microRNA

#材料与方法 $&$ 材料 $&$&$ 实验动物 9!雄性大鼠 3% 只"体质量)$0% e)%%* Q.3% 只 9!乳鼠" 鼠龄 $ e(]"体质量)0 e8* Q左右"购于安徽医科大学动物实 验中心"动物许可证号!9?<b) 皖*)%$12%%0# $&$&) 试剂 !W[W培养基( 链 脲 佐 菌 素( ??b28 相 关 试 剂 盒 ) 美 国 P/QOY公司* .:=;!A多克隆抗体(.29W=平滑 肌 肌 动 蛋 白 ) .29OGGDE O`P,NFY,D/-".29W=* 多克隆抗体) 武汉博士德生
关键词O/S2(0'24L.29W=?GNNYQF- #高糖糖尿病心肌病
55糖尿病心肌病) !/YMFD/,,YH]/GOIGLYDEI"!?W* 特征是心 脏早起舒张功能障碍"后期在没有血脂异常"高血压和冠状 动脉疾病情况下出现临床心力衰竭&$' # 心肌纤维化是糖尿 病心肌病典型的病理表现"且会增加心脏衰竭(心律失常和 猝死的危险"故研究心肌纤维化潜在机制是有必要的&)' # 心 肌纤维化发生于心肌受损或承受压力过大时"心肌成纤维细 胞) ?VP* 会被激活并转化为肌成纤维细胞"肌成纤维细胞会 增加沉积在细胞外基质) [aDHY,FNN`NYHOYDH/a[?W* 胶原蛋白 的产量"使心肌僵硬从而发生纤维化&(' # W/,HGST=P是种在 线虫和人类中高度保守的非编码 ST="依靠与 OST=(l非编 码区特异性结合从而 沉 默 靶 基 因&3' # 相 关 文 献 表 明 微 小 ST=在心血管系统中控制各种细胞的功能"例如心肌细胞( 内皮细胞和心肌成纤维细胞&4' # W/,HGST=2(0'24L 作为微小 ST=家族的一员"文献表明参与心肌纤维化的发生"对 ?VP 活化增殖有抑制作用&0' # 但目前尚未有文献表明在糖尿病 心肌病环境下 O/,HGST=2(0'24L 在心肌成纤维细胞活化增殖 中的表达变化# 本实验旨在探究 O/,HGST=2(0'24L 在糖尿病 心肌病背景下在 ?VP活化增殖中的表达变化"为糖尿病心肌 病的治2(0'24L O/S2(0'24L 在糖尿病心肌病心肌组织与心肌成纤维细胞 ,YH]/Y,J/MHGMNYPDP?VP 活化增殖中的表达变化 方法通过腹腔注射链脲佐菌素 9RB 构建大鼠糖尿病心肌病模型体外应用高糖诱导 ?VP细胞活 化增殖模型 利用 A[WYPPG- 染色观察心肌组织病理改变及胶原分布情况 应用 fSR2;?S检测 ?VP细胞中 O/S2(0'24L 的 表达 fSR2;?S和 \FPDFH- MNGDD/-Q实验检测 .29W=?GNNYQF- #OST=与蛋白的表达结果A[和 WYPPG- 染色显示糖尿病心 肌病大鼠心肌胶原沉积明显增多细胞相对排列紊乱细胞大小不一 \FPDFH- MNGDD/-Q实验表明与正常组相比糖尿病组和高 糖组的 .29W=与 ?GNNYQF- #的表达增长fSR2;?S实验表明与正常组相比高糖诱导 ?VP细胞中 O/S2(0'24L 表达降低而 .2 9W=与 ?GNNYQF- #的表达增加 结论O/S2(0'24L 在糖尿病心肌病心肌组织与高糖诱导 ?VP细胞中表达降低提示 O/S2(0'2 4L 可能是影响糖尿病心肌病形成的潜在作用靶点
#02
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"科技风 #$#% 年 & 月
