细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定
含增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体的构建和表达的开题报告
含增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体的构建和表达的开题报告一、研究背景骨形态发生蛋白2（BMP2）是一种强有力的成骨分子，在骨再生和再生医学领域被广泛应用。
然而，目前BMP2的使用存在一些问题，如需高剂量才能获得良好的效果，剂量过高有可能导致不必要的副作用，同时也有可能导致药物费用的增加和药物供应的不足。
因此，建立一种新型的BMP2真核载体，可以有效提高BMP2的表达效率和骨骼生成能力，是非常重要的。
二、研究目的本研究旨在构建一种含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的BMP2真核载体，并进一步表达该载体以验证其表达效果。
通过这种BMP2真核载体的构建和表达，可以有效提高BMP2的表达效率和骨骼生成能力。
三、研究内容和方法1.构建含增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体本研究采用PCR扩增的方法，构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记序列的BMP2真核载体。
具体步骤如下：1）设计BMP2和EGFP的引物序列；2）通过PCR扩增的方法，获得BMP2和EGFP的DNA序列；3）将BMP2和EGFP的DNA序列进行连接，并构建含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体。
2. 表达含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体本研究采用转染的方法将含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体导入到细胞中。
具体步骤如下：1）选取合适的细胞系进行转染；2）将含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体导入到细胞中；3）观察细胞中的EGFP表达情况，并验证BMP2的表达效果。
四、预期成果1.成功构建含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体。
2.实现含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体的表达。
3.验证该载体在表达BMP2方面的高效性。
五、研究意义本研究的成果将为BMP2的研究和应用提供重要的理论和实验基础。
具体意义如下：1.本研究可以有效提高BMP2的表达效率和骨骼生成能力，为骨科和再生医学领域的疾病治疗提供新的治疗手段。
重组蛋白真核表达系统构建流程
重组蛋白真核表达系统构建流程蛋白质是生物体内具有重要生物学功能的分子，它们由氨基酸组成，对细胞的结构和功能起着重要的调控作用。
在生物科学研究和生物制药工业中，重组蛋白质的生产和表达是一个重要的研究领域。
真核系统是重组蛋白质表达的一个重要平台，它具有许多优点，如能够实现复杂的蛋白修饰和折叠等。
因此，构建真核表达系统是生物科学研究和生物工程应用中的一个重要课题。
一、选取重组蛋白质的编码序列在构建真核表达系统之前，首先需要选取重组蛋白质的编码序列。
这一步骤通常是通过将目标蛋白质的编码基因进行克隆和序列分析来完成的。
在进行基因克隆过程中，需要选择适当的限制性内切酶和载体，构建一个含有目标基因的重组质粒。
同时，对目标基因的序列进行分析可以帮助确定转录和翻译起始位点、信号肽序列、保守结构域等信息，这些信息对于真核细胞的表达和翻译过程具有重要意义。
二、选择适当的真核表达宿主真核表达系统可以选择多种宿主来进行表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等。
在选择表达宿主时，需要考虑到宿主细胞的生长特性、表达能力、蛋白修饰能力等因素。
不同的宿主对于重组蛋白质的表达和折叠能力有所差异，因此需要根据目标蛋白质的性质和需求来选择合适的宿主。
通常来说，哺乳动物细胞系统是真核表达系统中最常用的宿主之一，它具有较高的蛋白修饰和折叠能力，适合用于表达复杂的蛋白质。
三、构建真核表达载体在选择了合适的宿主后，需要构建一个含有目标基因的真核表达载体。
真核表达载体通常包括启动子、转录终止子、筛选标记基因等功能元件。
通过将目标基因插入到表达载体中，可以实现对目标基因的调控和表达。
同时，表达载体还可以包括一些辅助元件，如信号肽、翻译起始位点、融合标签等，以提高重组蛋白质的表达水平和纯度。
四、转染或转化真核细胞在构建了真核表达载体后，需要将其转染或转化到真核细胞中。
转染是指将外源DNA通过化学方法导入到细胞内，而转化则是通过质粒介导的方式将外源DNA导入到细胞内。
固醇携带蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定
