24-长江中下游地区6个克氏原螯虾群体遗传多样性分析

收稿日期：2011－05－09基金项目：江西省农业厅重点科技攻关资助项目（E04723）作者简介：黄羽（1986—），男，硕士生；通信作者：胡成钰（1964—），教授，博士生导师，hucy2008@21cn．com 。

引文格式：黄羽，戴银根，毕成武，等．长江中下游地区6个克氏原螯虾群体遗传多样性分析［J ］．南昌大学学报：工科版，2011，33（3）：243－247．文章编号：1006－0456（2011）03－0243－05长江中下游地区6个克氏原螯虾群体遗传多样性分析黄羽1，戴银根2，毕成武1，胡成钰1（1．南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌330031；2．江西省水产技术推广站，江西南昌330046）摘要：为探讨长江中下游地区克氏原螯虾群体遗传多样性，使用AFLP 标记，用5个EcoR Ⅰ－Mse Ⅰ引物从6个群体139个个体中共扩增出129个位点，其中多态性位点为89，占68．99%，通过NTSYSpc 软件对统计的1/0矩阵进行分析。

结果表明：在群体水平上，洪泽湖显示了最大的遗传多样性，多态位点比例为75．74%，有效等位基因数为1．4181，Nei ’S 遗传多样性指数为0．5829，Shannon 多样性信息指数为0．441；群体间发生了较高程度的遗传分化，6个群体间的遗传分化系数为0．4186，群体的遗传变异91．20%来源于群体内，8．80%来源于群体间，遗传变异主要存在于群体内，群体内的遗传分化大于群体间的分化；6个克氏原螯虾群体可以分为3组，而鄱阳湖群体在这3组中均有分布。

关键词：克氏原螯虾；AFLP ；遗传多样性；长江中下游中图分类号：Q958．1文献标志码：AAssessment of 6Wild Crayfish for Evaluation of Genetic Diversityin the Middle and Lower Reaches of the Yangtze RiverHUANG Yu 1，DAI Yin-gen 2，BI Cheng-wu 1，HU Cheng-yu 1（1．School of Life Science and Food Engineering ，Nanchang University ，Nanchang 330031，China ；2．Fishery Technical Extension Station of Jiangxi Province ，Nanchang 330046，China ）Abstract ：The objective of this work is to estimate the genetic diversity using amplified fragment length poly-morphism （AFLP ）．A total of 129loci were generated with five EcoRI －MseI primer combinations and scored as bi-nary data in 139individuals．The percentage of polymorphic loci was 68．99%．These data were analyzed by cluster methods in the software package NTSYSpc ：Among the six populations ，the highest gene diversity was found within the Nanjing （HZ ）population ：PPB =75．74%，Ne =1．4181，Nei＇s （1973）gene diversity H =0．5829，Shannon＇s Information index H pop =0．441；Similarly ，the estimated fxation index （G st ）value averaged across all polymorphic loci across the four lakes was 0．4186，suggesting a high genetic differentiation ，the analysis of molecular variance （AMOVA ）demonstrated that most variation occurred within populations （91．20%）；among populatiou （8．80%）The six populations are separated into three major clusters by principal coordinates analysis （PCA ）and cluster a-nalysis （UPGMA ）．Key Words ：Procambarus clarkii ；AFLP marker ；genetic diversity ；middle and lower reaches of the Yangtze River克氏原螯虾（Procambarus clarkii ）是入侵物种的典型代表，这与其r －型繁殖、成熟早、繁殖力高、生境适应性广、生命周期短及生态可塑性大［1］等生物学特征有关。

近几年，克氏原螯虾已经成为长江中下游一种非常重要的渔业资源。

然而，虾病、过度捕捞、栖息地破坏和污染等因素极大地影响该虾在分布区域的资源量。

因此，为使克氏原螯虾资源得到持续性利用，分析其遗传多样性十分重要。

分子标记是分析群体遗传多样性的一种有效的工具［2］。

与其他分子标记相比，扩增片段长度多态第33卷第3期2011年9月南昌大学学报（工科版）Journal of Nanchang University （Engineering ＆Technology ）Vol．33No．3Sept．2011性（AFLP）具有侦测多态性强、稳定性和重复性较高等优点而被广泛地用于鱼类等水生动物遗传多样性分析［3－4］。

彭刚等［5］利用微卫星（SSR）对安徽巢湖、江苏洪泽湖和江西鄱阳湖3个克氏原螯虾野生群体遗传多样性进行分析，结果显示具有很高的遗传多样性；曹玲亮等［6］利用微卫星（SSR）对长江、淮河和新安江三大流域克氏原螯虾的群体遗传格局进行分析，结果显示其极强的杂合子缺失；Yue等［7］利用5个微卫星位点和mtDNA COI基因探讨了江苏南京和浙江桐乡克氏原螯虾群体的遗传结构；刘萍等［8］利用7个微卫星位点探讨了东部地区6个克氏原螯虾群体的遗传多样性及各群体间的亲缘关系。

