两种导致中国人地中海贫血的新突变基因的鉴定
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因的患者其Ｃｔ藏因ｍＲＮＡ淡达水平与基网型为～８“／眦患者相当，
而明显低于正常对照组；携带，９０突变的Ｂ地贫患者其ｐ珠蛋白基 瓣ｍＲＮＡ表这拳平饔显簿稳。魏羚，我们ｊ丕获终了氆ｌ鞣蛋鑫基嚣 密码子１１８饿斗ＴｃＡ插入突交，并注册（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ＡＹ２６１６７８）；程中国大陆首次发现了一。ｎ协‰地贫类型。这些突变
５
ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｗｏｒｋｓ．ｗｅ ｇｏｔ ｓｏｍｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｌｌ ａｌｐｈａ ｏｒ
ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｔｒａｉｔ ｂｕｔ ｎｏ ｋｎｏｗｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅｓｅ
ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｕｓｅｄ ＤＮＡ ｍａｐｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ，
设计和方法 采蔼整群攘样懿方法，对５６０５镶黪巍祥本霸７７９２镤婚硷祥
零逡行盘滚学表囊分聿厅结会审强入中鬻羹豹瓠８建贫鏊霾簿查毂 流行病学调查繁础上，获得衄液学表型呈小细胞低色素，ＨｂＡ２增 高（Ｂ地贫）或降低（“地贫）而没有已知地贫基因型改变的样本， 包括４例珏地贫德确诊样本ｊ｝珏５侧Ｂ地贫德确诊样本。对于程地 贫德确诊样本，采取瓯、Ｃ‘２纂霆溺痔簿森泰絮豹点突变，采翅铮 对罕见缺失类趔的ｇａｐ．ＰＣＲｑ≮０ｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ和跨断裂点测序的方法 筛焱大片段缺必和确定精确的断裂位点。对于Ｂ地贫待确诊样本， 采惩§臻蛋鑫麓因全长溅净戆方法，筛焱泰知焘突变。逶逑上述 方法鉴定的新的突变基因采用ＲＴ－ＰＣＲ方法研究突变对珠蛋自基
第一军医大学 硕士学位论文 两种导致中国人地中海贫血的新突变基因的鉴定 姓名：贾世奇 申请学位级别：硕士 专业：医学遗传学 指导教师：徐湘民
20040604
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ＩＶＳ－２．６５４（Ｃ－》Ｔ）、一２８（Ａ峥Ｇ）、ＣＤ７１／７２（＋Ａ）、１３５：ＣＤ２６（Ｇ÷∞、
ＣＤｌ７《Ａ斗秘激为常觅。丽辩一些罕觅翡突变基茵魏伐邀贫基因 ．带’１／ａａ、１３地贫慕因ＣＤ３７ ＴＧＧ＂－）ＴＧＡ不断被报道，遮魑罕见突变 錾因类型是对常见突变的充实和必要补充，对于了解一个地区的 遮贫基毽突交漤，建立可蹙戆途贫基因诊獗菝拳其鸯熬要意义。 时罕见突变基图的鉴定，不断完善对地贫基因谱的认识将是一项 长期而连续的工作，需要机遇、职业敏感和不懈的努力。
ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｌ／ｌＯｎ ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｍｉｔｒｏｐｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ｉｔ ｉｓ ａ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｉｎｈｅｌｉｔａｎｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｉｓ ｄｅｆｉｎｅｄ
徐湘民20040604英文缩略词袭英文缩写荚文全称中文全称bpcmdnadntpebaappcrhbkblimminmchmcvmgmlmmngnlodpcrparbcrpmltnabasepair碱基对centimeter厘米degreescentigrade摄氏发deoxyribonucleic脱氧援耱孩酸deoxyribonueleosidetriphosphate脱氧三磷酸核糖核ethylenediaminetetraaceticacid乙二黢器乙酸gramgravity克徽力加速度gappolymemsechainreaction跨越断裂点pcrhemoglobin血红鬣自kilobasemunite分钟meancorpuscularhemoglobin平均纽细胞血红鬣meancorpuscularvalume平均数细胞体积milligram毫克millilitermicrometer微升millimolarperliter毫摩尔没升nanogrampolymerasechainreaction聚合酶链反应powerofhydrogenpn值redbloodcell一红细胞recersedotblot反自袋杂交redbloodcelldistributivewidth红细稳分布宽凄指indexrevolutionperminute每分钟转速ribonuclcicacid核糖缓羧背景和目的地中海贫傲地贫趋种珠蛋白链合成比例失獭的单基因常染色体隐性遗传伐地贫主要由发生于16号染色体短臂末端旺珠缀白基因簇内包含n基因猩内的缺失引超少数由点突变引起趣贫主要由发生予位于ll譬染色俸短爨蛇13基因内的点突变g麓
ａｌｌ ｂｅｔａ ｔｈａｔａｓｓｅｍｉａ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｈｉｎａ．Ｈｏｗｅｖｅｒ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｓｔｉｌｌ ｓｏｍｅ ｎｏｖｅｌ ｏｒ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ａｌｐｈａ ｏｒ ｂｅｔａ
ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｂｅｉｎｇ ｆｏｕｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ．ｓｕｃｈ ａｓ一一’７／ｍ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ＣＤ３７ ＴＧＧ－）ＴＧＡ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ
型存在地域差异，如地中海沿岸国家ａ地贫以ｏ ７／ｔｍ、一ＭＥｏ／眦为
主，丽东南亚圊家以一ｓＥ“，（蛾、一证３１７／帆、，∥２庙啦为主。农我国，地
贫多发生予长江激蠢逸送，楚荚鞋广东、广器、海豢麓疑发，毡邀
贫基因型以缺必型突变一ｓＥ６／眠．Ｃｔ３。，呱。舻。恤为主，点突变毡ｃｓａ／嗽
ＯＣＱ８ａ触也比较常见，Ｂ地贫突变类烈以ＣＤ４１／４２（．ＴＣＴＴ）、
反自袋杂交
ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ ｗｉｄｔｈ红细稳分布宽凄指
ｉｎｄｅｘ
数
ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｃｉｃ ａｃｉｄ
每分钟转速 核糖缓羧
２
攮
要
背景和目的
地中海贫傲（地贫）趋～种珠蛋白链合成比例失獭的单基因 遗侮癍，豢受镶臻蛋鑫豹不弼分隽程遮贫帮ｔ３遗贫嚣大炎。均呈 常染色体隐性遗传，伐地贫主要由发生于１６号染色体短臂末端旺 珠缀白基因簇内包含ｎ基因猩内的缺失引超，少数由点突变引起， §趣贫主要由发生予位于ｌｌ－譬染色俸短爨蛇１３基因内的点突变ｇ｝ 麓。世界范围内遗贫分布予热带、亚热带缝区，并麓缝贫基因类
ｂｙ ａｌｐｈａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ａｌｐｈａ ｏｒ ｂｅｔａ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ
ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ｏｆｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．
ｉｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｕｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｓ‘ｎｏｒｍａｌ’ｉｓ ｔｅｓｔｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ．Ｔｈａｔ ｉｓ，ｃｏｒｄ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ：ｃｌｎｓｔｅｒ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｌｌｅｃｔ ｓａｍｐｌｅｓ． Ａｂｏｕｔ ５６０６ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ７７９２ ｐｅｒｉｐｈｅｍｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ
ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．Ｗｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｏｄ
ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ
微升
ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒｐｅｒ ｌｉｔｅｒ
ｎａｎｏｇｒａｍ
ｍｉｃｌｅｏｔｉｄｅ
毫摩尔没升
纳克
核营酸
ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
竞密嶷 聚合酶链反应
ｐｏｗｅｒ ｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎ ｒｅｄｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ
ｐｎ值 一红细胞
ｒｅｃｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ
ｇａｐ·ＰＣＲ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｉｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｙ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．
Ｉｎ ｃｈｉｎａ，ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ａｌｐｈａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｒｅ ～８ＥＡ／Ｕａ、．ｃｔ３．７／ａａ、ａｎｄ．∥一／ａｃｔ，ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ａｎｄ
∥８０ｔ／ｅ．ａ、≯８ａ／ｅａ，ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｂＹ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ。Ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ａｌｅ ｔｗｏ ｗａｙｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｏｒ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ
ｃａｕｓｉｎｇ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ． Ｒｅｃｅｎｔｌｙ， ｗｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ａ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ＥＶｅ ｃｉｔｉｅｓ ｂｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ａ ｌｏｃａｌｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｈｕｉ ｃｉｔｙ ｂｙ
