细胞培养
细胞培养定义-概述说明以及解释
细胞培养定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞培养是一种重要的科学技术，用于在控制的实验室条件下，培养细胞体外生长和增殖。
通过提供合适的生长环境，包括适当的培养基、细胞状态维持剂和温度、湿度等因素的控制，细胞可以持续生长和繁殖。
细胞培养可以在无菌环境下进行，以保证培养过程中没有污染物的引入。
细胞培养的主要目的是研究细胞的特性和功能。
通过细胞培养，科学家可以观察和研究细胞在不同条件下的行为，进一步了解细胞的基本生理过程、信号转导途径和分化过程。
此外，细胞培养还被广泛应用于药物筛选、生物技术研究、生物工程和医药领域等。
细胞培养的发展历史可以追溯到19世纪末。
当时，人们开始尝试培养动物细胞，最早成功地实现了培养培养出鸟胚细胞。
经过长期的努力和技术改进，细胞培养的技术逐渐成熟，并被广泛应用于各个领域。
综上所述，细胞培养是一种重要的科学技术，通过在受控的实验室条件下培养细胞，可以研究细胞的特性和功能。
随着细胞培养技术的不断发展和完善，它在生物学研究、生物技术和医药领域的应用将会更加广泛。
1.2文章结构1.2 文章结构本文旨在探讨细胞培养的定义、历史、重要性以及应用领域。
为了更好地展示这些内容，本文将按照以下结构进行组织和展示：第一部分是引言部分，引言部分将对细胞培养进行概述。
我们将介绍细胞培养的基本概念，其在生物科学中的重要性以及本文的目的。
第二部分是正文部分，正文部分将分为两个小节。
首先，我们将详细介绍细胞培养的定义。
我们将解释什么是细胞培养，如何进行细胞培养以及细胞培养的目的和意义。
其次，我们将回顾细胞培养的历史，探讨细胞培养技术的发展和重要里程碑，以及这些里程碑对现代细胞培养的影响。
第三部分是结论部分，结论部分将总结细胞培养的重要性和应用领域。
我们将强调细胞培养在生命科学研究中的关键作用，并讨论细胞培养在医学、药物研发、生物工程等领域的广泛应用。
通过以上的文章结构，我们将全面、系统地介绍细胞培养的定义、历史、重要性和应用领域。
细胞培养技术3篇
细胞培养技术第一篇：细胞培养技术的基本概念细胞培养技术是指在体外人工培养生物细胞的一种技术，该技术主要应用于生命科学、医学研究、生物制药等领域。
细胞培养技术的基本概念主要包括：细胞培养的类型、培养基、细胞的消耗物质、细胞培养的设备和细胞培养的步骤等，下面就逐一进行介绍。
一、细胞培养的类型细胞培养主要分为原代细胞培养和继代细胞培养两种类型。
1.原代细胞培养原代细胞培养是指直接从体组织中分离出来的生物细胞进行培养。
该类型的细胞培养在实验室中很少用到，因为从体组织中分离细胞的方法很繁琐，而且这种方法得到的细胞数量和品质不能保证。
2.继代细胞培养继代细胞培养是指从已经培养的细胞中分离出来的细胞进行培养。
这种类型的细胞培养方法非常常见，因为可以在实验室中轻松实现。
二、培养基培养基是指用来提供细胞分裂和生长所需营养物质的一种物质。
培养基通常由肝素、胰岛素和细胞因子等多种不同的化合物构成，以满足不同类型的细胞对营养物质的需求。
三、细胞的消耗物质细胞培养期间需要提供物种很多，其中主要包括以下几种：1.抗生素：用来防止在培养细胞中出现感染。
2.气体：氧气和二氧化碳是保证细胞正常生长的重要物质。
3.酸碱指示剂：用来检测培养基的酸碱度，以保证细胞处于适宜的pH值下。
四、细胞培养设备1.培养箱：用于控制培养环境中的温度、湿度和氧气等因素。
2.显微镜：用来观察细胞的形态和生长情况。
若无显微镜，还需要检测仪器，用来检测培养细胞的生长情况。
3.细胞培养板：用来培养细胞和收集细胞。
五、细胞培养的步骤细胞培养的步骤一般可以分为以下几个：1.细胞分离：从样品中分离出单个的细胞。
2.细胞传代：选取健康的细胞将其转移至新的培养基中，继续增殖，以获得更多的细胞。
3.细胞计数：测量细胞数量以确定下一步操作所需的细胞量。
4.细胞培养：将细胞加入新的培养基中，进行培养。
根据细胞培养的不同类型，上述步骤会稍有不同。
总之，细胞培养技术对于生命科学、医学研究、生物制药等领域都具有重要的应用价值，它通过人工培养细胞，为科学家们提供了一种研究生物学的新途径。
实验室细胞培养基本知识
• 不耐热液体：过滤除菌；
• 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
灭菌方式的选择
项目 玻璃器皿 金属制品 带螺口盖的玻璃品 玻璃移液管 枪头 消毒方式 干热 干热 高压灭菌，将盖悬 松 干热 高压灭菌 高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶
HEPES 甲基纤维素
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
明确地选择出来，就成为一个细胞株。
细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。 • 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质 )、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。
湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放
臵）； • 自然冷却后臵于烘箱中烘干。
