen fiber of rat
skin were observed.Changes of the contents of dermal hydroxyproline （HYP ）and malond-ialdehyde （MDA ），as well as the activity of super-oxide dismutase （SOD ）and glutathione peroxidase （GSH-Px ）were measured.Results Significant photoaging-character in the rat of model
group appeared in visual inspection.Oral administration of the model +medium-breviscapin 70mg /kg Group （E ）and model +high brevis-capin 140mg /kg group （F ）significantly prevented wrinkle formation in part of photoaging-character including skin erythema ，desquamating ，
wrinkling and those photoaging characteristics were lighten compared with model group.In model +low-breviscapin 35mg /kg group （D ），
group （E ）and group （F ）：the photoaging characteristics gradually were lighten in Group E and F ，the activity of SOD ，GSH-Px and the
content of HYP of dermal was decreased ，while the content of the MDA was increased obviously （P ＜0.01）.But there was no statistical difference between Group （E ），Group （F ）and between Group （B ），Group （D ）（P ＞0.05）.Conclusions Breviscapin might play anti-photoaging role by inhibiting the production of free radical and the lipid peroxidation ，decreasing SOD ，GSH-Px and MDA ，elevating the ac-tivity SOD ，GSH-Px and then reducing oxidative damage induced by ultraviolet irradiation.
【Key words 】Breviscapin ；Photoaging ；HYP ；SOD ；GSH-Px ；MDA
基金项目：云南省应用基础研究面上项目（2008ZC115M ）1
大理学院附属医院
通讯作者：万
屏（1962-），女，教授，主要从事大疱性皮肤病及变态反应性皮肤病研究。

第一作者：杨汝斌（1978-），男，住院医师，在读硕士，主要从事皮肤外科
和变态反应性疾病的研究。

皮肤光老化临床表现为皮肤表面粗糙、松弛、下垂，出现粗深皱纹和局部色斑等。

皮肤光老化程度随日照时间延长而加重，随紫外线辐射剂量增加而增加。

保持皮肤活性与美感并减慢皮肤老化过程可以保持年轻的容貌，对整个机体都有很大益处。

本研究通过建立大鼠光老化模型，选择超氧化物歧化酶（SOD ）、谷胱苷肽过氧化物酶（GSH-Px ）、丙二醛（MDA ）为观察氧化损伤的指标从不同层面观察系统性应用天然抗氧化剂灯盏花素对紫外线相关生物效应的干预作用，旨在寻找更经济、安全有效、新型的皮肤光老化防护药剂提供可靠的科学依据。

1材料与方法
1.1
动物、主要试剂及设备
健康雄性SD 大鼠，60只，体重
（170ʃ20）g ，实验所用动物均由昆明医学院实验动物中心提供
〔动物批号SCXK （滇）2005-0008〕。

灯盏花素（云南植物药业有限公司）。

SOD 、
GSH-Px 、MDA 、HYP 试剂盒（南京生物建成有限公司）。

SS-04AB 紫外线光疗仪（UVB 发射光谱260 350nm ，峰值311nm ；UVA 发射光谱340 400nm ，峰值365nm ），UVB 和UVA 型UV 辐照计（上海希格玛高技术有限公司）；紫外光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2
动物分组及给药方法
健康雄性SD 大鼠60只，随机分
为6组，给药方式：正常对照组和模型组给予生理盐水；阳性药
物对照组给予维生素E 30mg /kg ，低、中、高剂量灯盏花素组分别给予35、70、140mg /kg 灯盏花素溶液。

每天给药一次，各组均以灌胃方式给药，灌胃容积（20ml /kg ）；维生素E 胶丸用玉米油（金龙油牌）溶解，
灯盏花素用0.86%生理盐水溶解。

正常对照组及模型对照组灌胃生理盐水（20ml /kg ）。

各组均用剪毛剪剪除5cm ˑ5cm 区域的大鼠背部毛发，以后每次照射
前剃须刀剃毛。

1.3动物饲养条件大鼠按组别分笼饲养，5只一笼分笼饲养。

在自然相同环境下（昼夜交替12h），常规饲食饮水，无不良因素影响，饲养1w适应实验室环境后开始进行实验。

1.4照射方式动物适应性喂养1w，第2周开始隔日照射，开始每次照射时间为30min，以后每2周照射时间延长10min，12w时每次照射时间为80min，14w终止UV暴露（UVA照射强度累计为148.5J/cm2，UVB辐照强度累计为21.38J/cm2），然后观察1w。

