第十二章病毒的分子生物学详解

12.2.7 腺病毒作为基因治疗的载体
• 腺病毒用作基因治疗载体和疫苗研制有着广 阔的前景。腺病毒基因组的E1区和E3区可以 作为外源基因的插入区。E1区缺失的腺病毒 可克隆约4.7 kb的外源DNA，而E3区缺失的 腺病毒可以克隆约8 kb的外源DNA，一些特 定的腺病毒株已被用于人类疫苗的研制。
• 有些病毒常伴随一些特定肿瘤的发生， 但它们与肿瘤的关系还未得到确认.例如 在艾滋病病人中引发的Kaposi‘s肉瘤。
• 总之，大约15%的恶性肿瘤与病毒有关， 因此研究肿瘤的病毒病因具有十分重要 的意义。
12.1.5 病毒基因工程疫苗与病毒载体
• 基因工程疫苗是指用基因工程的方法， 表达病原微生物的一段基因序列，将表 达产物(多数是无毒性、无感染能力，但 具有较强的免疫原性)用作疫苗，例如正 在使用的大多数乙型肝炎疫苗就是基因 工程疫苗。
• 负链RNA病毒的基因组无mRNA的功能， 必须由复制出的互补RNA(cRNA)来发挥 mRNA的作用。
12.1.3 病毒对宿主细胞的影响
• 病毒只能在活细胞中存活，因此，病毒与宿主 细胞之间有着十分密切的关系。病毒利用宿主 细胞的细胞器、能量和酶等进行自身的复制， 并通过宿主细胞的蛋白表达系统来表达自身所 需的蛋白质，这些过程都将会对宿主细胞的形 态和功能产生重大的影响。
• 腺病毒致癌的分子机理是目前分子病毒 学的一个重要研究领域。
12.2.2 腺病毒的毒粒结构
• 完整的腺病毒颗粒其相对分子质量1.7×1081.85×108，沉降常数约560S，在 CsCl中的 密度为1.32～1.35g/cm3。腺病毒对热和酸稳 定，能在肠道中存活。腺病毒颗粒无包膜， 外边是蛋白外壳，中间为紧密的核心颗粒， 内含单一拷贝的双链DNA。
12.1.1 病毒基因组的结构
• 不同类型的病毒，其基因组有很大差 异。在核酸类型上，有DNA病毒(如腺 病毒)，有RNA病毒(如反转录病毒)， 但对每一种病毒来说，它只能含有一 种核酸。
• 从核酸结构上看，有的是单链核酸，有 的是双链核酸，有的是线状，有的是环 状。
• 一些单链RNA病毒的基因组还具有不同 的极性，有的是正链RNA，有的是负链 RNA。
• 病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于 宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等， 以自我复制的方式进行繁殖。
• 病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。
• 正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出 子代RNA之外，还有mRNA的作用。作为翻 译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链， 然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白 等。
• 腺病毒(Aflenovirus)是一种典型的双链DNA 病毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例， 简要介绍DNA病毒的分子生物学。
12.2.1 腺病毒的发现
1953年，Rowe等人从外科手术摘除的儿 童腺体中分离到一种致病因子，可以使 培养的细胞发生慢性进行性病变，称之 为腺体退化因子，后来证明这种致病因 子是病毒，1956年，Enders等建议命名 为腺病毒。
• HIV的生活周期包括以下阶段：①吸附， • ②侵入和脱壳，③反转录，④整合，⑤病毒
RNA和蛋白质的合成，⑥装配，⑦释放， ⑧成熟。
12.4.3 病毒基因组的结构与功能
• 人免疫缺陷病毒属于反转录病毒科慢病 毒属，分HIV-1型和HIV-2型。
• HIV基因组两个相同的正链RNA每条链 均包含了HIV结构与功能所需的遗传信 息，两条RNA单链被核衣壳蛋白所包裹， 并通过其5′端非共价结合，形成二聚体。
12.3.3 HCV基因组的复制
12.4 反转录病毒的分子生物学
• 反转录病毒基因组是线形正链RNA, 正 链RNA没有mRNA活性，需要在自身的 反转录酶的作用下，将正链RNA反转录 成双链DNA，通过向宿主细胞基因组的 整合，在宿主细胞RNA聚合酶的作用下 转录出mRNA。
• 人类免疫缺陷病毒(HIV)是最典型也是最 重要的反转录病毒。以下简要介绍HIV 的分子生物学。
12.2.3 腺病毒的基因组结构
• 腺病毒基因组为线形双链 DNA，人类腺
病毒基因组包括早期基因 E1A、 E1B、 E2A、E2B、E3 和 E4以及晚期基因 L1、 L2、L3、L4 和 L5。
12.2.4 腺病毒的复制
12.2.5 腺病毒的基因转录
12.2.6 腺病毒与肿瘤
• 至今尚未发现腺病毒感染与任何人类肿 瘤的关系。但许多的人类腺病毒却可以 使啮齿动物的培养细胞发生转化或使这 些动物产生肿瘤。
• 腺病毒作为基因治疗载体有着以下几方 面的优点：
• (1)腺病毒基因组研究的比较清楚，便于 进行遗传操作。
• (2)其感染一般不引起明显的症状，与宿 主染色体整合的机率很低，作为基因治 疗的载体比较安全。
