CSE1L在神经母细胞瘤化疗DNA损伤修复过程中的表达

CSE1L在神经母细胞瘤化疗DNA损伤修复过程中的表达陈峰;韩玉英;伏利兵;王焕民;张杰;秦红;邰隽;石金;于永波
【摘要】目的研究核转运因子CSE1L在化疗后神经母细胞瘤DNA损伤修复过程中的表达变化并初步探索其作用机制,为神经母细胞瘤诊疗提供线索和理论依据.方法通过免疫组化染色方法对19例未化疗和28例经化疗的神经母细胞瘤组织中CSE1L表达水平进行分析.阿霉素处理SH-SY5Y细胞6小时和12小时建立DNA 损伤模型,并通过免疫荧光方法检测DNA损伤修复标志物g-H2AX和53BP1在DNA损伤位点的聚集情况;免疫印迹检测阿霉素诱导DNA损伤后CSE1L以及
53BP1、FEN-1和EXO-1等DNA损伤相关蛋白的变化水平.慢病毒敲减CSE1L 后,免疫印迹检测CSE1L、53BP1、FEN-1和EXO-1蛋白水平变化.结果未化疗组CSE1L阳性率(73.7％)高于化疗组(42.9％)并具有显著差异(卡方检验P=0.037);阿霉素可诱导DNA损伤修复标志物g-H2AX和53BP1在DNA损伤位点的聚集;并诱导53BP1、CSE 1L、FEN-1的表达水平在处理6小时先增高、在12小时降低,EXO-1表达持续增高;敲减CSE1L可降低53BP1和FEN-1表达,但促进EXO-1表达.结论 CSE1L在化疗后神经母细胞瘤样本中表达降低,并参与DNA损伤修复过程.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2016(023)010
【总页数】5页(P1202-1206)
【关键词】神经母细胞瘤;染色体分离1样基因;DNA损伤修复
【作者】陈峰;韩玉英;伏利兵;王焕民;张杰;秦红;邰隽;石金;于永波
【作者单位】首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈
外科疾病北京市重点实验室,北京100045;首都医科大学附属北京儿童医院,耳鼻咽
喉头颈外科,北京100045;首都医科大学,基础医学院医学遗传学与发育生物学学系,北京100069;首都医科大学附属北京儿童医院,病理科,北京100045;首都医科大学
附属北京儿童医院,肿瘤外科,北京100045;首都医科大学附属北京儿童医院,耳鼻咽喉头颈外科,北京100045;首都医科大学附属北京儿童医院,肿瘤外科,北京100045;首都医科大学附属北京儿童医院,耳鼻咽喉头颈外科,北京100045;首都医科大学附
属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外科疾病北京市重点实验室,北京100045;首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,儿童耳鼻喉头颈外
科疾病北京市重点实验室,北京100045;首都医科大学附属北京儿童医院,儿童临床
数据和样本资源库,北京100045
【正文语种】中文
神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是儿童中最常见的颅外实体肿瘤，因肿瘤而致死的患儿中15%死于NB。

迄今为止，对于NB，尤其是高危组的NB并无有效治疗方法［1-2］。

与多种恶性肿瘤相似，肿瘤细胞耐药是其影响术后化疗疗效的主要原因之一。

现代医学的主流观点认为，精准医疗的短期目标之一就是攻克肿瘤的耐药性［3］。

因此，分析NB个体基因的差异性表达，研究NB与耐
药基因关系并且寻找新的药物作用靶点迫在眉睫。

DNA损伤修复对肿瘤细胞耐药影响起关键作用。

染色体分离1样基因（chromosome segregation 1-like，CSE1L）是一种表达于细胞核膜的核转运
因子，参与调节细胞增殖和凋亡，其在DNA损伤修复中的作用尚不明确［4-5］。