本文使用AFLP技术，利用5个EcoRⅠ－MseⅠ引物［9］对长江中下游6个克氏原螯虾群体的遗传多样性状况及遗传结构进行调查，分析长江中下游主要湖泊克氏原螯虾的遗传多样性，为开展克氏原螯虾资源的合理利用和保护提供理论依据。

1材料与方法1．1材料来源克氏原螯虾样本于2009－07分别采自洪泽湖、鄱阳湖、洞庭湖、岳湖，其中鄱阳湖取鄱阳、瑞昌和南矶山3个群体，共6个群体。

每组群体样本数量为21 27尾。

每个样本取肌肉组织约15g左右，用95%的酒精保存带回实验室，置于－20ħ低温保存用于提取DNA。

基因组DNA提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver．3．0）、EcoRⅠ酶、Taq酶和T4DNA连接酶（宝生物工程公司）；MseⅠ酶（Biolabs公司）；亲和硅烷（Solarbio公司）；pBR322DNA/MspI Marker（天根生化科技公司）；接头引物（北京六合华大公司）。

1．2方法1．2．1基因组DNA的提取从虾的腹部取87 100mg的肌肉加入到冰浴预冷的Collection Tube中，基因组DNA的提取依照试剂盒说明书操作。

用紫外分光光度计测定DNA 纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，置－20ħ保存备用。

1．2．2酶切和酶接取基因组DNA（100ng/μl）4μl，加buffer溶液2．5μl（（NEB42μl+BSA（1000ng/μl）0．5μl），EcoRⅠ（20U/μl）1．0uL，MseⅠ（10U/μl）0．5μl，然后用去离子灭菌水补足20μl。

在37ħ中保温4 h后，75ħ水浴灭活15min，立即置于冰上2min后离心收集。

取上述DNA酶切产物10μl，加EcoRⅠ接头（5 pmol/μl）1μl，MseⅠ接头（50pmol/μl）1μl，10ˑT4连接酶buffer2．5μl，T4连接酶（400U/μl）1μl，用去离子灭菌水补足20μl，16ħ过夜（至少12h）。

1．2．3PCR预扩增和选择性扩增实验所用的接头、预扩增引物和选择性扩增引物序列，参照其他虾类的AFLP分析设计（见表1）。

表1AFLP分析所用的接头、预扩增和选择性扩增引物Tab．1Adaptor and primer sequencesused for AFLP analysisDNA酶连产物2μl，加10ˑPCR buffer（含Mg）溶液2．5μl，dNTP（2．5mM）2μl，EcoRⅠ+A （10μM）和MseⅠ+C（10μM）预扩增引物均为1μl，Taq酶（2．5U/μl）0．2μl，用去离子灭菌水补足20μl。

PCR反应条件：95ħ预变性2min；95ħ变性30s；56ħ退火30s，72ħ延伸1min，35个循环后，72ħ延伸5min；4ħ保存。

预扩增产物稀释20倍，20ħ保存。

取已稀释预扩增产物5μl，加2ˑMix混合液（包含Taq聚合酶、dNTP和反应buffer液）12．5μl，EcoRⅠ+ANN（10μM）选扩引物1μl，MseⅠ+CNN （10μM）选扩引物1μl，用去离子灭菌水补足25μl。

PCR反应条件：94ħ预变性5min；94ħ变性30s，65ħ（以后每循环降低1．5ħ）退火30s，72ħ延伸1min，进行12个循环，然后94ħ变性30s，56ħ退火30s，72ħ延伸60s，20个循环；72ħ延伸10 min；4ħ保存。

1．3数据分析对6个群体基因组池都表现出较高多态性的引物组合做好标记，用于群体的多态性分析。

人工统计5对引物的银染图，每个条带作为1个位点，有条带且清晰记为1，反之记为0。

构成AFLP表型0/1矩阵输入Popgen1．32软件，计算群体的多态位点比例（PPB）、Shannon多样性指数（Ho，在物种水平上·442·南昌大学学报（工科版）2011年为Hsp ，在群体水平上为Hpop）、Nei＇s遗传多样性指数（H）、平均每个位点的观察等位基因数（Na）、平均每个位点的有效等位基因数（Ne）、总的基因多样度（Nt ）、群体内基因多样度（Ns）、基因分化系数（Gst ）、基因流（Nm）、Nei＇s遗传距离（D）和遗传一致度（I），并据此用UPGMA方法进行聚类，分析各群体之间的遗传关系。