实验九 动物细胞的原代培养
动物细胞的原代培养
动物细胞的原代培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。
细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术。
一、实验目的了解动物原代细胞培养的基本方法及操作过程；初步掌握无菌操作方法；观察体外培养细胞的生长特征。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
直接从身故体内分离的细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
三、实验用品1.器材①解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、移液管、橡皮头、培养瓶、玻璃匀浆器、1.5ml离心管等。
上述器材均需彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌20min，备用。
②倒置显微镜、离心机、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、大头针、解剖板等2.试剂完全培养液不完全培养液90%小牛血清10％双抗（链霉素、青霉素）（1万单位/mL）加至约为100单位/mL7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养一、【实验目的】1、学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法2、学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法二、【实验原理】1、原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。
2、原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。
3、原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。
4、组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。
是常用的、简便易行和成功率较高的方法。
5、依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。
本实验采用翻转干涸法。
6、酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。
7、由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。
三、【实验仪器、试剂及材料】仪器：培养瓶（3个/人）、培养皿（1套/2人）、剪子和镊子（1套/人）、青霉素小瓶（1个/人）、滴管（1-2个/人）、移液管若干、冻存管(2个/人)等：试剂：PBS、MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）等材料：泥鳅四、【实验步骤及内容】材料的预处理鱼类消毒1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。
2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。
3.将实验用鱼放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。
4.用纱布包裹将鱼取出，将其击昏。
动物细胞原代培养名词解释
动物细胞原代培养名词解释1.引言1.1 概述动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，被广泛应用于生物学研究领域。
通过原代培养，科研人员可以将动物体内的细胞从组织或器官中分离出来，并在适当的培养条件下培养和繁殖这些细胞。
这种培养方法能够维持细胞的生长和功能，使其能够在体外环境下长期存活。
原代培养的过程可以分为两个主要阶段：细胞分离和细胞培养。
首先，需要将动物组织或器官进行机械或酶解分离，以获得单个的细胞悬浮液。
然后，将这些分离的细胞种植在含有适当培养基和营养物质的培养皿中，提供合适的温度、湿度和氧气条件，使细胞得以生长和分裂。
通过原代培养，科研人员可以获得大量的动物细胞来进行各种实验和研究。
这些细胞可以用于研究细胞的生理功能、细胞周期、细胞信号传导以及疾病模型的建立等。
此外，通过原代培养还可以进行细胞遗传学研究、药物筛选和细胞工程等领域的实验。
总而言之，动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，可以为科研人员提供源源不断的动物细胞来进行各种研究。
它为细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域的进展提供了坚实的基础，并在解决许多科学问题中扮演着重要的角色。
文章结构指的是文章的组织框架和布局。
它的作用在于使读者能够清晰地理解整篇文章的内容和结构，从而更好地把握文章的主旨和论证思路。
本文按照以下结构进行组织和呈现：1. 引言1.1 概述在这一部分，将对动物细胞原代培养的基本概念和背景进行简要介绍，引起读者的兴趣，并提出研究的意义。
1.2 文章结构（即本节内容）在这一部分，将对整篇文章的结构进行概述，介绍各个章节的内容以及它们在整篇文章中的作用。
1.3 目的在这一部分，明确研究动物细胞原代培养的目的，说明研究的意义和价值，为读者提供清晰的导向。
2. 正文2.1 原代培养详细介绍什么是原代培养，原代培养的步骤和方法，以及原代培养在细胞研究中的重要性和应用领域。
2.2 动物细胞介绍动物细胞的结构和特点，包括细胞膜、细胞质、细胞核等重要组成部分，以及动物细胞在生物学研究和医学领域中的应用。
09动物细胞培养实验