1.5组织取材大鼠脱颈椎处死以后，迅速取下皮肤块，刮去皮下脂肪组织，滤纸吸干血液；取皮肤组织块0.2g在冰冷的生理盐水中漂洗，加9倍冷的0.86%生理盐水制成10%的组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液检测。

同时取背部1cm2的老化皮肤组织切片，进行常规HE染色。

1.6统计学方法数据以xʃs表示，组间比较应用SPSS11.5软件进行方差分析。

2结果
2.1肉眼观察见图1。

肉眼观察模型组SD大鼠背部照射区域，皮肤表现为进行性弹性丧失，皱纹变粗深，出现皮革样外观，并伴有脱屑等光老化改变；正常组皮肤色泽正常，弹性好；各给药组皮肤光老化改变较模型组轻，其中灯盏花素中剂量组较低剂量组轻，高剂量组较中剂量轻，维生素E组光老化改变最轻。

2.2组织学观察SD大鼠光老化模型皮肤的病理改变见图2。

正常组表皮细胞排列整齐，表皮-真皮分界清楚；真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致，细胞成分及数量适中。

模型组表皮明显增厚，表皮结构不甚完整，分层不清；表皮突及真皮乳头消失；真皮纤维变性、排列紊乱，分布不均或稀疏，有较多的炎性细胞浸润。

灯盏花素低剂量组表皮细胞排列紊乱；真皮层可见胶原纤维变性，损伤较模型组轻。

中剂量组皮肤损伤程度较轻；高剂量组皮肤组织损伤较中剂量组稍轻。

维生素E组光老化改变最轻。

2.2.1皮肤组织SOD活性测定见表1。

灯盏花素高、中剂量对UV所致SD大鼠皮肤SOD活性的下降具有明显抑制作用（P＜0.01）。

低剂量组与模型组比较SOD活性有所提高，高剂量组与中剂量组比较SOD活性有所提高，维生素E组与灯盏花素高剂量组比较SOD活性有所提高，但均没有统计学意义（P＞0.05）。

2.2.2皮肤组织GSH-Px活性测定见表1。

灯盏花素高剂量、中剂量对UV所致SD大鼠光老化皮肤中GSH-Px活性的下降具有明显抑制作用（P＜0.01）。

低剂量组与模型组比较GSH-Px活性有所提高（P＜0.01），高剂量组与中剂量组比较GSH-Px活性有所提高（P＜0.05），维生素E组与灯盏花素高剂量组GSH-Px活性有所提高（P＜0.05）。

2.2.3皮肤组织MDA含量测定见表1。

灯盏花素高剂量、中剂量组能明显下调UV照射所致SD大鼠光老化皮肤中MDA 的含量（P＜0.01）。

低剂量组与模型组比较MDA含量有所减少，高剂量组与中剂量组比较MDA含量有所减少，维生素E组与灯盏花素高剂量组比较MDA含量有所减少，但均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.4HYP含量见表1。

灯盏花素高剂量、中剂量对UV所致SD大鼠皮肤HYP含量的下降具有明显抑制作用（P＜0.01）。

维生素E组与高剂量组比较HYP含量有所提高（P＜0.05）；低剂量组与模型组比较HYP含量有所提高，高剂量组与中剂量组比较HYP含量有所提高，但均无统计学意义（P＞0.05）。