度 ；３重组腺病毒感染小鼠ｈｐ一— 细胞， （） ｅａ１６ 实时定量Ｐ Ｒ检测ｍ Ｎ Ｃ Ｒ Ａ的表达； ｓｒ 印迹检测Ｓ Ｐ 蛋白表达情况； Ｗｅ ｅ ｔｎ Ｃ２ 结果 ： 成
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中国中西 医结合外科杂 志 ２ １ 年 ６ ０ ２ 月第 １ 卷第 ３ ８ 期
２９ ６
Hale Waihona Puke 固醇携带蛋 白２ 腺病 毒载体 的构建 与鉴定
贾岩 峰 崔云峰 崔 乃强 ２彭雁 飞 ３宁 召 臣。张 ， ， ， 琚
摘 要 目的 ： 构建携带 白蛋 白启动子Ｓ Ｐ 基 因腺病毒载体 ， Ｃ２ 研究其与胆 固醇结石形成的关系。方 法 ： １利用 （）
Ｒ —Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ技术 克 隆小 鼠Ｓ Ｐ Ｃ ２基 因， 其上 游接入 白蛋 白（ Ｂ 启 动子 ， 在 ＡＬ ） 下游连 接绿 色荧 光报告 基 因（ Ｇ Ｐ ， Ｅ Ｆ ） 构建 穿梭 质粒
【2020生物新高考京津琼】(四)考前10天——长句应答必备,教材再巩固
(四)考前10天——长句应答必备，教材再巩固(名词解释＋教材黑体字填空＋教材结论性语句)第10天1.自由水与结合水：水在细胞中以两种形式存在。
一部分与细胞内的其他物质相结合，叫做结合水。
细胞中绝大部分的水以游离的形式存在，可以自由流动，叫做自由水。
2.生物膜系统：细胞器膜和细胞膜、核膜等结构，共同构成细胞的生物膜系统。
3.自由扩散、协助扩散与主动运输：物质通过简单的扩散作用进出细胞，叫做自由扩散。
进出细胞的物质借助载体蛋白的扩散，叫做协助扩散。
物质从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应所释放的能量，这种方式叫做主动运输。
4.科学家根据细胞内有无以核膜为界限的细胞核，把细胞分为真核细胞和原核细胞两大类。
5.一切生命活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命活动的主要承担者。
6.核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。
17.糖类是主要的能源物质。
8.动物细胞的重要储能物质是糖原，植物细胞的重要储能物质是淀粉，细胞中的重要储能物质是脂肪。
9.糖类大致可以分为单糖、二糖和多糖。
10.无机盐对于维持血浆的正常浓度、酸碱平衡等具重要作用。
11.每一个单体都以若干个相连的碳原子构成的碳链为基本骨架，由许多单体连接成多聚体。
12.细胞中大多数无机盐以离子的形式存在。
第9天1.细胞代谢：细胞中每时每刻都进行着许多化学反应，统称为细胞代谢。
2.活化能：分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量称为活化能。
3.酶：酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质。
4.脂肪是细胞内良好的储能物质。
5.细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。
26.糖类在细胞膜上以糖脂和糖蛋白的形式存在，且糖蛋白只能在膜外侧，据此可以判断细胞膜的内外侧。
7.各种膜所含蛋白质与脂质的比例同膜的功能有关，功能越复杂的细胞膜，其蛋白质种类和数量越多。
细胞周期中Rb蛋白与E2F调控机制研究
细胞周期中Rb蛋白与E2F调控机制研究细胞是构成生物体的基本单位，也是人类研究重点的一个领域。
细胞中的生命周期是一个复杂的过程，包括细胞分裂、细胞增殖、细胞凋亡等等。
这些过程的控制对于细胞的生长、发育、分化和修复等方面都具有重要的作用。
细胞周期中Rb 蛋白与E2F调控机制是一个被广泛研究的课题。
一、细胞周期回顾细胞生长和分裂是细胞周期中重要的过程。
在分裂过程中，细胞将自身的一份复制成两份，使得原本一个细胞变成了两个细胞。
在这个过程中，细胞经历了一系列的生理、生化和遗传学变化。
细胞周期可分为四个阶段：G1、S、G2和M期。
G1期为细胞的“高速增长期”，S期为细胞的“复制期”， G2期为细胞的“準备分裂期”， M期为细胞的“分裂期”。
二、Rb蛋白Rb蛋白是受癌基因启动子调控的一个人类肿瘤抑制基因，具有抑制细胞分裂和促进细胞凋亡的作用，是细胞周期调控的重要分子。
Rb蛋白通过与E2F转录因子相互作用来抑制DNA复制、细胞周期进程和细胞分裂等过程。
三、E2F转录因子E2F是一个特异性转录因子，属于基因转录调控蛋白家族，通过与Rb蛋白相互作用调控细胞周期进程。
E2F活化复制酶Cdc6和minichromosome维持复合物(MCM)转录，合成新的DNA，导致细胞进入S期。
当检测到DNA损害时，E2F与Rb蛋白相结合，阻碍细胞周期的进程，使得细胞可以进行检修和复修。
四、Rb与E2F的调控机制Rb蛋白和E2F转录因子在细胞周期中发挥着不可替代的作用，两者通过互相作用，协同调节细胞周期进程。
在G0和G1期，Rb蛋白与E2F转录因子结合并抑制E2F的转录活性，从而抑制细胞的DNA复制和G1/S期的转换。
而在G1期中，Rb蛋白通过磷酸化和热变性打开并释放E2F转录因子，启动DNA复制过程进入S 期。