舞
ｍｕｎｉｔｅ
分钟
ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ
平均纽细胞血红鬣
白量
ｍ凇ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ平缘缎缓施盘筑鬣
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
白浓殿
ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖａｌｕｍｅ ｍｉｌｌｉｇｒａｍ ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ
平均数细胞体积 毫克 毫舞
ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ
ｇａｐ—ＰＣＲ ａｎｄ ＲＤＢ ａｉｍｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈ ｃｈｉｎａ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗｈｉｃｈ ｈａｅｍａｔｏｌｏ＃ｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ
ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ
溴化乙键
ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｇｒａｍ，ｇｒａｖｉｔｙ ｇａｐ ｐｏｌｙｍｅｍｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｋｉｌｏｂａｓｅ
乙二黢器｜乙酸 克，徽力加速度 跨越断裂点ＰＣＲ 血红鬣自 子碱慕辩
ｌｉｔｅｒ
簇因瓣发现丰察了地中海贫斑的基因类淤，加深了对中国人群中 魏贫类墅豹试识，为墓嚣诊辑提供了必鬟豹分子墓镶，目对为串 融人群地贫基因的分子进化机制的研究提供了参考。
关键诿
毡遮中海贫盘毅突变基因 §遣孛海贫搬凝突变基毽
ＤＮＡ测序 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＲＴ－ＰＣＲ 基因诊断
４
Ａ器ＳＴ嚣ＡＣ薯
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｕｎｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ
ｍＭ
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ＯＤ ｐＣＲ ｐａ
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ｌ∞Ｗ
ｒｐｍ ｌｔＮＡ
荚文全称
中文全称
ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ
碱基对 厘米
ｄｅｇｒｅｅ（ｓ）ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ
摄氏发
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ
脱氧援耱孩酸
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｅｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ 脱氧三磷酸核糖核
酸
导致地贫的罕见突变基强螅鉴定主要蠢２个来源。一是来源 予绉床瘸久，二是来源予大入群速贫基闲筛查。最：ｉ篷，在我饲避 行的广东省５个中心城市ａ、Ｄ地贫流彳亍痫调查和四会市ａ、Ｂ地 贫现场调查的撼础上，获得糟干具有ａ或Ｂ地贫临床液型但采用 镑黠中国入露凳圭｜羹贫类墼戆簇霞诊凝寒发现突变豹撵本，我销辩 这些样本进行了突变的鉴定和ｍＲＮＡ表达水平的研究。
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｏｒ ｔａｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｓ ａ ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ
ａｎｄ ｓｅｒｉａｔｅ ｗｏｒｋ，ｗｈｉｃｈ ｎｅｅｄｓ ｃｈａｎｃｅ，Ｉｃｅｅｎｎ ｗｏｒｋ．
Ｔｅｓｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｔｒａｉｔ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｏｐｌｅ ｉｎ
因功能的影响。
缝暴帮谗谂
获得了一种新的缺失¨＋ｌｋｂ包括ｎ１、￡ｔ２基因在内的Ｇｔ地贫基 因和一种在中阐人群中首次发现的位于６珠蛋白基因启动子区一９０ 位瞧Ｃ＇－）Ｔ突变基医，并在ＧｅｎｅＢａｎｋ淫冕晕，注煺号分别为： ＡＹ３４２３９２、ＡＹ２６０７４０。ＲＴ－ＰＣＲ显示携带铰失１ｌ。ｌｋｂ豹镊突变辇
ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｅ ｎｏｖａ ｏｒ ｌ＿＿ｒｅ ｍｎｔａｔｉｏｎｓ ａｌｅ ｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｆｏｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｏｆ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ａｒｅａｓ，ｗｈｉｃｈ ｂｅｎｅｆｉｔ ｔｏ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．
ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｒｅ ＣＤ４１／４２（·ＴＣＴＴ）、