实验一清洗与灭菌（4学时）一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品1．材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
2．药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)。
3．仪器：超净台，干燥箱，高压蒸气灭菌锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
动物细胞原代培养实验目的（1）掌握无菌操作方法；（2）掌握
动物细胞原代培养实验目的：（1）掌握无菌操作方法；（2）掌握原代细胞培养和传代细胞培养技术；（3）熟悉体外培养细胞的观察方法实验原理直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。
无菌摘取动物的组织（或器官），用生理盐水洗净血污后直接用组织块法培养，或采用酶消化法培养。
在人工培养条件下，使细胞不断增殖生长。
原代培养是建立各种细胞系的第一步，利用原代培养技术可在体外研究各种类型细胞增殖、遗传、变异、分化和去分化。
离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时,细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。
贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞的传代则用直接传代法或离心传代法。
实验仪器、材料和试剂：（1）仪器、用具：倒置显微镜、电热恒温水浴锅、天平、CO2培养箱、高压锅、超净工作台、离心机、解剖剪、解剖刀、眼科剪、眼科镊、培养皿、锥形瓶、容量瓶、纱布、培养瓶、移液枪、酒精灯、酒精棉球、试管架等。
（2）材料：小白鼠（3）试剂：1）基础培养基：90%RPMI1640培养液+10%新生牛血清+双抗（青霉素、链霉素100U/ml），调PH至6.8～7.0，0.22μm孔径的滤膜过滤灭菌分装后置4℃冰箱待用。
2）无钙镁PBS（PBS(-)）缓冲液的配制:称取NaCl10.00g,NaHPO4.12H2O1.44g,KCl0.25g,KH2PO40.25g,用四蒸水将试剂溶于500ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌直至完全溶解后，用1000ml容量瓶定容，摇匀，分装于200ml 的玻璃瓶中，15磅高压灭菌30min，4℃冰箱保存。
3）称取胰蛋白酶0.25g 和EDTA0.04ｇ，溶入100mlPBS中，常温磁力搅拌器搅拌直至彻底溶解，用0.22μm孔径的滤膜过滤，无菌条件分装成小瓶（4ml/瓶），－20℃冰箱冻存。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞的原代及传代培养
动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。
二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。
要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。
传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。
三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。
实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。
2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。
3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。
（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。
动物细胞原代培养
实验内容
乳鼠肺组织原代培养程序 原代细胞培养操作要领 原代细胞培养注意事项 原代细胞培养的取材
乳鼠肺组织原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
取材
漂洗
剪切
消化
消化
消化
小组织块消化分离细胞
制备单细胞悬液
接种
原代细胞培养操作要领
原代细胞培养操作要领
细胞 培养
原代细胞培养方法
组织块培养法 单层细胞培养法 组织块预消化培养法 气液界面培养法 悬浮细胞培养 微载体细胞培养法 中空纤维细胞培养法
原代细胞培养方法
组织块原代培养方法示意图
单层细胞培养法
①针蕊挤压过网法
挤压过塞法分 散组织图解
单层细胞培养法
组织块预消化培养法
动物细胞原代培养
实验目的
实验用品
从供体获取组织细胞的首次培养叫原代细 胞培养或初代细胞培养。原代细胞离体时 间短．具有二倍体遗传性，在一定程度上 反映了体内生长的特性，很适合作药物测 试、细胞分化等实验研究。
根据不同的实验目的，不同的实验材料解 离或分离细胞的方法和条件各不同。一般 常用方法有二：一是组织块培养法，二是 单层细胞培养法。
原代细胞培养操作要领
细胞计数操作要领
原代细胞培养注意事项
（1）注意污染
原代细胞培养注意事项
原代细胞培养的取材
1. 取材的基本器材
原代细胞培养的取材
2 人体肿瘤标本取材
原代细胞培养的取材
原代细胞培养的取材
4 小鼠标本取材
原代细胞培养的取材
6 人皮肤标本取材
6 人皮肤标本取材
表皮 （真皮〕
பைடு நூலகம்
动物细胞原代培养过程
动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。
用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。
1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。