在S期或G2期中，Rb蛋白的活性会被CDK2催化的磷酸化所解除，释放出E2F转录因子，进一步促进细胞周期进入到M期。
五、Rb与E2F的异常表达及其与肿瘤的关系Rb蛋白和E2F转录因子在调控细胞周期进程中发挥着重要的作用，而它们的异常表达则可能会导致细胞周期的紊乱，从而导致癌症的发生。
弓形虫LDH2基因启动子的克隆及初步鉴定的开题报告
弓形虫LDH2基因启动子的克隆及初步鉴定的开题报告
一、选题的背景和意义
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种寄生虫，可以感染人和动物。
弓形虫感染对人类健康产生了很大的危害，严重的感染会导致流产、死亡等严重后果。
因此，研究弓形虫的基因调控机制和相关疫苗开发具有重要的理论和实际意义。
LDH2是弓形虫中的一种乳酸脱氢酶，是重要的能量代谢途径。
LDH2基因启动子是一个调控基因表达的重要元件，与转录因子结合调控基因的转录水平。
研究LDH2基因启动子的结构、功能及其调控机制，对于深入了解弓形虫代谢途径和抵御弓形虫感染具有重要意义。
二、研究内容和方法
本研究计划从弓形虫的基因组DNA中克隆LDH2基因启动子片段，将其插入到报告基因LacZ表达载体中，构建重组质粒。
利用限制性内切酶切割、PCR扩增和基因测序等方法鉴定和分析LDH2基因启动子的序列和结构特点。
利用重组质粒转染至弓形虫体内，观察流式细胞仪和酶活检法检测LDH2基因启动子的调节效应。
三、预期研究结果和创新点
预计该研究能够成功克隆到弓形虫LDH2基因启动子，揭示其序列和结构特征。
通过基因组DNA的测序和限制性内切酶切割方法，我们能够确认LDH2基因启动子的相对位置和限制性酶切割图谱。
通过测序分析，我们能够预测LDH2基因启动子促进转录水平的转录因子及其相互作用网络。
通过转染实验，我们能够观察和验证LDH2基因启动子的调节效应，同时对其功能和调控机制进行解析。
该研究有望为深入了解弓形虫代谢途径和缓解弓形虫感染提供新的研究思路和方法。
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
2024北京高三一模生物汇编：生物技术与工程(非选择题)
2024北京高三一模生物汇编生物技术与工程（非选择题）一、非选择题1．（2024北京顺义高三一模）人在衰老过程中某些性状会发生改变，为寻找衰老的原因，科研人员对染色质开展了相关研究。
(1)由图1可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域，某些DNA 。
(2)DNA甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散会（促进/抑制）基因表达。
(3)科研人员推测：核内DNA断裂后的修复会导致表观遗传信息紊乱或丢失，加速细胞衰老。
为验证该推测，科研人员基于图2原理，利用以下实验材料构建ICE模型鼠。
①Cre酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于DNA上的Lx序列，导致两个Lx间的DNA 片段丢失；①I-E核酸酶基因：编码的I-E核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre酶形成复合物，切割DNA；①口服诱导剂T：小分子化合物，可诱导Cre酶进细胞核。
请完善技术路线：(4)染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE小鼠的检测，发现已修复的DNA未发生碱基序列的改变。
通过检测，可知获得的ICE鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。
2．（2024北京顺义高三一模）学习以下材料，回答（1）~（5）题。
碳同化途径的工程化改造烟草是转基因研究的模式生物。
烟草的光合速率受RuBP羧化-氧化酶（R酶）催化效率和胞内CO2浓度服制。
R酶由大亚基（RL）和小亚基（RS）组成，RL蛋白和RS蛋白分别由叶绿体rl基因和细胞核rs基因编码，大小亚基在叶绿体中组装形成R酶。
R酶既能催化C5羧化形成C3，也能催化C5氧化为C2，进入线粒体分解为CO2，R酶催化的反应类型取决于其周围的CO2和O2浓度。
玉米等植物已经进化出CCM机制，叶绿体中R酶周围积累CO2以增强羧化和抑制氧化。
研究人员尝试在烟草中替换R酶，并构建CCM 途径。
H+菌是一种自养型细菌。
H+菌的羧基体由多种蛋白构成，蛋白外壳包裹着R酶和碳酸酐酶（CA）。
双荧光素报告基因载体
双荧光素报告基因载体：构建与应用引言双荧光素报告基因载体在生物学和医学研究中具有广泛的应用。
它能够帮助研究人员观察和分析特定基因在细胞中的表达情况。
本文将介绍双荧光素报告基因载体的构建和应用过程。
构建双荧光素报告基因载体的步骤第一步：选择荧光素基因和载体在构建双荧光素报告基因载体之前，我们需要选择合适的荧光素基因和载体。
常用的荧光素基因有荧光素酶（Luciferase）和绿色荧光蛋白（GFP）。
载体选择上可以使用质粒或病毒载体。
第二步：设计引物和限制酶切位点在构建双荧光素报告基因载体时，需要设计引物和限制酶切位点。
引物用于扩增荧光素基因，限制酶切位点用于将基因插入载体。