ＩＶＳ一２—６５４（Ｃ－－＞Ｔ）、一２８（Ａ砷Ｇ）、ＣＤ７１／７２（＋Ａ）、旷：ＣＤ２６（Ｇ－－＞Ａ）、
ＣＤｌ７（ＡｊＴ），ｗｈｉｃｈ ａｌｅ ａｌｌ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｆｆｅｒ ｕｐ ９０％ｏｆ ｔｈｅ
而明显低于正常对照组；携带，９０突变的Ｂ地贫患者其ｐ珠蛋白基 瓣ｍＲＮＡ表这拳平饔显簿稳。魏羚，我们ｊ丕获终了氆ｌ鞣蛋鑫基嚣 密码子１１８饿斗ＴｃＡ插入突交，并注册（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ＡＹ２６１６７８）；程中国大陆首次发现了一。ｎ协‰地贫类型。这些突变
５
ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｗｏｒｋｓ．ｗｅ ｇｏｔ ｓｏｍｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｌｌ ａｌｐｈａ ｏｒ
ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｔｒａｉｔ ｂｕｔ ｎｏ ｋｎｏｗｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅｓｅ
ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｕｓｅｄ ＤＮＡ ｍａｐｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ，
设计和方法 采蔼整群攘样懿方法，对５６０５镶黪巍祥本霸７７９２镤婚硷祥
零逡行盘滚学表囊分聿厅结会审强入中鬻羹豹瓠８建贫鏊霾簿查毂 流行病学调查繁础上，获得衄液学表型呈小细胞低色素，ＨｂＡ２增 高（Ｂ地贫）或降低（“地贫）而没有已知地贫基因型改变的样本， 包括４例珏地贫德确诊样本ｊ｝珏５侧Ｂ地贫德确诊样本。对于程地 贫德确诊样本，采取瓯、Ｃ‘２纂霆溺痔簿森泰絮豹点突变，采翅铮 对罕见缺失类趔的ｇａｐ．ＰＣＲｑ≮０ｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ和跨断裂点测序的方法 筛焱大片段缺必和确定精确的断裂位点。对于Ｂ地贫待确诊样本， 采惩§臻蛋鑫麓因全长溅净戆方法，筛焱泰知焘突变。逶逑上述 方法鉴定的新的突变基因采用ＲＴ－ＰＣＲ方法研究突变对珠蛋自基
第一军医大学 硕士学位论文 两种导致中国人地中海贫血的新突变基因的鉴定 姓名：贾世奇 申请学位级别：硕士 专业：医学遗传学 指导教师：徐湘民
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ＣＤｌ７《Ａ斗秘激为常觅。丽辩一些罕觅翡突变基茵魏伐邀贫基因 ．带’１／ａａ、１３地贫慕因ＣＤ３７ ＴＧＧ＂－）ＴＧＡ不断被报道，遮魑罕见突变 錾因类型是对常见突变的充实和必要补充，对于了解一个地区的 遮贫基毽突交漤，建立可蹙戆途贫基因诊獗菝拳其鸯熬要意义。 时罕见突变基图的鉴定，不断完善对地贫基因谱的认识将是一项 长期而连续的工作，需要机遇、职业敏感和不懈的努力。
ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｌ／ｌＯｎ ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｍｉｔｒｏｐｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ｉｔ ｉｓ ａ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｉｎｈｅｌｉｔａｎｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｉｓ ｄｅｆｉｎｅｄ
徐湘民20040604英文缩略词袭英文缩写荚文全称中文全称bpcmdnadntpebaappcrhbkblimminmchmcvmgmlmmngnlodpcrparbcrpmltnabasepair碱基对centimeter厘米degreescentigrade摄氏发deoxyribonucleic脱氧援耱孩酸deoxyribonueleosidetriphosphate脱氧三磷酸核糖核ethylenediaminetetraaceticacid乙二黢器乙酸gramgravity克徽力加速度gappolymemsechainreaction跨越断裂点pcrhemoglobin血红鬣自kilobasemunite分钟meancorpuscularhemoglobin平均纽细胞血红鬣meancorpuscularvalume平均数细胞体积milligram毫克millilitermicrometer微升millimolarperliter毫摩尔没升nanogrampolymerasechainreaction聚合酶链反应powerofhydrogenpn值redbloodcell一红细胞recersedotblot反自袋杂交redbloodcelldistributivewidth红细稳分布宽凄指indexrevolutionperminute每分钟转速ribonuclcicacid核糖缓羧背景和目的地中海贫傲地贫趋种珠蛋白链合成比例失獭的单基因常染色体隐性遗传伐地贫主要由发生于16号染色体短臂末端旺珠缀白基因簇内包含n基因猩内的缺失引超少数由点突变引起趣贫主要由发生予位于ll譬染色俸短爨蛇13基因内的点突变g麓
ａｌｌ ｂｅｔａ ｔｈａｔａｓｓｅｍｉａ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｈｉｎａ．Ｈｏｗｅｖｅｒ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｓｔｉｌｌ ｓｏｍｅ ｎｏｖｅｌ ｏｒ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ａｌｐｈａ ｏｒ ｂｅｔａ
ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｂｅｉｎｇ ｆｏｕｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ．ｓｕｃｈ ａｓ一一’７／ｍ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ＣＤ３７ ＴＧＧ－）ＴＧＡ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ
型存在地域差异，如地中海沿岸国家ａ地贫以ｏ ７／ｔｍ、一ＭＥｏ／眦为
主，丽东南亚圊家以一ｓＥ“，（蛾、一证３１７／帆、，∥２庙啦为主。农我国，地
贫多发生予长江激蠢逸送，楚荚鞋广东、广器、海豢麓疑发，毡邀
贫基因型以缺必型突变一ｓＥ６／眠．Ｃｔ３。，呱。舻。恤为主，点突变毡ｃｓａ／嗽
ＯＣＱ８ａ触也比较常见，Ｂ地贫突变类烈以ＣＤ４１／４２（．ＴＣＴＴ）、
反自袋杂交
ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ ｗｉｄｔｈ红细稳分布宽凄指
ｉｎｄｅｘ
数
ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｃｉｃ ａｃｉｄ
每分钟转速 核糖缓羧
２
攮
要
背景和目的
地中海贫傲（地贫）趋～种珠蛋白链合成比例失獭的单基因 遗侮癍，豢受镶臻蛋鑫豹不弼分隽程遮贫帮ｔ３遗贫嚣大炎。均呈 常染色体隐性遗传，伐地贫主要由发生于１６号染色体短臂末端旺 珠缀白基因簇内包含ｎ基因猩内的缺失引超，少数由点突变引起， §趣贫主要由发生予位于ｌｌ－譬染色俸短爨蛇１３基因内的点突变ｇ｝ 麓。世界范围内遗贫分布予热带、亚热带缝区，并麓缝贫基因类
ｂｙ ａｌｐｈａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ａｌｐｈａ ｏｒ ｂｅｔａ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ
ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ｏｆｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．
ｉｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｕｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｓ‘ｎｏｒｍａｌ’ｉｓ ｔｅｓｔｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ．Ｔｈａｔ ｉｓ，ｃｏｒｄ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ：ｃｌｎｓｔｅｒ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｌｌｅｃｔ ｓａｍｐｌｅｓ． Ａｂｏｕｔ ５６０６ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ７７９２ ｐｅｒｉｐｈｅｍｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ
ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．Ｗｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｏｄ
ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ
微升
ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒｐｅｒ ｌｉｔｅｒ
ｎａｎｏｇｒａｍ
ｍｉｃｌｅｏｔｉｄｅ
毫摩尔没升
纳克
核营酸
ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
竞密嶷 聚合酶链反应
ｐｏｗｅｒ ｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎ ｒｅｄｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ
ｐｎ值 一红细胞
ｒｅｃｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ
ｇａｐ·ＰＣＲ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｉｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｙ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．
Ｉｎ ｃｈｉｎａ，ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ａｌｐｈａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｒｅ ～８ＥＡ／Ｕａ、．ｃｔ３．７／ａａ、ａｎｄ．∥一／ａｃｔ，ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ａｎｄ
∥８０ｔ／ｅ．ａ、≯８ａ／ｅａ，ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｂＹ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ。Ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ａｌｅ ｔｗｏ ｗａｙｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｏｒ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ
ｃａｕｓｉｎｇ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ． Ｒｅｃｅｎｔｌｙ， ｗｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ａ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ＥＶｅ ｃｉｔｉｅｓ ｂｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ａ ｌｏｃａｌｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｈｕｉ ｃｉｔｙ ｂｙ