水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶 体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
配置完全培养基
细胞培养技术
试剂标注规范
试剂名称 配制浓度 配制人 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三 2016.10.21
耗材
培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
培养基（成分、分类）
耗材（分类、用途）
缓冲液 （PBS、Hanks等）
消化液（分类及应用）
步骤）
消毒菌方法
物理消毒灭菌法 Co60辐射（γ射线）：破坏生物大分子（塑料制品）
紫外线（200-300 nm）：30min，阻止细菌、病毒 核酸合成。（细胞室：用于空气，操作台表面等）
湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微 生物孢子、蛋白变性。（用于大量液体、玻璃器皿、 部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）
血清（作用、存储及解冻方法）
试剂标签要规范
三 清洗及灭菌
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感, 均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质
需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 （包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个
血清
提供基本营养物质、激素和各种生长因子、 提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴 壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保 护作用。
保存血清最好的方法？ 建议血清保存在-20℃。解冻后存放于4℃时，请 勿超过一个月。 （分装）
如何解冻血清才不会使产品质量受损? 建议从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之缓
作 用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hank’s）。 EDTA溶液
一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+ 、 Mg2+来保持其完整性，EDTA可以螯合这些离子，可使细 胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%， 以无钙、镁的平衡盐溶液配制 。 胶原酶溶液
细胞培养技术
三、培养细胞技术
（二）细胞来源 （2） 消化培养法 与组织块培养法区别： A. 用酶制剂处理组织块，除去细胞间
质，使细胞分离，形成细胞悬液； B. 细胞生长方式多为单层。
优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长 较快。
缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细 胞有损伤。
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三、培养细胞技术
（二）细胞来源 2. 细胞系（cell line） 原代培养物开始第一次传代培养后的细
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白
和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些
带正电荷的糖蛋白的Байду номын сангаас贴壁因子先吸附于底物
上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功 能基团）
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潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。
单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
克隆抗体。
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细胞培养目的和作用
基础研究 (1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生 机理。
2、生物制药 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗
等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的
过滤）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品