表1SOD、GSH-Px、MDA在SD大鼠皮肤匀浆中的含量（xʃs）
组别n SOD（U/mgprot）GSH-Px（活力单位）MDA（nmol/mgprot）HPY（nml/mgprot）正常组10580.58ʃ35.342）167.25ʃ11.072） 6.87ʃ0.512） 6.41ʃ0.592）模型组10402.84ʃ46.821）117.51ʃ14.301）10.18ʃ0.691） 4.62ʃ0.281）维E组10522.82ʃ39.031）2）155.34ʃ15.021）2）7.37ʃ0.771）2） 5.76ʃ0.522）灯盏花低剂量组10438.97ʃ17.271）2）130.99ʃ9.681）2）8.83ʃ0.441）2） 4.80ʃ0.391）灯盏花中剂量组10472.80ʃ30.141）2）144.35ʃ8.831）2）8.19ʃ0.611）2） 5.17ʃ0.221）2）灯盏花高剂量组10504.39ʃ26.911）148.54ʃ12.891）2）7.80ʃ0.452） 5.41ʃ0.241）2）与正常组比较：1）P＜0.01；与模型组比较：2）P＜0.
01
图1SD大鼠皮肤外观
·1811
·杨汝斌等SD大鼠光老化模型中氧化性损伤及灯盏花素的保护作用第6期
图2
SD 大鼠皮肤组织病理改变（HE ，ˑ200）
3
讨
论
皮肤是机体直接暴露于外界环境的第一屏障，具有完善的抗氧化防御系统，是否能拮抗外界氧化压力，取决于活性氧（ROS ）自由基的产生与消除之间的平衡。

当这种平衡被打破，大量的氧自由基蓄积于体内，就会引起组织的病理损伤，破坏生物膜的完整性及引起细胞结构及其功能发生变化，影响体内核酸的代谢，破坏DNA 的结构，导致基因突变，引起细胞表达分化异常，进而产生癌变〔1，2〕。

紫外线照射人及动物的皮肤后，能够产生较多的ROS 自由基，引起皮肤的氧化损伤，这已被大
量的研究所证实
〔3，4〕。

UV 可通过多种途径激活ROS 的级联反
应，使皮肤中ROS 浓度异常升高，高浓度的ROS 可与皮肤组分发生复杂的化学反应产生多种生物学效应
〔5〕。

UV 反复照射还
可导致皮肤成纤维细胞线粒体DNA 突变，出现功能缺陷，可在
能量代谢中产生大量ROS ，使皮肤中ROS 浓度异常升高〔6〕。

SOD 和GSH-Px 的活性高低与体内氧化应激状况有着密切的关系，通过对其活性的观察可以推测细胞内自由基的数量、氧化和抗氧化平衡的情况。

本实验表明，
SD 大鼠皮肤经UV 照射12w 后，外观和组织学都表现出明显的光老化改变。

灯盏花素高、中剂量能明显抑制UV 所致大鼠皮肤中SOD 活性的下降，维生素E 与灯盏花素高剂量作用更明显。

MDA 含量能间接反映机体内自由基的活性、产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度，无论在动物模型还是细胞模型水平，经紫外辐照后，其脂质过氧化水平均发生变化，组织或细胞内MDA 的含量随照射时间的延长而增加
〔7，8〕。

本结果表明，
UV 长期照射可致SD 大鼠皮肤MDA 含量显著升高，灯盏花素高剂量、中剂量能明显下调UV 照射所致SD 大鼠光老化皮肤中MDA 的含量，维生素E 与灯盏花素高剂量作用更明显。

皮肤中最丰富的胶原类型是Ⅰ型、Ⅲ型胶原，HYP 是胶原蛋白特有的氨基酸之一，其含量可以间接反映真皮内胶原蛋白含量的变化反映皮肤的衰老程度。

本研究发现灯盏花素具有
延缓光老化皮肤HYP 含量下降的作用。

本研究发现天然植物提取物灯盏花素可以通过增强大鼠光老化皮肤中SOD 、GSH-Px 的活性而降低自由基在皮肤组织中的累积，减少MDA 的生成，从而减少自由基对皮肤的致衰老作用，达到抗皮肤光老化的作用，提示可以考虑使用灯盏花素高、中剂量防治紫外线照射引起的皮肤氧化应激损伤。

4
参考文献
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2
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〔2010-11-30收稿2011-03-10修回〕
（编辑曹梦园）
·2811·中国老年学杂志2012年3月第32卷。