第三步：扩增和纯化荧光素基因使用设计好的引物扩增荧光素基因。
扩增完成后，通过凝胶电泳检测目标片段的大小并纯化出目标片段。
第四步：切割载体和插入基因将载体与限制酶进行切割。
切割后，将扩增和纯化好的荧光素基因与载体连接，形成重组载体。
第五步：转化宿主细胞并筛选将重组载体转化到宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌。
转化完成后，通过筛选对重组载体敏感的宿主细胞，如通过抗生素抗性筛选。
第六步：验证重组载体通过PCR扩增和测序等方法对重组载体进行验证。
确保荧光素基因已经正确插入载体。
双荧光素报告基因载体的应用荧光素酶活性检测双荧光素报告基因载体可以用于荧光素酶活性检测。
将重组载体转染到感兴趣的细胞中，然后加入荧光素底物。
荧光素酶基因的表达量与荧光素底物的降解速率成正比。
通过测量产生的荧光信号强度，可以获得基因的表达水平。
基因表达调控研究双荧光素报告基因载体还可以用于基因表达调控的研究。
通过插入启动子区域，可以观察特定条件下基因的表达变化。
比如，研究某种药物对基因表达的影响。
细胞信号通路研究使用双荧光素报告基因载体可以研究细胞信号通路。
通过将感兴趣的基因与荧光素酶基因连接，可以观察特定信号通路的活性。
这有助于理解细胞信号传递过程以及相关疾病的发生机制。
蛋白质表达与细胞周期探索蛋白质表达在细胞周期调控中的作用
蛋白质表达与细胞周期探索蛋白质表达在细胞周期调控中的作用细胞周期是指细胞从一个有丝分裂开始，到细胞分裂产生两个新细胞的整个过程。
在细胞周期调控中，蛋白质表达起着至关重要的作用。
蛋白质是细胞的基本组成部分，不仅参与细胞的结构形成，还调控着细胞的各种功能和代谢过程。
本文将探讨蛋白质表达在细胞周期调控中的具体作用和机制。
一、蛋白质合成与细胞周期细胞周期可以分为四个阶段：G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）和M期（有丝分裂期）。
在细胞周期的各个阶段，蛋白质合成的需求和类型有所不同。
1. G1期：在细胞生长期，细胞会合成大量蛋白质，为细胞增长和分裂做准备。
这些蛋白质包括细胞壁的主要组成部分、酶和适配器蛋白等。
2. S期：在DNA复制期，细胞会合成大量DNA，同时也需要合成许多与DNA复制相关的蛋白质。
这些蛋白质包括DNA聚合酶、修复酶和拓扑异构酶等。
3. G2期：在前期，细胞会合成一些与有丝分裂相关的蛋白质，如细胞骨架蛋白和分裂蛋白等。
这些蛋白质参与有丝分裂过程中的细胞分裂和染色体分离等重要步骤。
4. M期：在有丝分裂期，细胞会合成一系列参与染色体分离和细胞分裂的蛋白质，如纺锤体蛋白和结构蛋白等。
这些蛋白质保证了有序的染色体分离和细胞分裂过程。
二、蛋白质表达调控机制蛋白质表达是一个复杂的过程，包括转录、转译和后转录调控等多个步骤。
在细胞周期调控中，蛋白质表达的调控机制与细胞周期的不同阶段密切相关。
1. 转录调控转录调控是指通过调节基因的转录活性来控制蛋白质的合成。
在细胞周期的不同阶段，特定的转录因子会结合到目标基因的启动子区域，促进或抑制基因的转录。
这些转录因子在细胞周期调控中起到重要的作用，主要通过激活或抑制目标基因的转录，调控特定蛋白质的合成。
2. 转译调控转译调控是指通过调控mRNA的稳定性和翻译活性来控制蛋白质的合成。
在细胞周期的不同阶段，特定的RNA结合蛋白（RNA-binding proteins）会结合到mRNA上，调控mRNA的降解速率和翻译效率。
载体构建
水稻中cdc2超表达载体的构建生物技术专业 吴娇娇指导教师： 傅体华教授 寿惠霞教授摘要：每个细胞都是一个细胞周期的产物。
细胞增殖是由一系列细胞分裂调控机制精确控制的，在此过程中细胞周期蛋白依赖性激酶起着关键作用。
由p34cdc2和细胞周期蛋白组成的复合物在真核生物中被称为有丝分裂启动子（MPF），控制从G1到S期的转变，而目前通过转基因的材料来研究水稻中cdc2的报道比较少。
为了了解细胞分裂调控基因cdc2在水稻中的作用，通过基因芯片我们得到了一个水稻的cdc2同源基因，期望通过对其超表达得到一些水稻中细胞周期调控的信息。
在此我们选择了包含玉米泛素ubi启动子的双元载体pCAMBIA1390-ubiquitin作为超表达载体，该载体可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定表达。
之后我们将最终载体通过电击转化进入强毒力农杆菌强毒力菌株EHA105，保菌。
经典的构建载体的构成就是一系列是酶切和连接反应，因此如何能够高效的进行酶切和连接反应就成为提高构建效率的关键。
在实验中我们也积累了一些经验，同时也改进了一些方法以提高效率。