（1）培养瓶（25 、75 cm3）
6孔）
培养板（96、48、24、12、
培养皿（各种直径规格）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品 （2）离心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）冻存管、EP管 （5）试剂瓶等。
细胞培养工艺介绍
培养条件优化
总结词
细胞在体外生长还需要适宜的培养条件，包括传代方 式、传代时机、细胞密度等。
详细描述
传代方式是指将细胞从一个培养瓶或皿中转移至另一个 培养瓶或皿中的方法。传代时机的选择也是非常重要的 ，如果传代时机过早，会导致细胞分裂过快、细胞质量 下降；如果传代时机过晚，则会导致细胞死亡。因此， 选择适宜的传代时机可以保证细胞的正常生长和分化。 细胞密度也是影响细胞生长的重要因素之一，适宜的细 胞密度可以保证细胞的正常生长和分化。一般来说，在 细胞培养过程中，需要定期检测细胞的密度并进行调整 。
细胞扩增
在适宜的条件下，细胞将进行增殖，数量不断增多。
细胞收获与检测
细胞收获
当细胞数量达到实验需求时，通过胰酶消化、离心等方法收获细胞。
细胞检测
对收获的细胞进行形态学观察、细胞计数、活性检测等指标的检测，以评估细胞的生长状态和质量。
CHAPTER 04
细胞培养的工艺优化
培养基优化
总结词
培养基是细胞培养的关键因素，优化培养基可以提高 细胞生长速度、减少污染、提高细胞质量。
气体环境控制
控制培养环境中的气体成分，如氧气、二氧化碳 等，以维持细胞的正常生理状态。
CHAPTER 06
细胞培养的未来发展
组织工程应用
组织工程是细胞培养技术的重要应用方向，通过构建人工生物组织，替代损伤或病 变的组织，实现修复和再生。
组织工程的研究涉及多种细胞类型、生物材料和生长因子等，需要不断优化和改进 技术，提高组织的结构和功能。
基因表达
基因表达是指DNA中的遗传信息被转 录成RNA，再被翻译成蛋白质的过程 ，调控着细胞的生长、分化和功能。
CHAPTER 03
细胞复苏及培养实验方法
细胞复苏及培养实验方法
一、准备细胞复苏所需物品
1.离心管
2.细胞计数板
3.移液管
4.细胞培养瓶
5.细胞冻存管
6.液氮
7.37℃水浴
8.培养基
9.血清
10.抗生素
二、细胞复苏步骤
1.从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中快速复苏。
2.待细胞冻存管外表面融化后，打开管盖，用移液管吸出细胞悬液，放入离心管中。
3.将离心管中的细胞悬液以适当的转速和时间离心，去除上清液。
4.离心后，用含有一定比例血清和抗生素的培养基重悬细胞，制成细胞悬液。
5.将细胞悬液均匀分装到细胞培养瓶中，放入培养箱中进行培养。
三、细胞培养步骤
1.将细胞培养瓶放入培养箱中进行培养，保持适宜的温度和湿度。
2.根据需要更换培养基，保持细胞生长所需的营养和生长因子。
3.根据细胞的生长情况，适时进行传代培养，保持细胞的生长活力和数量。
4.在培养过程中进行必要的细胞鉴定和表型检测，确保细胞质量和实验结果
的可靠性。
5.记录细胞的生长情况、传代次数和鉴定结果等信息，建立完整的细胞系档案。
注意事项：
1.在操作过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.根据不同的细胞类型和实验需求，选择适宜的培养基、血清和生长因子。
3.定期检查细胞的形态、生长情况和传代情况，及时发现异常并进行处理。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
细胞传代培养的步骤
1.准备试剂和培养基：确保DMEM或其他基础培养基、胰酶、完全培养液（含
血清和必要的添加剂）以及PBS等试剂准备就绪。
2.观察细胞状态：在显微镜下检查细胞密度、生长状态和健康状况。
如果细胞
长满至80%~90%，且看起来健康、有活力，则可以进行传代。
3.消化细胞：向培养瓶中加入适量的胰酶溶液，使细胞被充分覆盖。
消化时间
根据细胞类型和培养条件有所不同，通常为1至3分钟。
4.终止消化：加入完全培养液终止消化过程。
这有助于将细胞从消化液中悬浮
起来。
5.离心处理细胞：将细胞悬液在1500至1000 rpm下离心，以收集细胞。
6.调整细胞悬液：弃去上清液，用新鲜培养液重悬细胞。
7.计数和接种细胞：使用细胞计数板对细胞进行计数，并根据所需密度调整细
胞悬液体积。
8.接种细胞：将细胞悬液加入新的培养瓶中，每个瓶中的细胞数量应适当，以
避免过密或过稀。
9.培养和观察：将培养瓶放入培养箱中，定期观察细胞生长和状态，确保它们
健康且生长良好。
细胞培养名词解释
细胞培养名词解释
细胞培养是指将细胞分离出来，在培养基中增殖繁殖，并进行活力测试的一种技术。
它是一种用于建立和维持多器官功能的实验室技术，可以用于研究细胞的生理特性，研究细胞相互之间的关系以及对外界环境反应之类的实验。
培养基：
培养基是一种可以提供养料和细胞适宜生存的发酵液，它的组分包括氮源、碳源、矿质营养物质、维生素、磷酸钠(NaH2PO4)、氯化钠(NaCl)、还原剂(Na2S2O3)等。
细胞定位：
细胞定位是指在细胞培养实验中，根据不同的实验要求，通过观察分析细胞分离后的培养基，将不同的细胞定位在不同的区域，以便进行下一步实验。
单细胞处理：
