实验报告-细胞原代培养实验

细胞生物学实验报告

实验三细胞原代培养

1引言

1.1 实验目的

1. 理解细胞原代培养原理。

2. 了解细胞原代培养的应用。

3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。

4. 巩固无菌操作技术。

1.2 实验原理

细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

2实验仪器、试剂及操作步骤

2.1 实验仪器

超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒

（头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等

2.2 实验试剂

DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等

2.3 实验材料

动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚

2.4 实验步骤

A.鸡胚成纤维细胞的原代培养

1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。

2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。

3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。

4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。

5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋

壳。

6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。

7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。

8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。

9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。

10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组

织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。

11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在

37℃、5%CO2培养箱中培养。

12.3小时后翻转培养瓶，3天后在倒置显微镜下观察。

13.第三天的传代培养：弃去培养液，用胰蛋白酶消化细胞，弃去消化液。补加培养液，轻轻将细胞吹

打下来，吹打均匀，将培养物吸至离心管内，静置5-10min，上层为单细胞悬液，下层为组织块沉淀。

将上层单细胞悬液轻轻吸至培养瓶中，弃组织块。向细胞悬液中加入培养液。

B.鼠胚成纤维细胞的原代培养：

1.由别的小组进行取出胚胎。

2.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用D-Hanks缓冲液洗涤3次，充分弃除红细胞。

3.在一个小平皿的盖子中加入10mLD-Hanks缓冲液，去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于小平皿

盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。

4.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组

织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。

5.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在

37℃、5%CO2培养箱中培养。

6.3小时后翻转培养瓶，3天后在倒置显微镜下观察。

7.第三天的传代培养：弃去培养液，用胰蛋白酶消化细胞，弃去消化液。补加培养液，轻轻将细胞吹

打下来，吹打均匀，将培养物吸至离心管内，静置5-10min，上层为单细胞悬液，下层为组织块沉淀。

将上层单细胞悬液轻轻吸至培养瓶中，弃组织块。向细胞悬液中加入培养液。

3 结果与分析

3.1 细胞原代细胞结果

图 1 鸡胚成纤维细胞在原代培养76h后在显微镜下的状态（放大倍数：7*10）

图注：细胞为鸡胚成纤维细胞，进行原代培养，图为细胞在培养76h后的状态，该视野下细胞数目多，组织块残留也较多。

图 1 鼠胚成纤维细胞在原代培养76h后在显微镜下的状态（放大倍数：7*10）

图注：细胞为鼠胚成纤维细胞，进行原代培养，图为细胞在培养76h后的状态，该视野下细胞数目多，组织块残留也较多。

结果分析：如图1和图2所示，细胞数目非常多，紧密生长，组织块残留也多，实验操作应将把组织块移除。同时，图1的鸡胚和图2的鼠胚对比，鸡胚细胞生长状况更好，可能原因是鸡胚初始接种时数目就很多。由图可知，细胞没有被污染，但培养液中也有少量死细胞存在。

4 思考题

1.为克服微生物污染应采取哪些措施？

1）橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过酒精灯火焰；2）在培养液或使用到的试剂中加入抗生素；3）实验器材、手术器械经过高压灭菌；4）实验时在酒精灯旁边进行操作；5）实验人员进入实验室时穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手，按规矩操作；6）实验操作过程中各种注意事项，比如手不能接触到培养瓶、吸管在某些情况下不能重复利用等。

2.如何提高原代细胞培养的成功率？

1）保持无菌，取下的组织一定要经过酒精，含双抗的D-Hanks缓冲液冲洗数次，实验操作要规范，做到无菌操作；2）剪碎组织时应该越碎越好，剪到1mm3；3）培养基的pH等符合细胞生长条件。