本文拟通过研究CSE1L在化疗与非化疗NB样本中的差异表达，并研究
CSE1L对两种已知参与DNA损伤修复蛋白：片状内切酶-1（flap
endonuclease-1，FEN-1）和人核酸外切酶-1（exonuclease 1，EXO-1）蛋白
表达影响［6-7］，探讨CSE1L参与NB的 DNA损伤修复作用，为精准诊疗提供理论依据。

1 实验室材料和仪器
1.1 实验材料
人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y购自上海中科院细胞库；慢病毒载体 LV-CSE1L-RNAi（2732-1）、阴性对照病毒CON053购自上海吉凯基因化学有限公司；DMEM（11995065）培养液和胎牛血清（35-076-CV）购自Gibco/Life Technology公司；阿霉素（Adriamycin，Adr）（D1515）购自 Sigma公司；
g-H2AX抗体（2575736）购自 Millipore公司；53BP1抗体（ab75933）、CSE1L抗体（ab151546）、FEN-1抗体（ab462）购自 Abcam公司；GAPDH
抗体（5174S）购自Cell Signaling公司；罗丹明标记羊抗兔IgG（ZF-0316）购自中杉金桥；Alexa Fluor 488（A11001）羊抗鼠IgG购自Thermo公司。

1.2 临床样本
本研究共纳入标本47例，其中未化疗神经母细胞瘤组织样本19例，化疗神经母
细胞瘤组织样本28例。

均选自首都医科大学附属北京儿童医院样本库收集的神经母细胞瘤患儿（表1）。

肿瘤样本中，男性31例，女性16例；小于等于18个月者21例，大于18个月为26例。

根据INSS分期（International Neuroblastoma Staging System）系统分期：I期2例、IIA期6例、IIB期3例、III期8例、IV期22例和IVS期6例；根据国际儿童肿瘤协作组（Children's Oncology Group，COG）危险度分级，低危组共6例、中危组共
5例、高危组共36例（表1）。

1.2 实验仪器
细胞培养箱购自Thermo公司；Odyssey红外荧光成像系统购自LI-COR公司；
激光共聚焦扫描显微镜购自日本奥林巴斯公司。

2 实验方法
2.1 细胞培养
神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y于37℃，5% CO2，饱和湿度条件下10%胎牛血清的DMEM培养基培养。

2.2 慢病毒感染
将慢病毒载体LV-CSE1L-RNAi（2732-1）、阴性对照病毒CON053（购自上
海吉凯公司）分别感染SH-SY5Y细胞，感染复数（multiplicity of infection，MOI）值为10，感染8～12h更换为完全培养液。

感染48h后将慢病毒载体
LV-CSE1L-RNAi（2732-1）、阴性对照病毒CON053再次分别感染SH-SY5Y
细胞，MOI值为10，感染8～12h更换为完全培养液。

第2次感染后96h收取细胞。

2.3 免疫荧光
SH-SY5Y细胞经阿霉素（adriamycin，Adr，10mmol/L）处理0h，6h，12h后，4%多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3次，每次5min，0.5%Trion-X100室温
透化20min，5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1h，一抗（1：100稀释）4℃
过夜，0.2%Trion-X100洗3次每次5min，室温避光孵育二抗1小时，0.2% Trion-X100洗3次每次5min，5 mg/mL 的Hoechst33342室温孵育
10min，PBS洗3次每次5min，封片，实施激光共聚焦扫描显微镜观察。

2.4 免疫印记（Western blotting）
蛋白裂解液处理提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。

上样量为40mg总蛋白，
10%SDS-PAGE后转移到硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1小时，一抗4℃过夜，二抗室温孵育1小时，LI-COR扫膜。

2.5 免疫组织化学染色
石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2室温孵育 5～10分钟；蒸馏水冲洗，PBS浸泡2次，每次5分钟；进行抗原修复；5%正常血清封闭，室温孵育10分钟；一抗孵育4℃过夜。