单细胞处理是指利用微量流体动力学的技术，将细胞在一个个微小的体系中进行分离和处理，以便学习细胞间的相互作用和调控、生物传感以及细胞内信号传导的过程。
细胞活性检测：
细胞活性检测是指在实验中鉴别细胞是否具有活性，主要包括细胞活性指数测定法和活性监测法。
前者主要是通过对受试细胞的增殖指数、膜通透性指数、激活指数、生长指数等进行测定，以测定细胞的有效性；后者主要是利用免疫法、荧光法等检测受试细胞内的活性
物质，以检测细胞的健康状态。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞传代
实验步骤：
1.取出要传代的细胞，在倒置显微镜下观察，细胞生长呈致密单层，则需传代。
2.用移液枪(直接倒掉)移去培养瓶中培养基，用3ml PBS洗涤一次(培养瓶垂直
放置，不要将枪对着细胞附着面次入)。
3.轻摇培养瓶，使PBS流过细胞附着面，用移液枪(直接倒掉)移去PBS。
4.加入1ml胰酶进行消化，1min，镜下观察(可将瓶口45o进行轻拍，镜下观察
细胞呈圆形，有立体感，轻晃瓶体，课件细胞流动)。
5.加入1ml培养基停止消化，吹打壁面(将细胞粘附面进行冲洗)。
6.将细胞悬液移入离心管，1000rpm离心5min(离心时注意配平)，移除上清，
加入3ml培养基吹打均匀(吹打30~40次)。
7.3瓶各加2ml培养液，再各吸1ml细胞悬浮液。
8.倒置显微镜下观察细胞状况(黑色物为气泡)
9.放入温室孵育
细胞冻存
1．取出要冻存的细胞，除去培养基，用3ml的PBS洗一次，加胰酶消化1min，镜下观察(敲打离壁，口斜向上)，加1ml培养基终止消化，离心，去上清。
2．加入1.5ml冻存液(分为纯血清冻存液和无血清冻存液)，将细胞打匀，移入冻存管中。
3．将冻存管放入程序降温盒中，-80o保存。
蛋白质样品制备。
细胞培养技术
二、培养细胞的特性
培养细胞的生长特点
贴附
贴附
贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一 以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快
（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物
形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展
开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成
为成纤维细胞的形态。
1. 培养细胞的生长方式及类型
五 细胞冷冻保存
1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，
冷冻方法： 传统方法8小 时(或隔夜)--> 液氮槽蒸汽相中长期储存。
2. 材料用品
1） 2） 3） 4） 生长良好的培养细胞 新鲜培养基 DMSO (Sigma D-2650) 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
四、细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一 般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品： PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基
3. 步骤：
3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。
2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。
3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细 胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。
1. 细胞培养(cell culture)概念
从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在 无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存
和生长并维持其结构和功能的技术。
体内、外细胞的差异
体内细胞：
机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能
3. 操作步骤：
细胞培养技术概述 - 51种常见细胞系培养技术参考
细胞培养◆细胞培养技术概述细胞培养基本概念细胞培养条件细胞培养的环境培养细胞形态每代贴附生长细胞的生长过程实验准备细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法培养细胞活力测定细胞冻存和复苏细胞冻存方法细胞复苏方法细胞培养目的与用途细胞系及其培养基对照表◆多种细胞的培养方法详述◆阿拉丁系列细胞培养试剂◆细胞培养技术概述细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境,在无菌, 适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术.细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群.传代:细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。