三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。
四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。
2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。
（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。
五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。
2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。
3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。
制的细胞悬液。
六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。
2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。
（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。
RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
其中含有10%胎牛血清。
）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
动物细胞原代培养实验项目指导
附件-4综合设计性实验项目指导一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。
三、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。
这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。
原代培养是建立各种细胞系的第一步。
利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。
原代培养科分为组织培养法和消化法两种。
台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
四、实验材料：1.新生兔2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。
2. 取一定量的配制好的DMEM培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。
（二）新生兔细胞原代培养1. 准备（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
（2）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
动物细胞的原代培养
剪碎组织
接种组织块
移入培养箱中（注 意贴有组织块的一 面朝上），
静止2～3小时， 然后将细胞培养瓶 轻轻翻转，继续静 止培养。
观察
24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已 被污染； 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养 液pH过高； 若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞 生长良好。在相差显微镜下观察，若此时见细胞 自组织边缘长出。 继续培养3～5日，再换部分或全部培养液，待多 数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续 培养3～4天，细胞贴满细胞培养瓶壁时便可进行 传代培养。
脾脏免疫－3
打结固定小鼠
脾脏免疫－4
碘酒消毒 酒精消毒
去毛
脾脏免疫－5
剪开外皮
剪开腹膜
找到脾脏
脾脏免疫－6
注射抗原
脾脏免疫－7
缝合伤口 注射双抗
每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次
第三次免疫之后10天，将小鼠断尾取血， 用ELISA方法，检测血清效价。
取脾细胞融合前3天加强免疫一次，以活化 B淋巴细胞
The End
动物细胞的原代培养
－－组织块法
无菌室
上风口
下风口
液氮罐
安全柜
着装
操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手， 然后用1‰用75%酒精或1‰ 新洁尔 灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔
用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥 向肾门，去肾外膜及脂肪，
骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞
消化数分钟
中止消化、吹散细胞
动物细胞原代培养流程
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动物细胞原代培养流程
动物细胞原代培养流程
1. 取材。
- 从健康动物体内取出所需组织，如肝脏、肾脏等，尽量选择新鲜、无菌的组织材料。
- 取材过程要迅速，减少组织暴露在外界环境中的时间，以降低污染风险。
2. 组织处理。
- 将取出的组织块用平衡盐溶液（如PBS）清洗，去除表面的血液、杂质等。
- 把组织剪成小块，一般为1 - 3mm³大小，便于后续消化。
3. 消化。
- 加入适量的消化酶（如胰蛋白酶或胶原酶），在适宜的温度（通常为37°C）和时间（根据组织类型和酶的活性而定）下进行消化。
- 消化过程中可轻轻摇晃容器，使消化酶与组织充分接触。
4. 终止消化。
- 当组织块变得松散，大部分细胞游离出来时，加入含血清的培养液终止消化。
血清中的某些成分可以抑制消化酶的活性。
5. 过滤。