理论研究
$&)&4 提取细胞总 ST=及 fSR2;?S检测细胞目的基因 使用 RS#jGN法提取高糖组和正常糖组总 ST="再进行逆 转录得到 ,!T=# 逆转录反应条件!)4o (%O/-"3)o (%O/-" 84o 4O/-# 按照逆转录说明书取 ,!T=样本和 O/S2(0'24L 引物及相关试剂进行加样# fSR2;?S检测 O/S2(0'24L 表达 的步骤!3)o (%O/-"'4o $%O/-) 预变性* .'4o )%P) 变性* " 0)o (%P) 退火* "1)o (%P"扩增 3% 个循环# 最后用 c0 作为 内参"根据 )233?R 计算各组 OST=的相对表达水平# 根据如 下步骤进行 fSR2;?S检测 ?GNNYQF- #(.29W=的表达# 4%o )O/-"'4o $%O/-) 预变性* "'4o )%P"0%o (%P"1)o (%P) 扩 增阶 段* " 扩 增 3% 个 循 环. 溶 解 曲 线 阶 段!'4o $4P"0%o $O/-" '4o $4P# 以 12Y,D/- 做 内 参" 根 据 )233?R 计 算 各 组 OST=的相对表达水平# 引物序列见下表#
理论研究 !"#!$%&$'(') *+&,-./&$01$21(3$&)%)$$4%13
科技风 #$#% 年 & 月
F843:(VEXU[\X&M在糖尿病心肌病心肌组织
与心肌成纤维细胞活化增殖中的表达变化
王立超5陶 辉5王 璨5蒋书美5石开虎!
安徽医科大学第二附属医院心胸外科!安徽合肥!'"%0%#
物公司* ($型胶原蛋白) ?GNNYQF-$DILF"?GNNYQF-$* # $&$&( 仪器 二氧化碳细胞培养箱) REFHOGV/PEFH9,/F-D/J/,公司* .实
时定量 fSR2;?S扩增仪) 美国 =C#公司* .倒置显微镜) 德国 XF/,Y公司* .超净工作台.电泳仪#
$&) 方法 $&)&$ 糖尿病大鼠模型建立 将 3% 只 9!健康成年大鼠按照随机分组分成实验组和 正常组# 实验组大鼠高脂高糖饮食喂养"正常组予以普通饮 食喂养# 3 周后按照 44ON*.Q剂量向模型组大鼠腹腔注射链 尿佐菌素) 9RB* 一次"正常组注射等量生理盐水# 在注射后 1] 于尾静脉测量血糖# 若测量血糖值大于 $0&1OOGN8 X2$ 则认为造模成功# $&)&) 原代心肌成纤维细胞的提取和培养 将乳鼠处死后将心脏解剖出来充分剪碎后倒入 (ON混 合酶液"放入恒温水浴锅消化# 静置 (O/- 后吸取上清液转 移至另一只无菌 [;管"加入等量 !W[W 培养基终止消化# 离心后弃掉上清液加入 !W[W培养基"在二氧化碳培养箱中 培养 $&4E# 倒置显微镜观察细胞形态"贴壁的细胞即为心肌 成纤维细胞# $&)&( 实验分组 ?VP分别予以高糖) 葡萄糖浓度 ((OOGN8X2$ * 和正常糖 ) 葡萄糖浓度 )4OOGN8X2$ * 培养"于培养 38E 后提取蛋白和 ST=用于 \C和 fSR2;?S实验# $&)&3 \FPDFH- MNGDD/-Q检测目的蛋白 9!92;=:[电泳前测 定 组 织 组 和 细 胞 组 蛋 白 浓 度" 确 定 蛋白上样量# 9!92;=:[电泳(转模(47牛奶慢摇封闭 (E( RC9R洗膜 $!$%O/-(一抗过夜(RC9R洗膜 (!$%O/-(二抗一 小时后采用 [?X法"以 :=;!A为内参"检测目的蛋白表达#