原代培养:取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（0.2mm)器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器官细胞培养条件1 细胞的营养需要2 无污染3 无毒4 细胞的生存环境温度: 37 ℃O 2CO2:5% CO2 +H 2 O ← →H 2 CO 3← →H + + HCO3 -pH: 7.2-7.4渗透压细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2 、恒定的温度维持细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.一般标准温度为 36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41- 42℃1 小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
细胞培养基本技术PPT课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
细胞培养
细胞培养一、细胞培养细胞请于细胞培养箱中培养，大部分细胞是37℃，5% C02，湿度100%环境下培养的。
细胞于培养瓶或皿中培养，加入适量说明书上标注的细胞相应完全培养基（一般液面高度2-3mm即可）。
小瓶4-5mL，大瓶8-10mL。
二、细胞复苏1. 拿出细胞2. 37度水浴锅中复苏，1min，摇晃冻存管，加快溶解3. 冻存管的细胞液移至离心管，离心5min，1000r/min4. 移至新的培养瓶，补足量预热完全培养基，放入培养箱三、细胞换液弃培养基，加入PBS洗2-3遍，加入新培养基。
四、细胞传代1. 细胞培养至密度达80%以上时即可传代2. 弃培养基，加入PBS洗2-3遍3. 加入1~2mL胰酶，轻轻晃动，使胰酶浸没到培养瓶底的所有部位，将盖好放入培养箱中消化，显微镜下观察细胞，若大部分细胞不再贴壁，倒掉胰酶加入培养基终止消化。
（细胞不同，1~3min）4. 分成几份加入新的培养瓶，补新培养基。
关于消化时间：若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化；消化时间是长期培养细胞过程中总结得到的，可根据镜检结果和细胞状态适当调整。
宜少不宜多五、细胞冻存1. 弃培养基，加入PBS洗2-3遍2. 加入1~2mL胰酶，轻轻晃动，使胰酶浸没到培养瓶底的所有部位，将盖好放入培养箱中消化，显微镜下观察细胞，若大部分细胞不再贴壁，倒掉胰酶加入培养基终止消化。
3. 离心5min，1000r/min，，倒出培养基，快速加入冻存液适量（一般为血清: DMSO=9:1 或无血清培养基:血清:DMSO=5:4:1），轻轻吹打混匀4. 每个冻存管内加入1ml，拧紧瓶盖，做好实验标记（上排：细胞名称，代数，下排：冻存人姓名，日期-年-月-日），封口膜和白色胶带封口5. 放入冻存盒中，直接转入-80℃冰箱，2-3天后移入液氮罐。
培养细胞的流程
培养细胞的流程以培养细胞的流程为标题，我们将会介绍一种常用的细胞培养过程，该过程包括细胞的准备、培养基的配制、细胞的接种、培养条件的调节以及细胞的观察与收集等步骤。
一、细胞的准备在细胞培养开始前，需要准备好所需的细胞。
细胞可以来源于人体组织、动物器官、细菌、真菌等。
首先，需要从相应的来源中采集细胞样本，如血液、组织切片等。
然后，将样本进行处理，如细胞分离、细胞培养等，以获取纯净的细胞。
二、培养基的配制培养基是细胞培养的基础，它提供了细胞所需的营养物质和生长因子。
配制培养基时，需要准备好培养基的主要成分，如无菌水、氨基酸、糖类、维生素等，按照一定比例混合，并进行高温高压灭菌处理，以确保培养基的无菌性。
三、细胞的接种在培养基中加入所需的细胞，并进行细胞接种。
接种时，需要注意细胞接种的密度，通常根据细胞的类型和培养的需求来确定适当的接种密度。
接种完成后，将培养皿放入细胞培养箱中，提供适当的培养条件。
四、培养条件的调节细胞的生长需要适宜的环境条件，如温度、湿度、氧气浓度和pH 值等。
一般情况下，细胞培养箱会提供恒温恒湿的环境，可以通过调节培养箱的温度和湿度来满足细胞的生长需求。
同时，还需要定期检测和调节培养基的pH值和氧气浓度，以确保细胞的正常生长。
五、细胞的观察与收集在细胞培养过程中，需要定期观察细胞的生长情况。
可以使用显微镜来观察细胞的形态和数量，并记录相关数据。
同时，还可以进行细胞的染色和显微镜观察，以了解细胞的结构和功能。
当细胞生长到一定程度时，可以进行细胞的收集。
收集细胞时，需要注意细胞的纯度和活力，可以使用酶消化等方法，将细胞从培养基中分离出来。
通过以上流程，我们可以成功地进行细胞的培养。
细胞培养技术在生物学研究、药物研发、生物工程等领域具有重要的应用价值，可以为相关研究提供可靠的实验基础。
然而，在进行细胞培养时，也需要注意细胞的无菌性、培养条件的合理调节和细胞的观察与收集等方面，以确保培养的成功和可靠性。
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（08 北京）（18分）白菜、甘蓝均为二倍体，体细胞染色体数目分别为20、18。
