大剂量糖皮质激素对骨髓间充质干细胞成骨分化的MiroRNA的调控作用

2017年12月
骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSC）是骨髓中一类具有向多种组织细胞分化能力的成骨干细胞[1]。

当BMSC向成骨细胞分化的能力下降时，骨生成会受到抑制，这时人体患有股骨头坏死的风险增大。

研究表明，50%以上的股骨头坏死是由大量使用激素导致的，激素作为临床中常见的治疗药物，在持续用药2~3个月就会增大患者股骨头坏死的风险[2]。

BMSC表面具有糖皮质激素受体，其与糖皮质激素结合会抑制BMSC的增殖和成骨分化，使BMSC增殖能力及成骨分化能力明显降低，而成脂分化能力得到增强[3]。

而在控制
BMSC生成的基因调控中MiroRNA具有极其重要的调控作用。

MiroRNA是对基因进行转录后调控的一段非编码RNA，主要是通过与靶mRNA特异性结合从而使mRNA降解或翻译受到抑制。

因此，研究不同浓度的地塞米松对MiroRNA表达调控的影响对研究BMSC的成骨分化具有重要意义。

1资料与方法
1.1BMSC的分离培养
选取2015年7月至2016年3月我院收治的行髋关节置换手术的患者1例为研究对象，该患者无大剂量激素使用史、长期酗酒史及其它自身免疫疾病史。

（1）BMSC的分离。

①人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的获取：在患者签署知情同意书的情况下，于人工全髋关节置换手术过程中，利用无菌骨髓穿刺针抽取骨髓组织10mL，迅速注入含有培养基及肝素抗凝的试管内，混合均匀后于4℃保存备用。

②hBMSCs的分离：从人体骨髓组织中分离hBMSCs的方法参照Gillet的方法进行。

（2）hBMSCs的接种及扩增。

将分离得到的hBMSCs单细胞以2×106/mL的密度接种于培养液中，37℃培养箱培养。

当细胞密度达70%~80%时，用胰酶常规消化，细胞按照水平震荡法进行传代，为了使试验结果具有更好的可比性，试验中使用的细胞均为第3代细胞。

1.2不同浓度地塞米松诱导BMSC成骨分化
分别以10-8mol/L及10-10mol/L浓度的地塞米松诱导第三代hBMSCs分化，作为10-8组和10-10组，研究骨钙蛋白、骨桥蛋白及碱性磷酸酶的浓度变化。

大剂量糖皮质激素对骨髓间充质干细胞成骨分化的
MiroRNA的调控作用
赵光辉，李辉，王志远
（西安市红会医院，陕西西安，710054）
摘要:目的探究不同浓度糖皮质激素对骨髓间充质干细胞（BMSC）成骨分化的MicroRNA的调控作用。

方法利用10-8mmol/L 及10-10mmol/L两组浓度地塞米松对BMSC进行诱导，对比研究诱导7、14d时骨钙蛋白、骨桥蛋白及碱性磷酸酶的浓度变化。

结果诱导7d时，两组的骨桥蛋白浓度均呈现升高趋势，且10-10组骨桥蛋白浓度明显高于10-8组（P<0.05）。

诱导14d时，10-8组骨钙蛋白及骨桥蛋白的浓度降低，而10-10组骨钙蛋白及骨桥蛋白的浓度升高，且10-10组骨钙蛋白的浓度及骨桥蛋白明显高于10-8组（P<0.05）。

诱导14d时，10-8组碱性磷酸酶浓度升高，10-10组碱性磷酸酶浓度降低，10-10组明显低于10-8组（P<0.05）。

结论高浓度的糖皮质激素诱导MicroRNA调控BMSC向脂肪细胞分化，抑制其向骨细胞分化。

关键词:地塞米松；骨髓间充质干细胞；MicroRNA
中图分类号:R681文献标志码:A文章编号:2096-1413(2017)34-0011-02
Regulatory role of high doses of glucocorticoids on MiroRNA in osteogenic differentiation
of bone mesenchymal stem cells
ZHAO Guang-hui,LI Hui,WANG Zhi-yuan
(Xi'an Honghui Hospital,Xi'an710054,China)
ABSTRACT:Objective To explore the regulation of different doses of glucocorticoids on MiroRNA in osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells.Methods BMSC were induced by10-8mmol/L and10-10mmol/L of dexamethasone in two groups,and the concentration changes of osteocalcin,osteopontin and alkaline phosphatase at induced7and14days were compared.Results At induced7days,the concentrations of osteopontin in the two groups increased,and that in the10-10group was higher than the10-8group(P<0.05).At induced14days,the concentrations of osteocalcin and osteopontin in the10-8group decreased,and those in the10-10group increased,and those of the10-10group higher than the10-8group(P<0.05).At induced14days,the concentration of alkaline phosphatase in the10-8group increased,that in the10-10group decreased,and that in the10-10group was lower than the10-8group(P<0.05).Conclusion High concentration of glucocorticoids induced MicroRNA to regulate the differentiation of BMSC into adipocytes,and inhibit the differentiation of osteoblasts into adipocytes.
KEYWORDS:dexamethasone;bone mesenchymal stem cells;MicroRNA
DOI:10.19347/ki.2096-1413.201734005
作者简介：赵光辉（1976-），男，汉族，陕西西安人，副主任医师，硕士。