PBS冲洗3次每次，5分钟。

二抗37℃孵育30分钟。

PBS冲洗，3次每次5分钟。

滴加辣根酶标记的工作液，37℃孵育30分钟。

PBS冲洗，3次每次5分钟。

显色剂显色。

自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

免疫组织
化学读片由病理科医师完成。

2.6 统计方法
将NB患者分为化疗组和未化疗组，采用四格表的卡方检验统计CSE1L的表达情况，SPSS19.0软件处理数据。

以P＜0.05为差异具有统计学意义。

1 免疫组化检测CSE1L蛋白在化疗与未化疗神母细胞瘤患儿样本中的表达情况为了解化疗对NB患儿CSE1L表达的影响，我们收集NB患儿肿瘤组织样本共
计47例。

用免疫组织化学染色方法检测CSE1L在NB中的表达情况。

结果发现，未化疗患儿中CSE1L阳性14例，阴性5例，阳性率73.7%；化疗患儿中，CSE1L阳性12例，阴性16例，阳性率42.9%（卡方检验P=0.037＜0.05，表2，图1）。

说明化疗对CSE1L的表达可能具有抑制作用。

2 建立Adr诱导的SH-SY5Y细胞DNA损伤修复模型
为模拟神经母细胞瘤化疗，我们首先建立了Adr诱导的SH-SY5Y细胞DNA损伤修复模型。

g-H2AX和p53结合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）聚集在DNA双链断裂位点上形成foci是DNA双链断裂损伤的金标准［8-9］。

使用10 μmol/L Adr作用于SH-SY5Y神经母细胞瘤
细胞系0h，6h，12h后，免疫荧光检测γ-H2AX和53BP1蛋白表达情况。

结
果显示，随着Adr作用6h和12h，细胞核内γ-H2AX和53BP1表达增高、形成foci，并发生共定位（图2）。

说明10μmol/L的Adr在6h和 12h时SH-
SY5Y细胞可发生明显DNA损伤。

3 DNA损伤修复时CSE1L蛋白及相关蛋白在的表达
为进一步探究CSE1L表达对DNA损伤修复的影响，我们使用10 μmol/L Adr 处理SH-SY5Y细胞，观察 CSE1L及 DNA损伤修复及 DNA复制相关蛋白表达
变化。

FEN-1和EXO-1在DNA损伤修复过程中起重要作用。

与对照组相比较，Adr作用6h时53BP1、CSE1L和FEN-1表达增高，12h时各蛋白表达开始下降，而EXO-1在12h时表达水平增高（图3）。

该结果说明53BP1、CSE1L和 FEN-
1在 Adr处理下表达一致，可能具有潜在调控关系。

4 敲减CSE1L降低FEN-1和53BP1表达、诱导EXO-1表达
为探究CSE1L与53BP1、FEN-1和EXO-1之间的调控关系，我们使用慢病毒
感染的方式敲减CSE1L，96 h后采用免疫印迹检测蛋白表达的差异。

结果显示，
与对照组相比较，CSE1L明显敲低，53BP1和FEN-1的表达也明显下降，而EXO-1的表达增多（图4）。

结果说明，在DNA损伤修复过程中53BP1和
FEN-1表达受到CSE1L调控。

神经母细胞瘤是婴幼儿中最常见的恶性实体肿瘤，其恶性程度高、侵袭力强。

虽然化疗已显著提高了患儿5年生存率，但高危NB仍旧预后差，并无有效的治疗方
法［1-2］。

与多种恶性肿瘤相似，肿瘤细胞耐药是其影响术后化疗疗效的主要原因之一。

化疗药物如Adr，可抑制拓扑异构酶IIa活性［10］，从而诱导DNA 发生双链断裂，阻碍DNA复制和转录从而造成细胞凋亡。

可见，DNA损伤修
复在抗肿瘤药物治疗中起关键作用，其功能异常可能会导致DNA修复异常，诱
导DNA错误修复，从而增加DNA不稳定性，诱发肿瘤耐药。

因此，研究肿瘤DNA损伤修复，可为采取策略降低肿瘤细胞修复能力，并增加其对Adr药物敏感性提供线索和理论依据。

CSE1L又称人细胞凋亡易感基因（human cellular apoptosis susceptibility，hCAS），在1995年被发现并克隆，与酵母
染色体分离基因（chromosome segregation，Cse1）同源，表达于细胞核膜，
是一种核转运因子，参与调节细胞增殖和凋亡，并在早期胚胎生长发育过程中发挥重要作用［4-5］。