以白菜为母本、甘蓝为父本，经人工授粉后，将雌蕊离体培养，可得到“白菜-甘蓝”杂种幼苗。
请回答问题：（1）白菜和甘蓝是两个不同的物种，存在隔离。
自然条件下，这两个物种间不能通过的方式产生后代。
雌蕊离体培养获得“白菜-甘蓝”杂种幼苗，所依据的理论基础是植物细胞具有。
（2）为观察“白菜-甘蓝”染色体的数目和形态，通常取幼苗的做临时装片，用染料染色。
观察、计数染色体的最佳时期是。
（3）二倍体“白菜-甘蓝”的染色体数为。
这种植株通常不育。
原因是减数分裂过程中。
为使其可育，可通过人工诱导产生四倍体“白菜-甘蓝”，这种变异属于。
【答案】⑴生殖杂交（有性生殖）全能性⑵根尖（茎尖）醋酸洋红（龙胆紫、碱性）有丝分裂中期⑶19 没有同源染色体配对的现象染色体变异【解析】经人工授粉后得到的雌蕊进行离体培养，这样得到的雌蕊主要利用的是融合的受精卵，它是由白菜的卵细胞（n=10）和甘蓝的精子（n=9）结合而来。
这样培育得到的“白菜－甘蓝”是异源二倍体，染色体数是2n=10+9=19，由于在杂种体内没有同源染色体，在减数分裂时联会紊乱，不能形成正常的配子，所以通常是不育的；可用秋水仙素处理使染色体数目加倍得到可育的四倍体“白菜－甘蓝”。
幼苗中细胞分裂活动最旺盛的是根尖的分生区，在有丝分裂的中期染色体形态固定、数目清晰可数，是对染色体进行观察和计数的最佳时期。
（07 海南）某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。
供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。
请回答下列有关动物细胞培养的问题：（1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其它培养条件均相同。
一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量。
（2）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是。
细胞培养应在含5% CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是。
（3）在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长。
药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更。
若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用消化处理。
（4）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的。
（5）已知癌基因X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的或合成水平的差异，确定Y的药效。
（1）多（1分）（2）血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液pH（每空2分，共4分）（3）停止（2分）多（1分）胰蛋白酶（2分）（4）抗生素（2分）（5）Y mRNA蛋白质（每空2分，共6分）（08 海南）某二倍体植物是杂合体，图为其花药中未成熟花粉在适宜的培养基上培养产生完整植株的过程。
据图回答：（1）图中①表示的是该花粉培养过程中的过程，②表示的是过程，X代表的是，③表示的是过程，④表示的是诱导过程。
（2）图中从愈伤组织形成完整植株的途径有两条，具体通过那一条途径主要取决于培养基成分中的种类及其浓度配比，最后获得的来源于为成熟花粉的完整植株都称为植株（甲）。
未成熟花粉经培养能形成完整植株，说明为成熟花粉具有。
（3）对植株进行，才能使其结实产生后代（乙），否则植株甲只有通过的方式才能产生后代（丙）。
乙、丙两种植株中，能产生可育花粉的是植株，该植株群体中每一植株产生可育花粉的基因组成种类数为种，该群体植株产生可育花粉的基因组成种类数为种。
花药培养在育种上的特殊意义是，从而开辟育种新途径。
（1）脱分化再分化胚状体分化（或发育）生根（每空1分，共5分）（2）激素单倍体细胞的全能性（每空2分，共6分）（3）染色体加倍（其他合理答案也给分）无性生殖乙（或经过染色体加倍）一多（每空1分，共5分）缩短育种周期（2分）（07 江苏）不同的微生物对营养物质的需要各不相同。
下列有关一种以CO2为惟一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素B．碳源物质也是该微生物的能源物质C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D．水是该微生物的营养要素之一（07 江苏）动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。
右图是血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果。