舞
ｍｕｎｉｔｅ
分钟
ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ
平均纽细胞血红鬣
白量
ｍ凇ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ平缘缎缓施盘筑鬣
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
白浓殿
ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖａｌｕｍｅ ｍｉｌｌｉｇｒａｍ ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ
平均数细胞体积 毫克 毫舞
ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ
ｇａｐ—ＰＣＲ ａｎｄ ＲＤＢ ａｉｍｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈ ｃｈｉｎａ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗｈｉｃｈ ｈａｅｍａｔｏｌｏ＃ｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ
ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ
溴化乙键
ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｇｒａｍ，ｇｒａｖｉｔｙ ｇａｐ ｐｏｌｙｍｅｍｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｋｉｌｏｂａｓｅ
乙二黢器｜乙酸 克，徽力加速度 跨越断裂点ＰＣＲ 血红鬣自 子碱慕辩
ｌｉｔｅｒ
簇因瓣发现丰察了地中海贫斑的基因类淤，加深了对中国人群中 魏贫类墅豹试识，为墓嚣诊辑提供了必鬟豹分子墓镶，目对为串 融人群地贫基因的分子进化机制的研究提供了参考。
关键诿
毡遮中海贫盘毅突变基因 §遣孛海贫搬凝突变基毽
ＤＮＡ测序 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＲＴ－ＰＣＲ 基因诊断
４
Ａ器ＳＴ嚣ＡＣ薯
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｕｎｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ
ｍＭ
ｎｇ
ｎｌ
ＯＤ ｐＣＲ ｐａ
黼ＲＢＣ
ｌ∞Ｗ
ｒｐｍ ｌｔＮＡ
荚文全称
中文全称
ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ
碱基对 厘米
ｄｅｇｒｅｅ（ｓ）ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ
摄氏发
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ
脱氧援耱孩酸
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｅｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ 脱氧三磷酸核糖核
酸
导致地贫的罕见突变基强螅鉴定主要蠢２个来源。一是来源 予绉床瘸久，二是来源予大入群速贫基闲筛查。最：ｉ篷，在我饲避 行的广东省５个中心城市ａ、Ｄ地贫流彳亍痫调查和四会市ａ、Ｂ地 贫现场调查的撼础上，获得糟干具有ａ或Ｂ地贫临床液型但采用 镑黠中国入露凳圭｜羹贫类墼戆簇霞诊凝寒发现突变豹撵本，我销辩 这些样本进行了突变的鉴定和ｍＲＮＡ表达水平的研究。
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｏｒ ｔａｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｓ ａ ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ
ａｎｄ ｓｅｒｉａｔｅ ｗｏｒｋ，ｗｈｉｃｈ ｎｅｅｄｓ ｃｈａｎｃｅ，Ｉｃｅｅｎｎ ｗｏｒｋ．
Ｔｅｓｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｔｒａｉｔ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｏｐｌｅ ｉｎ
因功能的影响。
缝暴帮谗谂
获得了一种新的缺失¨＋ｌｋｂ包括ｎ１、￡ｔ２基因在内的Ｇｔ地贫基 因和一种在中阐人群中首次发现的位于６珠蛋白基因启动子区一９０ 位瞧Ｃ＇－）Ｔ突变基医，并在ＧｅｎｅＢａｎｋ淫冕晕，注煺号分别为： ＡＹ３４２３９２、ＡＹ２６０７４０。ＲＴ－ＰＣＲ显示携带铰失１ｌ。ｌｋｂ豹镊突变辇
ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｅ ｎｏｖａ ｏｒ ｌ＿＿ｒｅ ｍｎｔａｔｉｏｎｓ ａｌｅ ｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｆｏｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｏｆ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ａｒｅａｓ，ｗｈｉｃｈ ｂｅｎｅｆｉｔ ｔｏ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．
ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｒｅ ＣＤ４１／４２（·ＴＣＴＴ）、
ＩＶＳ一２—６５４（Ｃ－－＞Ｔ）、一２８（Ａ砷Ｇ）、ＣＤ７１／７２（＋Ａ）、旷：ＣＤ２６（Ｇ－－＞Ａ）、
ＣＤｌ７（ＡｊＴ），ｗｈｉｃｈ ａｌｅ ａｌｌ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｆｆｅｒ ｕｐ ９０％ｏｆ ｔｈｅ