此外，近年研究发现CSE1L可促进黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、淋巴瘤和乳腺癌等增殖和转移过程［11-14］。

但其在DNA损伤修复中的作用
尚不明确。

本文拟通过研究CSE1L在化疗与非化疗NB样本中的差异表达，并
建立NB细胞DNA损伤修复模型，探讨其在NB化疗过程中发挥的作用。

并研究CSE1L对两种已知参与DNA损伤修复蛋白：FEN-1和EXO-1蛋白表达影响，
探讨CSE1L参与NB的DNA损伤修复作用。

Brinkmann等人发现，CSE1L在增殖活跃的细胞中高表达［4］。

类似地，本研
究发现，CSE1L在化疗组NB患儿标本中表达水平明显低于非化疗组，说明化疗
可抑制NB细胞增殖；未化疗组NB标本中可见明显CSE1L阳性细胞簇，说明
未化疗组NB细胞增殖活跃。

我们后续建立了Adr诱导的NB细胞系SH-SY5Y细胞DNA损伤修复模型，研究CSE1L在化疗药物Adr诱导的NB肿瘤
细胞DNA损伤修复中的作用。

Tanaka等人发现，乳腺癌中，CSE1L本身表达
并不增高，但其可在DNA损伤诱导剂Adr的作用下，与P53相互作用，作为转录共作用因子，调节P53靶基因的转录［5］。

但在NB肿瘤细胞系中，我们发现，Adr可诱导CSE1L和53BP1表达先增高，后降低。

说明CSE1L可能参与Adr诱导的DNA损伤修复的过程。

FEN-1介导长片段碱基切除修复（long patch base excision repair，LP-BER）［15］，而EXO-1是端粒缩短激活DNA损伤信号通路中的检定点之一基因，是唯一参与错配修复（mismatch repair，MMR）系统的核酸外切酶［16］。

这
两种分子在DNA的复制、修复及染色体端粒的稳定过程起着十分重要的作用。

在本研究中我们发现，SH-SY5Y细胞系中，FEN-1在Adr刺激下表达情况与CSE1L和53BP1一致，6h增高、12h时降低。

说明Adr作用6h时DNA
双链断裂修复启动，同时伴有LP-BER发生。

EXO-1是参与MMR重要的核酸
外切酶。

MMR系统对维持高保真DNA复制，以及维持基因组稳定性起重要作用［17］。

但EXO-1在Adr处理6h时没有差异表达，而12h时表达显著增高，这表明持续的DNA损伤压力可以激活MMR。

这些结果说明在NB细胞系SH-SY5Y 在受到Adr诱导的DNA损伤压力时，早期启动DNA双链断裂修复机制，并伴有LP-BER；晚期双链断裂修复水平下降，启动MMR。

而CSE1L在此过程中表达与DNA双链断裂标志53BP1和LP-BER因子FEN-1表达一致，说明可能对其具有潜在的调控关系。

为了进一步探索CSE1L与53BP1、FEN-1和EXO-1之间的调控关系。

我们在SH-SY5Y细胞中敲减CSE1L。

结果发现，敲减CSE1L可明显抑制53BP1和FEN-1的表达，却显著增强EXO-1的表达。

这与Adr处理时CSE1L表达与
53BP1和FEN-1趋势一致，并与EXO-1表达趋势相反的结果一致。

这些结果首次发现，CSE1L可能对53BP1和FEN-1的表达起正相调控作用。

本研究首次发现CSE1L在NB化疗过程中表达降低，并在Adr诱导的DNA损伤修复过程中通过调节53BP1、FEN-1和EXO-1的表达水平，先诱导DNA双链断裂修复后激活MMR的过程中起重要作用。

