实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定共61页
植物溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握植物溶菌酶的提取方法。
2. 学习溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的活性测定方法。
4. 探讨植物溶菌酶在生物工程领域的应用前景。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于植物、动物和微生物中的胞壁质酶，具有降解细菌细胞壁的能力。
植物溶菌酶主要存在于植物细胞的液泡、细胞壁和细胞质中。
本实验通过提取植物细胞中的溶菌酶，对其分离纯化，并测定其活性，以期为植物溶菌酶在生物工程领域的应用提供实验依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片、提取液（pH 7.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，1% PVP）、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝R-250染色液、活性测定试剂盒等。
2. 实验仪器：高速离心机、低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计等。
四、实验方法1. 植物溶菌酶粗提取（1）取新鲜植物叶片，用去离子水冲洗干净，剪碎。
（2）将植物叶片与提取液以质量体积比1:10混合，室温下匀浆。
（3）将匀浆液于4℃下离心（12,000 r/min，30 min）。
（4）取上清液作为植物溶菌酶粗提液。
2. 植物溶菌酶分离纯化（1）取植物溶菌酶粗提液，加入一定量的硫酸铵溶液，使蛋白质盐析。
（2）将盐析后的溶液于4℃下离心（12,000 r/min，30 min）。
（3）取沉淀，用pH 7.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，进行SDS-PAGE电泳分析。
（4）根据电泳结果，选取目的蛋白所在位置，切取凝胶。
（5）将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，观察蛋白条带。
（6）根据蛋白条带，将目的蛋白进行洗脱、复溶于缓冲液。
3. 植物溶菌酶活性测定按照活性测定试剂盒说明书进行操作，测定植物溶菌酶的活性。
4. 植物溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）将分离纯化的植物溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）根据电泳结果，计算植物溶菌酶的纯度。
（3）根据电泳结果，结合标准蛋白分子量，计算植物溶菌酶的分子量。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
提取溶菌酶实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。
3. 培养实验操作技能，提高实验设计能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的酶，主要作用于细菌细胞壁的肽聚糖，将其分解，导致细菌细胞壁破裂，从而杀死细菌。
溶菌酶在医药、食品、生物工程等领域具有广泛的应用。
本实验采用鸡卵清为原料，通过提取、分离纯化等方法获得高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡卵清、NaCl、醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、硫酸铜、氢氧化钠、硫酸锌、硫酸镁、EDTA、SDS、考马斯亮蓝、磷酸缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统、磁力搅拌器、超声波破碎仪、低温冰箱、恒温培养箱、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡卵清，加入适量的磷酸缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀。
（2）将混合液置于磁力搅拌器上，搅拌30分钟，使溶菌酶充分释放。
（3）将混合液在低温下（4℃）离心10分钟，取上清液作为粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）将粗提液用硫酸铵进行盐析，使溶菌酶沉淀。
（2）将沉淀用磷酸缓冲液（pH 6.0）溶解，再次离心去除杂质。
（3）将上清液用硫酸铜、氢氧化钠、硫酸锌、硫酸镁、EDTA等试剂进行亲和层析，进一步纯化溶菌酶。
（4）收集纯化后的溶菌酶，用SDS-PAGE进行电泳分析，鉴定溶菌酶的纯度。
3. 溶菌酶活性测定（1）取一定量的溶菌酶溶液，加入等体积的底物溶液，混匀。
（2）在特定波长下，测定溶菌酶催化反应产生的吸光度变化。
（3）根据吸光度变化计算溶菌酶的活力。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）将纯化后的溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质条带。
（2）通过凝胶成像系统对电泳图谱进行分析，鉴定溶菌酶的纯度。
（3）根据蛋白质分子量标准曲线，计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取实验过程中，鸡卵清中的溶菌酶被充分释放，粗提液呈现出淡黄色。
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素 - + —Na 琼脂糖 —O—CH2—COO 葡聚糖
载体 电荷基团 反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
CH2CH3
载 -O-CH2CH2N-H Cl体
CH2CH3
Diethylaminoethyl (DEAE)
阴离子交换剂
5. 酶活力及比活性计算：
U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 US2*V2 US1*V1 S2比活力 S1比活力
回收率＝ 纯化倍数＝
×100％
42
7. 完成下表
样品 S1 S2 体积 ml V1＝ V2＝ 蛋 白 浓 度 总蛋白 mg/ml mg 活力 u/ml 比活力 u/mg 总活力 U 回收率 提 纯 倍 数 % 100 1
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000Fra bibliotek离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位
/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
溶菌酶实验报告溶菌酶综合型验报告(纯干货)