- 将消化后的细胞悬液通过滤网（如200目滤网）过滤，去除未消化完全的组织块。
6. 离心。
- 将过滤后的细胞悬液进行离心，转速一般为1000 - 1500r/min，离心时间5 - 10分钟。
- 离心后弃去上清液，得到细胞沉淀。
7. 细胞计数与活力检测。
- 用适量的培养液重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数（可使用血球计数板等工具）。
- 同时检测细胞活力（如台盼蓝染色法，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色）。
8. 接种培养。
- 根据细胞计数结果，将适量的细胞接种到培养容器（如培养瓶、培养皿）中。
- 加入适量的培养液，放入培养箱中，在适宜的温度（37°C）、湿度（95%左右）和二氧化碳浓度（5%）下进行培养。
动物细胞的原代培
消化培养法
（1）取材与剪切：同组织块培养法。 （2）消化：将剪切后的组织小块移到10ml离心管内， 加2ml的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA组成的消化液， 室温下消化5~20min，期间吹打数次，并随时吸取少量 的消化业在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或 单个细胞，则立即加入8ml含5%FBS的Hanks液终止消 化。 （3）用吸管反复吹打组织块，分散单细胞，用100μm不 锈钢网筛过滤，收取滤出液，1000r/min离心10min， 弃上清。 （4）用2ml DMEM+10%FBS培养液悬浮细胞，计数并 稀释细胞浓度至（1~5）×106/ml，每个培养瓶加细胞 悬液2.5ml，使细胞数＜1×105/cm2。置CO2培养箱， 37℃、5%CO2、饱和湿度下静置培养，24小时后，更 换新培养液，此后每3天换液1次。
动物细胞的原代培养
目的要求
1、了解原代细胞培养的基本方法几操作过 程。 2、初步掌握无菌操作和细胞观察的方法。
实验原理
动物细胞的原代培养也称初代培养，，是直接从动物体得 到组织细胞后在体外进行的首次培养。这种培养首先用无 菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）， 经酶消化处理，使分散成单个游离的细胞，在人工条件下 培养，使其不断地生长繁殖。 原代培养是建立各种细胞系的第一步。是从事组织培养工 作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。虽然原代培养是获 取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种细胞成分组 成，比较复杂。即使生长出同一类型细胞如成纤维细胞或 上皮样细胞，细胞间也有很大差异。原代培养的方法很多， 最基本和常用的有两种：组织块培养法和消化培养法。
（2）剪切：去除胎儿头、尾及内脏，只留下胎儿 四肢及躯干部分，在Hanks液内洗2~3次去除血污 后，放入60mm培养皿或青霉素小瓶内，用眼科 剪将小鼠胎儿剪成1mm3的小块。 （3）接种：用剪去尖头的枪头吸取若干小组织块， 置于培养瓶中，均匀地铺展在培养瓶底部，调整 小块之间的相互距离，每25ml培养瓶可接种 20~30小块。 （4）粘附培养：组织块布置好之后，稍微倾斜培 养瓶，使瓶内的液体倾至培养瓶的一角，吸出瓶 中的培养液，轻轻地将培养瓶翻转，让接种组织 块的瓶底面向上。盖好瓶盖，将培养瓶放置于 CO2培养箱内37℃培养2~4小时，使组织块粘着 在培养瓶底上。
原代细胞培养实验报告
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
传代细胞培养
原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
5．实验报告
(1).原代细胞和传代细胞培养有哪些区别？
(2).总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。
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细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
③．消化、接种培养
吸取％胰蛋白酶一％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
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动物细胞原代培养
原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
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动物细胞原代培养
日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
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动物细胞原代培养
实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
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动物细胞原代培养
实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
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动物细胞原代培养
操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
动物细胞原代培养植块法
动物细胞原代培养植块法动物细胞原代培养植块法，说得简单点，就是一种从动物组织中取细胞，放到合适的培养环境中，让它们在体外自己“活”起来的方法。