关键词：细胞分裂调控基因2；细胞周期蛋白；超表达；双元载体Construction of overexpressing vector for rice cdc2 geneBiotechnology Wu JiaojiaoAcademic advisor Shou HuixiaAbstract：Every cell in life is the production of cell division which is controlled by a serial precise reaction. Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) play an important role in regulating the eukaryotic cell cycle. A key element of cell cycle control in eukaryotes is the M-phase kinase, composed of p34cdc2 and cyclin A. To dissect the plant cell cycle, we have previously got a cdc2 (cell division control) gene which is homologous to Arabidopsis thaliana from Oryza sativa through DNA chips, We have cloned it into a overexpressing vector termed pCAMBIA1390-ubiqiutin using ubi as promoter which can express efficiently in E.coli and Agrobacterium, then it could be transformed into rice callus. So the target gene is tightly linked to a strong constitutive promoter from Maize, which can over express cdc2. In this study, it is found that digestion and ligation are the key steps in the construction of vector. Some questions in experiment were found and discussed in this paper.Key words:cdc2；cyclin；overexpression；binary Ti vector细胞周期的进程是通过细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）的活性变化来控制的。
人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定
人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定员月明;李弘剑【摘要】构建人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体.合成3个连续重复的人β-酪蛋白启动子中干扰素γ活化序列(gamma-activated sequence,GAS)并特其克隆至pGL3-Promoter荧光素酶报告基因载体.测序鉴定构建的载体,然后将其转染人人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,HELF)中检测荧光素酶的表达活性.测序结果表明,3×GAS序列正确；双报告基因系纯检测荧光素酶活性表明,构建的报告基因具有启动子活性.成功构建的人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体,为进一步研究干扰素γ诱导的JAK-STAT信号通路提供了必要的试验材料.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】4页(P126-129)【关键词】β-酪蛋白;GAS基序;荧光素酶;报告基因【作者】员月明;李弘剑【作者单位】暨南大学生命科学与技术学院,广州510632;暨南大学生命科学与技术学院,广州510632【正文语种】中文β-酪蛋白启动子是目前研究较多的一种乳蛋白启动子，具有较强的启动外源基因表达的能力[1] 。
在不同的激素和细胞因子作用下，β-酪蛋白启动子能招募多种转录因子[2] ，即有许多转录因子结合的基序。
例如，GAS(gamma-activated sequence)基序是信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)的结合位点。
GAS是干扰素γ通过JAK-STAT信号传导通路激活目标基因表达的重要启动子[3] 。
为了深入研究干扰素γ诱导的JAK-STAT信号传导通路，本研究拟构建人的β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体，并通过细胞内荧光素酶活性的检测，以期证明所构建的报告基因载体的有效性。
植物表达载体构建
Jellyfish Aequorea victoria: one of the oldest species on the earth
Green Fluorescent Protein (GFP)
This is a stereo view of GFP generated from the Brookhaven Database using R If you have the Chyou may follow the links to see GFP in action!