但我们发现，即使经过化疗，仍有CSE1L高表达的标本出现。

这提示，这些患儿NB肿瘤即使经过化疗，NB细胞增殖仍旧活跃。

因此，课题组后续将持续随访化疗后CSE1L仍旧高表达的患儿，从而深入探讨CSE1L与NB化疗耐药间的关系。

此外，在DNA 损伤修复的过程中，CSE1L调节53BP1和FEN-1的具体机制也是我们后续研究的重点。

【相关文献】
［1］Maris J M，Hogarty M D，Bagatell R，et al.Neuroblastoma. Lancet，2007，369（9579）：2106-2120.
［2］Maris J M.Recent advances in neuroblastoma.N Engl J Med，2010，362（23）：2202-2211.
［3］Collins F S，Varmus H.A new initiative on precision medicine.N Engl J Med，2015，372（9）：793-795.
［4］Brinkmann U，Brinkmann E，Gallo M，et al.Cloning and characterization of a cellular apoptosis susceptibility gene，the human homologue to the yeast chromosome segregation gene CSE1. Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（22）：10427-10431. ［5］Tanaka T，Ohkubo S，Tatsuno I，et al.hCAS/CSE1L associates with chromatin and regulates expression of select p53 target genes. Cell，2007，130（4）：638-650.
［6］Kleppa L，Mari P O，Larsen E，et al.，Kinetics of endogenous mouse FEN1 in base excision repair.Nucleic Acids Res，2012，40（18）：9044-9059.
［7］Nimonkar A V，Genschel J，Kinoshita E，et al.BLM-DNA2-RPAMRNandEXO1-BLM-RPA-MRN constitutetwoDNA end resection machineries for human DNA break repair.Genes Dev，2011，25（4）：350-362.
［8］Giunta S，Belotserkovskaya R，Jackson S P.DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.J Cell Biol，2010，190（2）：197-207.
［9］Li X，Kong X，Wang Y，et al.53BP1 is a novel regulator of angiogenesis in breast cancer.Cancer Sci，2013，104（11）：1420-1426.
［10］Wijdeven R H，Pang B，van der Zanden S Y，et al.Genome-Wide Identification and Characterization of Novel Factors Conferring Resistance to Topoisomerase II Poisons in Cancer.Cancer Res，2015，75（19）：4176-4187.
［11］Tai C J，Shen S C，Lee W R，et al.Increased cellular apoptosis susceptibility （CSE1L/CAS）protein expression promotes protrusion extension and enhances migration of MCF-7 breast cancer cells.Exp Cell Res，2010，316（17）：2969-2981. ［12］Liao C F，Luo S F，Li L T，et al.，CSE1L/CAS，the cellular apoptosis susceptibility protein，enhances invasion and metastasis but not proliferation of cancer cells.J Exp Clin Cancer Res，2008，27：15.
［13］Lorenzato A，Biolatti M，Delogu G，et al.AKT activation drives the nuclear localization of CSE1L and a pro-oncogenic transcriptional activation in ovarian cancer cells.Exp Cell Res，2013，319（17）：2627-2636.
［14］Lorenzato A，Martino C，Dani N，et al.The cellular apoptosis susceptibility
CAS/CSE1L gene protects ovarian cancer cells from death by suppressing RASSF1C.FASEB J，2012，26（6）：2446-2456.
［15］Balakrishnan L，Brandt P D，Lindsey-Boltz L A，et al.Long patch base excision repair proceeds via coordinated stimulation of the multienzyme DNA repair complex.J Biol Chem，2009，284（22）：15158-15172.
［16］Orans J，McSweeney E A，Iyer R R，et al.Structures of human exonuclease 1 DNA
complexes suggest a unified mechanism for nuclease family.Cell，2011，145（2）：212-223.
［17］Muro Y，Sugiura K，Mimori T，et al.DNA mismatch repair enzymes：genetic defects and autoimmunity.Clin Chim Acta，2015，442：102-109.。