从该图提供的信息可以获得的正确结论有A．正常细胞与癌细胞的增殖速率相同B．有无血清对正常细胞培养的影响不同C．培养基中补充血清有助于正常细胞的培养D．培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大（08 江苏）下列关于植物组织培养的叙述中，错误．．的是A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压B．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同（08 宁夏）回答下列有关动物细胞培养的问题：⑴在动物细胞培养过程中。
当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。
此时，瓶壁上形成的细胞层数是。
要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。
⑵随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量。
⑶现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是。
⑷检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。
⑸在细胞培养过程中，通常在条件下保存细胞。
因为在这种条件下，细胞中的活性降低，细胞的速率降低。
⑹给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作进行攻击。
⑴相互接触接触抑制单层（或一层）胰蛋白酶⑵衰老甚至死亡不死性降低减少⑶由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色（或由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色）⑷中⑸冷冻（或超低温、液氮）酶新陈代谢⑹抗原（08 全国1）下列关于细胞工程的叙述，错误．．的是A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制务单克隆抗体D.某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同（07 全国2 ）（1）已知番茄的抗病与感病，红果与黄果、多室与少室这三对相对性状各受一对等位基因的控制，抗病性用A、a表示，果色用B、b表示，室数用D、d表示。
为了确定每对性状的显、隐性，以及它们的遗传是否符合自由组合规律，现选用表现型为感病红果多室和两个纯合亲本进行杂交，如果F1表现抗病红果少室，则可确定每对性状的显、隐性，并可确定以上两个亲本的基因型为和。
将F1自交得到F2，如果F2的表现型有种，且它们的比例为，则这三对性太的遗传符合自由组合规律。
（2）若采用植物组织培养技术，从上述F1番茄叶片取材制备人工种子、繁殖种苗，其过程可简述为如下5个步骤：上述过程中去分化发生在第步骤，再分化发生在第步骤，从叶组织块到种苗形成的过程说明番茄叶片细胞具有。
（07 山东）[生物-现代生物科技专题]继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。
最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。
请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是。
（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入中，原因是。
（3）通常采用技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。
（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的细胞中特异表达。
（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠体细胞的转入细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。
该技术称为。
答案：（1）显微注射（2）受精卵（或早期胚胎）受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达（3）DNA分子杂交（核酸探针）（4）膀胱上皮（5）细胞核去核的卵核移植（或克隆）（09 山东）人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。
已知某传染病的病原体为RNA 病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：请回答：（1）过程①代表的是反转录。
（2）过程②构建A基因表达载体时，必须使用限制酶和DNA连接酶两种工具酶。
（3）过程③采用的实验技术是细胞融合技术，获得的X是杂交瘤细胞。
（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的A基因所制备的疫苗。
对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行RNA核糖核苷酸序列比较分析；或用图中的A蛋白和抗A蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测。
解析：该题考查选修III基础知识的题目，比较简单，答案如题中所给。