病毒衍生载体
比较小，易侵染植物并大量扩 增，可大量表达蛋白，但一般 难于整合到植物基因组中。
启动子
35S, Nos, others 蛋白质定位：GFP融合蛋白， GUS 融合蛋白 基因表达：启动子-GUS（蛋白）, 启 动子-GFP（蛋白）。
启动子的种类
组成型启动子 诱导型启动子 组织特异型启动子 在某些情况下，一种类型的启动子往往兼 有其它类型启动子的特性
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温， 在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物 质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物， 后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯 靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现 蓝色。 注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶 能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色 程度不能准确反映Gus活性，
Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activity
拟南芥侧根——精选推荐
拟南芥侧根的形成和生长受细胞分裂素代谢和信号基因的调控摘要植物根系吸收水分和养分和植物在土壤中的锚定是十分重要的。
横向根(LRs) 在根系统中相当重要。
他们胚胎后期的形成是受激素和环境因素的调控。
拟南芥中细胞分裂素在不同层面上通过干扰细胞分裂和模式形成来影响侧根的形成和生长。
这包括抑制中柱鞘细胞第一分裂和抑制幼小侧根的分支。
突变体分析揭示了细胞分裂素的合成基因IPT3和IPT5和所有的三个细胞分裂素受体基因(AHK3 AHK2,,CRE1 / AHK4)在侧根萌生中是多余的（无用的）。
AHK3 AHK2的突变增加了侧根形成中对生长素的敏感性，证实了生长素、细胞分裂素在侧根形成中的功能相关性。
相反,细胞分裂素受体突变体在侧根生长中对其他激素的应答类似于野生型,它是符合独立应答通路的。
一个显著的例外就是ahk2 ahk3突变体在侧根伸长中对油菜素内酯很敏感，表明细胞分裂素和油菜素内酯的拮抗作用。
调控侧根形成中多级丰余的细胞分裂素系统反映出它在调控环境因素中的作用。
介绍双子叶开花植物的根系统包括主根和侧根(LRs)。
侧根在根系统发展中起到相当大的作用，在锚定植物和摄取微量和大量元素过程中的作用更加大。
与起源于胚胎的主根不同，侧根的形成贯穿于植物的一生。
他们是由毗邻木质部顶端的中柱鞘细胞形成,称为拟南芥中柱鞘细胞。
这些细胞经历了一个清晰的过程，导向细胞分裂和长大形成一个侧根原基。
LRPs通过细胞分裂和生长,然后通过细胞扩张在老根上显现出来。
一旦出现, 侧根原基就会经历了一个激活过程形成一个功能完整的侧根分生组织来指导侧根的生长。
侧根的生长由植物激素和环境信号同时调控。
大量研究表明,生长素在侧根生长中起着主要的作用。
生长素调节侧根生长的几个阶段,最初是使中柱鞘细胞快速分裂建立起庞大的数量，然后使侧根生成。
据报道，为适应侧根的萌发于侧根原基的生长，在最大值处建立了生长素梯度。
在侧根的萌发中，分生细胞中生长素的积累激活了生长素受体SOLITARY ROOT (SLR)/ INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA)14, AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF)7–ARF19, and BODENLOS/IAA12–MONOPTEROS/ARF5，开始细胞分裂，引发器官形成。
转录因子和启动子实验步骤
转录因子和启动子实验步骤转录因子和启动子是基因表达调控的重要组成部分，通过实验可以研究转录因子与启动子之间的相互作用以及基因的调控机制。
以下是进行转录因子和启动子实验的一般步骤：1. 确定研究对象：首先需要确定研究对象，包括要研究的基因、转录因子和启动子的信息。
可以通过文献调研或数据库查询获得相关信息。
2. 提取DNA：从细胞或组织中提取DNA，可以使用基因组DNA或质粒DNA 进行实验。
DNA的质量和浓度对后续实验结果影响很大，因此提取的DNA质量要保证。
3. 克隆启动子序列：将要研究的启动子序列进行PCR扩增，然后进行克隆到适当的载体中，如质粒载体或报告基因载体。
可以通过限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法进行启动子序列的克隆。
4. 选择适当的细胞系：选择适当的细胞系用于实验，可以选择与研究对象相关的细胞系或转染能力强的细胞系。
5. 转染实验：将转录因子的表达载体转染到细胞中，可以选择瞬时转染或稳定转染的方法。
转染后细胞需进行培养以确保转录因子的表达。
6. 检测启动子活性：使用报告基因或荧光素酶等方法检测启动子的活性，可以通过荧光素酶报告基因检测启动子的转录活性。
7. 蛋白质与DNA相互作用实验：可以通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验等方法研究转录因子与启动子之间的相互作用，从而揭示基因的调控机制。
8. 数据分析：对实验结果进行统计分析和解读，可以使用生物信息学工具对数据进行处理和分析，如启动子的序列分析、转录因子的结合位点预测等。
9. 结果呈现：将实验结果进行图表展示，撰写实验报告或论文，可以向科学期刊投稿或在学术会议上进行分享。
总的来说，转录因子和启动子的实验步骤包括确定研究对象、提取DNA、克隆启动子序列、转染实验、检测启动子活性、蛋白质与DNA相互作用实验、数据分析和结果呈现等步骤，通过这些实验可以深入研究基因的调控机制。
希望以上内容对您的研究有所帮助。
转录因子和启动子实验步骤
转录因子和启动子实验步骤转录因子和启动子是基因表达调控过程中重要的组成部分，它们共同参与调控基因的转录过程。
进行转录因子和启动子实验是研究基因表达调控机制的重要手段。