听着好像很高大上，但其实就是让细胞在试管里过得舒适安逸，让它们有条件生长、分裂、繁殖，甚至能在实验中为我们提供很多有用的信息，像是研究药物效果、疾病机理等等。
动物细胞原代培养就像是我们养花一样，不同的是我们养的不是花，而是细胞，而这小小的细胞可是非常挑剔的哦！原代培养听起来很复杂，但只要你掌握了其中的“窍门”，其实没那么难。
想要做好这个事儿，最关键的就是得从健康的动物身上取到合适的组织。
这一步可得小心翼翼，因为你要保证你取到的细胞是活的、健康的，不然后面的培养就白费劲了。
像是切取心脏、肝脏、皮肤、骨骼等组织，哪一块都得考虑周到，选择最佳部位。
毕竟，你不能拿一块“病死的”组织去做实验，毕竟人家细胞也有自尊，活得不好，实验结果也不靠谱。
好啦，组织拿到手了，接下来就得进入最关键的步骤——把这些细胞从组织块中分离出来。
这可不是随便一捏就能出来的，得小心操作，不能弄伤细胞，别看它们比我们小得多，它们的生命力可一点不弱！大家都知道，细胞可不是“铁石心肠”的，它们对环境的要求可高了，得有适当的温度、湿度，还得有营养物质，给它们一个良好的生长环境，不然它们可不会轻易合作。
我们要用酶来帮助把细胞从组织里分离出来，这种酶就像是“拆迁队”，它把细胞“拆”出来后，你还得通过过滤、离心等方法，尽量让它们恢复活力，清理干净，确保它们没有受到损伤。
分离出来的细胞，接下来就是要给它们“搭个家”了。
培养皿就是它们的“豪华公寓”，而培养基则是它们的“美食大餐”。
不过，这个餐单可得丰富点，不是随便几样就能满足细胞的需求哦！比如说，培养基里要加入蛋白质、氨基酸、维生素等，想让细胞住得舒服、活得长久，得给它们提供各种必须的营养。
如果缺了哪一项，细胞可能会“闹脾气”，不爱合作，甚至可能死掉。
所以，调配培养基是一门艺术，需要我们细心地掌握各种配方。
实验九 动物细胞的原代培养
5.思考题 5.思考题
胰酶的原理是什么？
3. 实验材料、用品 实验材料、
实验材料： 实验材料：昆明小鼠 实验用品： 实验用品：
①仪器及用具 超净工作台；C02培养箱；普通显微镜；倒置显微镜；水浴箱；离心机； 培养箱； 超净工作台；C02培养箱 普通显微镜；倒置显微镜；水浴箱；离心机； 高压灭菌锅；电热干燥箱。 高压灭菌锅；电热干燥箱。 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样 器、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、胶塞、酒精灯、试管架、 吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、胶塞、酒精灯、试管架、 棉球、无菌服、口罩、帽子等。 棉球、无菌服、口罩、帽子等。 ②试剂 75%乙醇、 75%乙醇、RPMI 1640培养液（含小牛血清和青、链霉素）、0.25%胰蛋 1640培养液 含小牛血清和青、链霉素）、 培养液（ ）、0.25%胰蛋 乙醇 白酶+0.02%乙二胺四乙酸 白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、Hanks液、7.4%NaHCO3溶液。 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液 Hanks液 7.4%NaHCO3溶液 溶液、 溶液。
实验九 动物细胞的原代培养
1. 实验目的
初步掌握细胞的原代培养技术。 初步掌握细胞的原代培养技术。 了解原代培养的意义。 了解原代培养的意义。 学习台盼兰染色检定细胞死活的方法。 学习台盼兰染色检定细胞死活的方法。
2. 实验原理
原代培养的两种主要方法： 原代培养的两种主要方法： 125% 消 化 法 ： 37 度 ， 0.125% 胰 蛋 白 酶 或 0.02%EDTA消化20~40分钟。 02%EDTA消化20~40分钟 消化20 分钟。 组织块培养法：将组织块培养于平皿中， 组织块培养法：将组织块培养于平皿中， 待组织边缘开始有单层细胞伸展开来， 待组织边缘开始有单层细胞伸展开来，即 从组织培养转为细胞培养。 从组织培养转为细胞培养。
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待组织边缘开始有单层细胞伸展开来，即
从组织培养转为细胞培养。
3. 实验材料、用品
实验材料：昆明小鼠
实验用品：
①仪器及用具 超净工作台；C02培养箱；普通显微镜；倒置显微镜；水浴箱；离心机； 高压灭菌锅；电热干燥箱。 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样 器、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、胶塞、酒精灯、试管架、 棉球、无菌服、口罩、帽子等。 ②试剂 75%乙醇、RPMI 1640培养液（含小牛血清和青、链霉素）、0.25%胰蛋 白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、Hanks液、7.4%NaHCO3溶液。
小鼠脾淋巴细胞的原代培养
取出脾脏后，研磨，过滤，低渗除红细胞，离心收集镜检。 台盼兰染色检定细胞死活：一滴悬液加考题
胰酶和EDTA消化的原理是什么？
4. 实验步骤
小鼠肝细胞的原代培养
消毒→拉颈或摘眼球放血法处死小鼠→再消毒→逐层消毒解剖→取
肝→清洗→剪碎组织约1mm3→洗涤。 一次消化法： 37度下，青霉素瓶中加0.125%胰酶消化30分钟，不 时吹打振荡。用加 5%血清的 D-Hanks终止消化，过滤离心洗涤后 即可镜检。 组织块培养法：滴少量血清于平皿底部，抹平，将组织块逐个铺展 开，37度倒置培养2~3h，再翻转加培养基即可。
实验九 动物细胞的原代培养
1. 实验目的
初步掌握细胞的原代培养技术。
了解原代培养的意义。
学习台盼兰染色检定细胞死活的方法。
2. 实验原理
原代培养的两种主要方法：
消 化 法 ： 37 度 ， 0.125% 胰 蛋 白 酶 或
0.02%EDTA消化20~40分钟。
组织块培养法：将组织块培养于平皿中，