• (3)可以感染不同类型细胞，易于进行体 外培养，病毒感染细胞滴度高，可在细 胞内有效复制。
12.2 DNA病毒的分子生物学
• DNA病毒基因组有单链和双链两种结构， 并以线状或环状形式存在，大部分为单 一分子，也有的由数个片段的DNA分子 构成分段的基因组。
• 动物DNA病毒多为双链DNA基因组，腺病 毒、痘病毒、疱疹病毒都是双链线状DNA 基因组，末端有重复序列，经退火能形成环 形分子。
第十二章 病毒的分子生物学
12.1 病毒分子生物学研究的内容
• 病毒分子生物学是用现代分子生物学的 新理论、新技术和新方法对病毒基因组 的结构与功能，基因组的复制、表达和 调控，病毒与宿主的相互作用关系等进 行研究的一门学科。
• 人类对病毒的研究成果在现代分子生物 学的发展史上，做出了重大的贡献。许 多分子生物学上的重大突破都是以病毒 作为模式或研究材料而进行的。
• 病毒对宿主细胞的影响主要体现在病 毒对宿主细胞形态和结构的影响以及 病毒对宿主细胞功能的影响两个方面。
12.1.4 病毒与肿瘤发生
人类和动物肿瘤的形成除了与遗传和环境因 素相关外，某些DNA和RNA病毒也可以通过 不同的机制诱发恶性肿瘤。
有些病毒直接作用于细胞的基因组，使细胞 增殖，最终导致肿瘤形成；有些病毒则通过 抑制机体的免疫系统，诱导细胞恶性转变， 形成肿瘤。
• 腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、 鸟类和两栖类动物中都已分离到。
• 腺病毒科分两个属： 1、哺乳动物腺病毒属 (Mastadenovirus) 2、禽腺病毒属(Ariadenovirus)。
• 腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些 基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致 使细胞的功能失常。
• 常见的基因工程疫苗包括亚基疫苗和肽 疫苗两类。以流感疫苗为例，其途径就 是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗 原)的mRNA提取出来，再制备cDNA,克 隆到大肠杆菌中，高效表达该抗原。
• 由于基，它 必将成为传统疫苗的有效替代疫苗。
• 与真核细胞基因表达过程相对应的是，HIV 基因表达的调节表现为多级调控系统，存在 着多个调控点，可大体划分为转录水平的调 节、转录后水平的调节、翻译水平调节和翻 译后水平的调节，其中转录水平的调节，是 HIV调节基因表达的主要环节。
12.4.5 病毒基因转录后的调控
• HIV mRNA的加工和转运是在病毒基因产物和细胞 调节因子的协同作用下完成的。HIV可以通过它的 加帽位点和poly(A)信号完成mRNA的加帽和加尾 修饰；并利用其RNA基因组中存在的至少4个剪接 供体位点和6个剪接受体位点，产生30余种单剪接 或多剪接的产物。
• 一方面可以直接利用宿主细胞的调节机制， 另一方面又能编码自身的调节蛋白。
• 宿主细胞转录因子和病毒调节蛋白在病毒 RNA的转录、转录后加工、翻译和翻译后修 饰等各个环节中都能发挥重要的作用。
• 而宿主以及与HIV共感染的其他病毒，也 能借助于细胞因子和病毒基因产物来调节 病毒基因的表达。
• 由此形成了错综复杂的调节网络，可以精 细地调节病毒基因转录和翻译过程的启动、 关闭及其速率，按照既定程序完成病毒复 制的过程。
12.4.6 病毒基因的翻译和翻译后调节
• HIV可以通过控制其mRNA的稳定性以及mRNA 的翻译效率，在翻译水平上调节基因的表达；
• HIV的env、gag 和 pol 等基因中有一种顺式作用 元件(CRS)可以阻遏env、gag和pol等晚期基因表
• 在HIV基因组RNA的5′端具有帽子结构，3′端 有poly(A)尾巴，在反转录并整合后所形成的前病 毒cDNA的两端，为长末端重复序列(LTR)。LTR 具有启动子和增强子的双重功能。
• HIV基因组长约9.2 kb。能编码至少17种蛋
白质，除具有与其他反转录病毒相似的gag、
pot和env基因外，还可编码多种调节蛋白， 因此HIV又被称为复杂性反转录病毒。这 些基因的排列十分紧凑，部分区域有重叠， 除少数为断裂基因外，多数基因是连续的。
• Rev蛋白在HIV mRNA的加工过程中起着重要作 用。Rev是促进HIV基因表达由早期向晚期转换 的“开关”。
• Rev通过与 HIV mRNA中存在的 Rev 效应元件 (RRE)结合而行使功能。通过对mRNA剪切和转 运过程的调节，Rev使未剪接的gag-pol mRNA被 稳定地转运到细胞质并使它们得到翻译。
• 在HIV基因组中，有三个编码结构蛋白 和酶的基因，分别称为gag、pol和env， 其中gag与pol使用不同的阅读框架，并 有部分重叠。此外，还包括6个编码调节 蛋白的基因。
12.4.4 HIV基因转录的调节
• 在宿主体内，病毒基因的表达及调节是病毒与 细胞相互作用的集中体现。与那些简单的反转 录病毒相比，HIV具有更完善的表达调控系统。
12.3.1 HCV的发现
• 丙型肝炎病毒HCV(hepatitis C virus) 是 应用分子生物学技术对病毒进行研究的 成功实例。
12.3.2 HCV基因组的结构与功能