在实验中，我们需要按照一定的步骤进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
第一步：提取DNA样本在进行转录因子和启动子实验之前，首先需要从细胞中提取DNA样本。
DNA提取的方法有很多种，常用的包括CTAB法、琼脂糖法、商业DNA提取试剂盒等。
选择合适的提取方法可以保证提取到质量较高的DNA样本。
第二步：PCR扩增目标序列提取到DNA样本后，接下来需要进行PCR扩增目标序列。
PCR是一种常用的分子生物学技术，通过PCR扩增可以获得足够的目标序列用于后续的实验。
在进行PCR扩增时，需要设计合适的引物，控制PCR反应条件，确保扩增出纯净的目标序列。
第三步：构建启动子和转录因子的荧光报告基因载体在实验中，我们通常会将启动子和转录因子的片段克隆到荧光报告基因载体中，用于研究基因的转录调控。
构建载体需要进行酶切、连接、转化等步骤，确保载体的构建正确无误。
第四步：转染细胞并进行荧光素检测构建好荧光报告基因载体后，需要将其转染至细胞中。
转染的方法有多种，如化学转染、电转染等。
转染后，可以通过荧光素检测等方法来研究启动子和转录因子的活性，了解基因的转录调控机制。
第五步：数据分析和结果解读实验完成后，需要对实验结果进行数据分析和结果解读。
可以通过荧光素检测结果来分析启动子和转录因子的活性，了解它们在基因转录调控中的作用。
同时，还可以进行统计学分析，比较不同实验组之间的差异性，得出科学的结论。
综上所述，转录因子和启动子实验的步骤包括DNA提取、PCR扩增、构建载体、转染细胞和数据分析。
通过这些步骤，可以深入研究基因的转录调控机制，为基因表达调控领域的研究提供重要的实验依据和数据支持。
希望本文的介绍能够帮助您更好地理解转录因子和启动子实验的步骤和操作流程。
几个拟南芥器官特异性启动子的克隆和功能验证
，
③位置特异性。启动子一般位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。处于基因 的下游或在基因的上游但离所要启动的基因太远的启动子，～般都不会起作用。
④种属特异性。原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启 动子，但一般来说，亲缘关系越近的两种物种，其启动子通用的可能性越大ｌｌＪ。
植物启动子的顺式元件除了上述共有的保守碱基序列外，不同来源的启动子还通常 具有种属特异的或者仅局限于某种基因家族特有的调节基序。如高度保守的Ｇ框：其共 通序列为５ ＣＡＣＧＴＧ ３，它需要与另一个顺式作用元件结合，在细胞接受外界信号时对 转录起始的频度起调节作用。醇溶谷蛋白框：保守序列为５ ＡＣＡＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴ ３位于．３００区，但醇溶谷蛋白基因只有在内胚乳表达【５１。豆球蛋白框：其保守序列为５ ＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣ ３，该序列指导成熟种子的特异表达，具有 一种数量调节的特性１６Ｊ。
ｇｅｎｅｓ，ｐｌａｙ ａ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｏｗｅｒ ｏｒｇａｎ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｇｅｎｅｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ５’一ｌｆｙ’Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，
论文作者签名： 豸ｐ易勿
日期：
０８年５月 ３０日
学位论文使用授权说明
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：
按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。（保密论文在解密后遵守此规定）
植物基因工程中的常用启动子 _3231
植物基因工程中的常用启动子 _3231 植物基因工程中的常用启动子植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子(constitutive promoter )、诱导型启动子(inducible promoter) 和组织特异性启动子(tissue – specific promoter)。
这种分类大体上反映了它们各自的特点, 但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。
1 组成型启动子组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。
它包括异源和内源组成型启动子两类。
植物基因工程中应用的异源组成型启动子主要有CaMV35S启动子（来源于烟草花叶病毒基因），能在大部分植物中对异源基因进行启动表达，完整的CaMV35S启动子是植物基因工程中应用最为广泛的组成型启动子之一，如在马铃薯、拟南芥、烟草、蘑菇、毛白杨等植物中的转基因应用。
常用的还有来自农杆菌的Nos和Ocs启动子。
内源启动子主要有水稻肌动蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子，这些启动子可以更有效地驱动外源基因在单子叶植物中的表达。
Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。
用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。
组成型启动子已经广泛地应用于双子叶植物、单子叶植物以及真菌等的基因工程中。
但是由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有表达，应用中逐渐暴露出一些问题。
例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡(karlowaki et al., 2003; Ehasani et al., 2003; Miyao et al., 2003)。
第二章--载体