溶菌酶试验综合型实验报告目录第1章引言 (2)生化技术重要理论 (2)蛋白质提取分离技术 (2)第2章实验准备 (20)2.1引言 (20)2.2仪器及材料 (20)2.3方法 (20)第3章酶的提取 (22)3.1引言 (22)3.2内容及步骤 (23)第4章酶的纯化 (24)4.1引言 (24)4.2方法 (25)第5章酶活力、蛋白浓度测定 (26)5.1引言 (26)5.2仪器及试剂 (27)5.3方法： (27)5.4实验结果 (29)第6章酶促动力学（Km测定、酶的抑制） (30)6.1引言 (30)6.2仪器及试剂 (31)6.3方法 (31)6.4 结论 (32)第7章SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对分子量及纯度鉴定 (33)7.1引言 (33)7.2方法 (34)7.3 .结果 (35)7.4结论 (35)第1章引言生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物臵于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶菌酶纯化应用实验报告
一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 了解溶菌酶在不同应用中的活性变化。
3. 分析溶菌酶纯化过程中可能存在的问题及解决方案。
二、实验原理溶菌酶是一种天然存在的酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。
本实验通过提取、分离和纯化溶菌酶，探讨其在不同应用中的活性变化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝G250、pH缓冲液、蛋白质分子量标准品、DNA分子量标准品、蛋白质酶解底物等。
2. 实验仪器：高速离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、显微镜等。
四、实验方法1. 溶菌酶提取：取新鲜鸡蛋，分离蛋清，加入适量去离子水，搅拌均匀，过滤得到溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化：（1）盐析法：将溶菌酶粗提液加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，离心取沉淀，用少量去离子水溶解。
（2）离子交换层析法：将溶菌酶溶液上柱，用不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液。
（3）凝胶过滤层析法：将离子交换层析后的溶菌酶溶液上柱，用蛋白质分子量标准品进行对照，收集目标蛋白峰。
3. 溶菌酶活性测定：（1）酶活性测定：采用比色法测定溶菌酶的活性。
（2）溶菌酶在不同应用中的活性变化：将纯化后的溶菌酶分别应用于食品、医药、化妆品等领域，观察其活性变化。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶分离纯化结果：通过盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化溶菌酶，SDS-PAGE结果显示目标蛋白峰为单一蛋白。
2. 溶菌酶活性测定结果：纯化后的溶菌酶活性达到原粗提液的10倍以上。
3. 溶菌酶在不同应用中的活性变化：（1）食品：溶菌酶在食品中的应用效果显著，如发酵乳、肉制品等，可提高食品品质，延长保质期。
（2）医药：溶菌酶在医药领域的应用包括抗菌、消炎、促进伤口愈合等，具有良好疗效。
（3）化妆品：溶菌酶在化妆品中的应用有助于清洁皮肤，改善皮肤状况。
六、实验讨论1. 溶菌酶的提取、分离和纯化过程中，要注意避免蛋白质的降解和污染。
溶菌酶分离技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取和分离纯化方法。
2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。
3. 熟悉实验室基本操作，提高实验技能。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖结构，导致细胞壁破裂而使细菌死亡的作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，运用盐析、透析、凝胶过滤等方法对其进行分离纯化，并测定其酶活性。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 鸡蛋清- 盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、氯化钠、硫酸铜、氢氧化钠、乙醇、丙酮、乙醚等- 溶菌酶标准品- 酶活性测定试剂盒2. 仪器：- 电子天平- 恒温水浴锅- 离心机- 漏斗、滤纸、烧杯、量筒、移液管、滴定管等- 紫外分光光度计- 显微镜四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取新鲜鸡蛋清10g，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入10ml 0.1mol/L盐酸，调节pH至4.5。
（3）室温下搅拌30min，使溶菌酶充分溶解。
（4）加入10g硫酸铵，搅拌溶解，静置过夜。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取沉淀物，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入10ml 0.1mol/L氢氧化钠，调节pH至7.0。
（3）透析：将溶液置于透析袋中，放入500ml蒸馏水中，室温下透析过夜。
（4）凝胶过滤：将透析后的溶液上柱，柱材料为Sephadex G-25，洗脱液为0.05mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）。
（5）收集洗脱峰，用乙醇沉淀，室温下静置过夜。
（6）离心，收集沉淀物，加入适量蒸馏水溶解。
3. 溶菌酶酶活性测定按照酶活性测定试剂盒说明书进行操作，测定溶菌酶的酶活性。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）SDS-PAGE电泳：将分离纯化的溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳。
（2）凝胶成像分析：用凝胶成像仪观察电泳结果，计算溶菌酶的纯度。
（3）分子量测定：将溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白质marker的分子量计算溶菌酶的分子量。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定 PPT
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安 静
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如： 4000r/min。 •高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。
两者可换算或查测算图。
离心机的种类
离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
角式离心机和离心头（转子）
离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素
琼脂糖 —O—CH2—CO—ON- a+ 葡聚糖
载体 电荷基团
反离子
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原 件。
2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存
3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活
原理： 根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳
离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将 溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。 溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性 破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟） OD600值的下降评价酶活性。 溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下， OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。 280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶 浓度，用于酶比活的评价。
Hale Waihona Puke 背景知识：酶的提取、分离纯化
初步纯化（rough fractionation） （提取）：把酶从生 物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可 能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
溶菌酶实验报告
1. 学习溶菌酶的提取方法；2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术；3. 了解溶菌酶活性的测定方法；4. 熟悉实验操作及数据处理。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物细胞中的胞壁质酶，能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。
本实验通过提取、分离纯化溶菌酶，并测定其活性，以了解溶菌酶的性质和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 酶解缓冲液- 离心机- 超声波清洗器- 萤光分光光度计- 玻璃器皿2. 实验试剂：- 酶解缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0）- 氯化钠- 磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0）- 标准溶菌酶溶液- 破菌剂1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄，加入适量的酶解缓冲液，搅拌均匀； - 将混合液用超声波清洗器处理5分钟，使溶菌酶充分释放；- 将处理后的混合液离心（3000r/min，10分钟）；- 取上清液，即得溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将溶菌酶粗提液加入适量的氯化钠，使蛋白质沉淀；- 将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，调节pH至7.0；- 将溶液离心（3000r/min，10分钟）；- 取上清液，即为分离纯化的溶菌酶。
3. 溶菌酶活性的测定- 将分离纯化的溶菌酶溶液用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度；- 准备标准溶菌酶溶液，以确定溶菌酶活性；- 取一定量的稀释后的溶菌酶溶液，加入破菌剂，观察破菌效果； - 通过比较不同浓度溶菌酶溶液的破菌效果，计算溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 超声波处理后的混合液呈现乳白色，说明溶菌酶已充分释放； - 离心后，上清液中含有溶菌酶，下清液中含有蛋白质等杂质。
2. 溶菌酶的分离纯化- 加入氯化钠后，蛋白质沉淀；- 调节pH后，蛋白质溶解，溶菌酶得到纯化。
3. 溶菌酶活性的测定- 通过比较不同浓度溶菌酶溶液的破菌效果，得出溶菌酶活性为XX U/mg。
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定
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SDS-PAGE separates proteins by MW
47
蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关 系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数
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离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
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1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素
琼脂糖 —O—CH2—CO—ON- a+ 葡聚糖
载体 电荷基团
反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系
4.应用 制备纯化生物大分子
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梯度洗脱方式
28
图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线
29
（a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度
层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
30
层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
40
实验步骤： 1. 取6ml 菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。 2. 测定OD600并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释） 3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加 入）
比色皿
1
PBS缓冲液/ml
溶菌酶实验-实验报告-第七组
溶菌酶实验-实验报告-第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告
学院：生物科学与工程学院
班级：
姓名：
学号：
组别：第七组
组员：
一、实验内容：
溶菌酶的提取和系列性质测定
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理：
1蛋白质提取分离技术
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为。
溶菌酶综合型实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 学习并掌握酶活力、蛋白浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
4. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种天然存在的胞壁质酶，主要存在于鸡蛋清、蜂蜜、乳制品等天然食品中。
它能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，使细菌失去生存能力。
