Fluo-3荧光染色方法汇总

Fluo-3荧光染色方法汇总
Fluo-3 AM(钙离子荧光探针)
●分子式为C51H50Cl2N2O23，分子量为1129.85。

●粉末样品储存：-20℃
●文献：最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。

实际检测时推荐使用的
激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。

激发波长490-500nm；发射波长528nm
激发波长506nm；发射波长526nm
●储存液：配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中。

将1mg Fluo-3 AM溶解于442μL的
无水DMSO中形成2mM的储存液。

低温快速操作。

●工作溶液：用实验中的缓冲液稀释成工作溶液。

文献：
用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。

缓冲液中125 nM Fluo-3/pH 7.2。

10μM/1h/30℃
●孵育时间：10，15-60分钟，避光。

●孵育温度：20-37℃，
●关于Pluronic F-127，有些文献用，有些文献不用。

染色培育后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。

朱冬发：
精子染色及观察
将精子悬液在1000 rpm下离心10 min，取白色沉淀，加入37℃预温的含0.01% Pluronic F-127的过滤自然海水995 μl取代原培养液，然后再加入浓度为1 mmol/L的Fluo-3/AM
5 μl，（Fluo-3/AM的实际工作浓度：1μM）振荡均匀，37℃避光负载30 min。

过滤自然
海水洗3次（1000 rpm/min离心5 min），加入含50 μg/ml A23187的过滤海水震荡成精子悬液，封片观察。

将载玻片置于载物台上，选择合适的层面，在激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP2）100倍油镜下进行扫描观察。

实验所用光电倍增管PMT值为618，钙离子荧光染料Fluo-3/AM的激发波长为488 nm，发射波长为526 nm。

精子各个部位的荧光强弱可指示钙离子浓度的高低。

将扫描观察获得的图片进行分析，并通过Leica共聚焦显微镜自带的定量软件对图片进行定量，获得不同反应阶段精子的平均荧光强度值。