非必需片段
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
2010
CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ COS序列
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
• 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点， 不利于重组操作，必须删除至1 - 2个
• 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增 加一些单一的酶切位点。如利用酶切和采用定点突变技术
Ptac
TTGACA
TATAAT
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
PlacZ启动子的可控性
阻遏蛋白 基底水平转录
P
乳糖 异丙基-b-D-硫代
半乳糖苷（IPTG）
O
诱导
高效转录
P
2010
O
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
PlacZ启动子的可控性
cAMP CAP 高效转录
Plac
葡萄糖代谢
O
cAMP浓度降低 基底水平转录
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
1、质粒的基本特征
（1）质粒的自主复制性：
ColE1、pMB1、 pSC101等不同启动子 pMB1质粒DNA复制启动控制模型
目前公认的用于阐释质粒 DNA复制控制机理的分子模 型有两种：其一是抑制蛋白质 稀释模型（inhibitor dilution model）。后者的关键论点 是，阻遏蛋白质是组成型合 成，其浓度同质粒的拷贝数成 正比。其二是自体阻遏蛋白质 模型（autorepressor model）,核心内容是，阻遏蛋 白质的合成受负反馈 （negative feedback）机理 调节，而且其浓度是恒定的。
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ห้องสมุดไป่ตู้
子 插入到 ｐ Ｇ Ｌ ３ 一 Ｂ ａ ｓ ｉ ｃ 报告基 因载体上 。重组质粒命 名为 ｐ Ｇ Ｌ ３ 一 Ｃ ｄ ｃ ２ 一 ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ 。将其 与内参质粒 ｐ Ｒ Ｌ — Ｓ Ｖ ４ ０ 瞬时共 转 染 骨 肉瘤细 胞 Ｕ ２ ０ Ｓ ， 检 测双 荧光 素 酶活 性 。结 果 成 功构 建 Ｃ ｄ ｃ ２ 基 因启 动子荧 光 素酶 报告 基 因载体 ｐ Ｇ Ｌ ３ 一 Ｃ ｄ ｃ ２ － ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ ， 质粒 酶切 及测 序结 果完 全正 确 。瞬 时共转 染 ｐ Ｇ Ｌ ３ 一 Ｃ ｄ ｃ ２ 一 ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ ／ ｐ Ｒ Ｌ — Ｓ Ｖ ４ ０ 组 荧光 素 酶活性 为 １ ． ５ ９ １ ５ ＋ ０ ． １ ９ ９ ８ ， 高于转染 ｐ Ｇ Ｌ ３ － Ｂ ａ ｓ ｉ ｃ ／ ｐ Ｒ Ｌ － Ｓ Ｖ ４ ０ 组 的荧 光素酶活性值 ０ ． ０ ４ ９ ９ ＋ － ０ ． ０ １ ０４ 。结论 ｐ Ｇ Ｌ ３ 一 Ｃ ｄ ｃ ２ 一 ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ． ｅ ｒ 在骨髓瘤 细胞 Ｕ ２ Ｏ Ｓ 细胞 中能被转录激活 ， 为进一步将其用于抗肿瘤药物 的筛选 与评 价奠定 了基础。 【 关键词】 细胞周期蛋白 类； 基因， ｃ ｄ ｃ ； 细胞周期蛋白质依赖激酶类 ； 转录启动子； 细胞周期； 萤光素酶类
ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｒ ｅ ｓ ｔ ｉｃ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｓ Ｓ ａ ｃ Ｉ ａ ｎ ｄ Ｘｈ ｏ Ｉ ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｅ ｌ ｙ ， Ｃ ｄ ｃ ２ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｐ ＧＬ ３ 一 Ｂ ａ ｓ ｉ ｃ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ． Ｔ ｈ ｅ
【 中图分类号】 Ｒ ３ ４
【 文献标识码】 Ａ
【 Ｄ Ｏ Ｉ 】 １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ２ ５ ３ — ９ ８ ９ ６ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ２ ． ０ ０ ２
Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ Ｃｅ ｌ Ｉ Ｄｉ ｖ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ Ｃｙ ｃ ｌ ｅ ２ Ｐｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ Ｒｅ ｐ ｏ ｒ ｔ ｅ ｒ Ｇｅ ｎ ｅ Ｖｅ ｃ ｔ ｏ ｒ
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天津 医药 ２ ０ １ ４ 年２ 月第 ４ ２ 卷第 ２ 期
１ ０ １
细胞分裂周期蛋 白２ 启动子报告基因载体 的构建与鉴定
周 辉 吴 炜 赵 明
【 摘要】 目的 构建细胞分裂周期蛋白２ （ Ｃ ｄ ｃ ２ ） 基因启动子荧光素酶报告基因载体ｐ Ｇ Ｌ ３ 一 Ｃ ｄ ｃ ２ － ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ ， 并检