本实验通过提取、分离和纯化溶菌酶，并对溶菌酶进行活性、浓度、纯度和分子量的测定，以了解溶菌酶的性质和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 蛋白酶抑制剂- 离心机- pH计- 紫外分光光度计- 琼脂糖凝胶电泳仪- 紫外可见分光光度计2. 实验试剂：- Tris-HCl缓冲液- NaCl- 蛋白酶抑制剂- 标准溶菌酶溶液- 标准蛋白溶液四、实验步骤1. 溶菌酶的粗提取：- 称取适量鸡蛋清，加入适量的Tris-HCl缓冲液，搅拌均匀。
- 将混合液在4℃下离心，收集上清液。
- 加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶降解溶菌酶。
2. 溶菌酶的分离纯化：- 将粗提取液在pH 6.0下透析，去除小分子物质。
- 使用凝胶过滤层析，分离纯化溶菌酶。
- 收集洗脱峰，得到纯化后的溶菌酶。
3. 酶活力、蛋白浓度测定：- 使用紫外分光光度计测定溶菌酶的蛋白浓度。
- 采用双缩脲法测定溶菌酶的酶活力。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定：- 利用琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的溶菌酶。
- 通过比较标准蛋白分子量与溶菌酶的迁移率，确定溶菌酶的分子量。
- 使用SDS-PAGE电泳检测溶菌酶的纯度。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取：- 离心后，上清液呈淡黄色，表明溶菌酶存在于上清液中。
2. 溶菌酶的分离纯化：- 凝胶过滤层析后，收集洗脱峰，得到纯化后的溶菌酶。
3. 酶活力、蛋白浓度测定：- 溶菌酶的蛋白浓度为1.2 mg/mL。
- 酶活力为800 U/mL。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定：- 琼脂糖凝胶电泳结果显示，溶菌酶分子量为14 kDa。
实验五溶菌酶的分离与活性测定
5.丙酮沉淀
向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心2min (8000r/min) ，弃沉淀。量 取上清液体积后，缓缓加入冷丙酮，使丙酮终浓度达50 ％，混匀后立即离心10min (8000r/min)，弃上清液。
向此沉淀中加入5.0mL Tris pH8.8缓冲液，使沉淀 溶解，再离心5min (8000r/min)，将上清液倒入试管中， 记录体积、弃去沉淀。上清液即为部分纯化的碱性磷酸 酶液，此为D 液。 吸取D液0.1m1置于编号为DE 的试管中，供测酶活 性用。 吸取D液0.1m1置于编号为Dp的试管中，供测蛋白质 浓度。
其中碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠法测定， 即以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后产 生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安 替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌 衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从 而计算出酶的活性大小。
酶活性单位表示：在37℃下保温15分钟产 生1μg酶者为1个酶活性单位
(二)碱性磷酸酶的比活性测定
[原理] 比活性是指单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性 单位。因此，随着酶被逐步纯化，其比活性也随之逐 步升高，所以测定酶的比活性可以鉴定酶的纯化程度。
根据国际酶学委员会的规定，酶的比活性用每毫克 蛋白质具有的酶活性单位来表示。因此测定样品的比 活性必须测定： (1)每毫升样品中的蛋白质毫克数。 (2)每毫升样品中的酶活性单位数。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆 中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。 先用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制 备肝匀浆。 醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。 匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变 性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂 蛋白。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪绿药1501班 201530360127 同组者：连学帆韩家鑫实验地点：东配302 实验日期：2017年5月26日-5月27日报告完成日期：2017年5月28日指导老师：易喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
学习溶菌酶的提纯方法和酶活力的测定
3.实验原理
鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶（lysozyme），向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等电区，溶菌酶即可结晶析出。如结晶不纯，可重结晶。
溶菌酶之所以溶菌，是因为它能催化革兰氏阳性细菌细胞壁黏多糖水解。测定溶菌酶活力，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。
(4)组织修复
一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。
(5)促进血凝
实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。
(l)抗菌
溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。普遍认为,这种白细胞具有抗肿瘤作用和治疗由细菌、病毒引起的炎症。以上这种抗原—抗体反应也可以在体外进行溶菌反应,即血清学反应,可解析细菌表层结构和作为研究分子生物学的材料,通过它寻找新酶类,也可用做病毒性传染病的诊断。
溶菌酶的粗提取
溶菌酶的粗提取
一、实验目的与内容
目的：1. 掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；
2. 掌握测定蛋白质标准曲线的制作方法；
3. 能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。
内容：1. 从鸡蛋清中粗提取出溶菌酶；
2. 制作测定蛋白质的标准曲线。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
721型分光光度计、摇床、高速离心机
2. 实验材料和试剂：
200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管
鸡蛋1只、0.02 mol/L PBS( pH8.0),40%甘油
三、实验步骤
溶菌酶的粗提取（约两个半小时）
注：保存样品需明确标记名称、班级、组号、日期，最好使用标签纸。
四、实验注意事项
1. 等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；
2. 调节pH时要避免局部过酸；
3. 提取过程中尽量避免泡沫的产生。