研究方向：骨关节坏死重建。

基金项目：陕西省科技厅2014年自然科学基金（No.2014JM4156）。

临床医学
11
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2017年12月
表1不同浓度地塞米松诱导下骨钙蛋白浓度比较（x ⎺
±s ）组别诱导天数
0d 7d 14d 10-8组 1.00±0.00 1.52±0.25 1.09±0.0410-10组 1.00±0.00 1.95±0.33 3.24±0.16t
― 1.732 6.875P
―
0.082
0.014
表2不同浓度地塞米松诱导下骨桥蛋白浓度比较（x ⎺
±s ）组别诱导天数
0d 7d 14d 10-8组 1.00±0.00 3.42±0.15 1.86±0.1410-10组 1.00±0.007.09±0.138.02±0.87t
― 6.8329.975P
―
0.024
0.000
（1）碱性磷酸酶染色。

利用试剂盒法对碱性磷酸酶的浓度进行检测，细胞内的碱性磷酸酶会在pH 9.4~9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX 产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

（2）相关成骨基因表达的检测。

试剂盒选用SYBR Premix TaqTM 试剂盒，在Step One 实时定量PCR 仪上运行real-time PCR 。

在每个模板上的每个基因设置3个重复孔，独立的实验
重复3次。

1.3观察指标
观察不同浓度地塞米松诱导下骨钙蛋白、
骨桥蛋白及碱性磷酸酶浓度。

控制骨钙蛋白翻译的MicroRNA 抑制作用越强，hBMSCs 向成骨细胞的分化能力越低。

骨桥蛋白为另一个表示hBMSCs 向骨细胞分化的蛋白质[4]。

碱性磷酸酶的存在说明hBMSCs 向脂肪细胞分化[5]。

1.4统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件对所有数据进行分析，
计数资料用n/%表示，用χ2检验，计量资料采用x ⎺
±s 表示，进行t 检验，P <0.05为差异具有统计学意义，P <0.01为差异具有显著统计学意义。

2结果
2.1不同浓度地塞米松诱导下骨钙蛋白浓度比较
当应用地塞米松诱导7d 时，两组地塞米松浓度下骨钙
蛋白浓度比较，差异无统计学意义（t =1.732，P >0.05）。

地塞米松诱导14d 时，10-8组骨钙蛋白的浓度降低，而10-10组骨钙蛋白的浓度升高。

地塞米松诱导14d 时，10-10组骨钙蛋白的浓度明显高于10-8组，差异具有统计学意义（t =6.875，P <0.05）。

见表1。

2.2不同浓度地塞米松诱导下骨桥蛋白浓度比较
地塞米松诱导7d 时，两组的骨桥蛋白浓度均呈现升
高趋势，且10-10组骨桥蛋白浓度明显高于10-8组（t =6.832，P <0.05）；地塞米松诱导14d 时，10-8组骨桥蛋白浓度降低，10-10组骨桥蛋白浓度升高。

地塞米松诱导14d 时，10-10组骨桥蛋白浓度明显高于10-8组，差异具有统计学意义（t =9.975，P <0.05）。

见表2。

2.3不同浓度地塞米松诱导下碱性磷酸酶浓度比较
地塞米松诱导7d 时，两组碱性磷酸酶浓度比较，
差异无统计学意义（t =0.874，P >0.05）。

地塞米松诱导14d 时，10-8组碱性磷酸酶浓度升高，10-10组碱性磷酸酶浓度降低，10-10组明显低于
10-8组，差异具有统计学意义
（t =8.538，P <0.05）。

见表3。

3讨论
大量糖皮质激素对BMSC 的成骨分化具有抑制作用，虽然目前对其作用机制了解较少，但是通过大量的研究发现糖皮质激素可以与细胞表面的糖皮质激素受体特异性结合，刺激细胞内部信号传递，在细胞内部调节MiroRNA 的表达，进而影响蛋白的翻译[6]。

骨钙蛋白作为BMSC 特异合成分泌的非胶原性蛋白可加强人体代谢功能活性，也是形成骨芽细胞所必须的蛋白质[7]，骨钙蛋白浓度的下降则反应了BMSC 向成骨细胞分化功能的减弱。

另一方面，
骨桥蛋白对成骨也有重要的作用，同时能够调节机体免疫力，在人体多组织中具有重要的作用。

如果骨桥蛋白的生成受到局限，
这样既抑制了BMSC 向成骨细胞的分化又对机体免疫带来负面影响。

通过本研究发现，高浓度的地塞米松对骨钙蛋白及骨桥蛋白的生成都具有明显的抑制作用，这两种蛋白是BMSC 向成骨分化的重要蛋白，说明高浓度的地塞米松可以影响MicroRNA 对蛋白转录后翻译调控。

同时，研究还发现，高浓度的地塞米松可以促进碱性磷酸酶的形成，这说明大量的糖皮质激素能够促进MicroRNA 调控BMSC 向脂肪细胞分化。

因此，碱性磷酸酶也是临床检验骨骼以及肝胆系统疾病的重要指标。

综上所述，在任何疾病的治疗中要尽量避免使用糖皮质激素药物，同时需做好预防患有股骨头坏死的措施。

参考文献院
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表3
不同浓度地塞米松诱导下碱性磷酸酶浓度比较
（x ⎺
±s ）组别
诱导天数
0d 7d 14d 10-8组 1.00±0.00 1.07±0.09 5.08±0.2110-10组 1.00±0.00
0.76±0.060.36±0.07t
―0.8748.538P
―
0.154
0.009
12--。